一种通过经主动脉治疗正常巴马猪瓣下结构干预的外科方法

Summary

本研究提出了一种通过经主动脉法靶向组织切片，在正常巴拉猪中进行瓣下主动脉瓣结构干预的外科手术方法。

Abstract

瓣膜下结构异常导致左心室出流路（LVOT）改变和心肌肥厚，是结构性心脏病（如肥厚型心肌病（HCM）的典型解剖特征。本研究确立了一种通过经主动脉治疗方法在正常巴拉马猪中进行主动脉瓣下结构干预的手术方法。动物来自北京一家认证的实验猪供应商（许可证号SCXK（Jing）2018-0008）。该方法在三只健康雌性巴拉马迷你猪中得到了验证，它们年龄约为33-35周，手术时体重为30-35公斤。该手术包括正中胸骨切开和前主动脉壁切口，在心肺旁路（CPB）支持下进行，低温性心脏骤停，并直接观察LVOT和瓣下区域。通过靶向组织牵引、定位和切割来重塑瓣下结构。

完整的手术过程包括麻醉诱导、置入中心静脉导管和尿导管、手术部位消毒和包扎、正中胸骨切开、心包切开以及心脏动员。CPB通过左心房引流和逆行冠状动脉窦灌注建立。在前主动脉壁切口后，穿过主动脉瓣进入左心室，心脏骤停时进行瓣下组织介入。手术以主动脉闭合、心脏跳动恢复、CPB撤除及胸椎闭合结束。整个手术过程中，血流动力学稳定得以维持，动物体况良好，无手术中死亡。手术后，切口表面光滑，周围结构保持完整。

该方法展现出高重复性和手术可控性，为研究瓣下结构干预提供了稳定的手术干预模型。它还提供了一个技术平台，用于进行组织学分析、手术验证和干预策略评估。

Introduction

左心室瓣膜下结构的异常在多种心血管疾病中起着关键作用，尤其是在肥厚型心肌病（HCM）患者中，瓣膜下异常导致左心室出流路（LVOT）阻塞和室间隔肥厚^1。这些结构变化不仅影响心室充盈和射血，还可能导致严重并发症，如室性心律失常、猝死和慢性^心力衰竭。临床上，这类患者常采用经主动脉左心室组织手术切除，以缓解左心室组织梗阻并改善预后^。然而，只有少数研究系统性地探讨了该手术干预后的生理变化和心室重塑过程，限制了其在基础研究和转化治疗开发中的应用。

多种动物模型已被广泛用于研究瓣膜下结构变化及其干预策略。这些模型对分子和组织层面机制的理解做出了重要贡献;然而，它们在模拟临床心脏手术时存在明显局限，尤其是在实现左心室的精确暴露和针对性组织切断方面。解剖学扭曲、手术精度不足和组织采样有限等问题依然存在于^4,5,6,7。这些缺陷阻碍了此类模型在外科干预机制、术后结构干预和生物材料评估研究中的更广泛应用。

近年来，通过经主动脉方法模拟左心室瓣膜下结构干预的动物模型仍然极为有限。现有研究主要限于对现有手术技术的改进，尝试通过微创通路或基于能量的方法介入局部心室组织结构。然而，这些方法在手术通路、术中心脏疾病和组织干预策略方面与临床外科实践有显著差异，使得准确重现手术干预引起的结构性、血流动动力学、再灌注和机械应力反应变得困难 ^8,9.因此，本研究通过在正常巴拉马猪中进行胸骨正中切开和心肺旁路（CPB）支持下的前主动脉壁切口，建立了可重复的大型动物手术模型。该模型可直接暴露左心室出流路和瓣膜下区域，随后进行受控组织切割以促进瓣膜下结构干预，为未来研究提供临床相关基础。

具体来说，该模型旨在模拟肥厚型阻塞性心肌病（HOCM）患者临床经主动脉间隔肌切除术的手术路径和手术环境。它不旨在复述HOCM的病理生理或作为疾病模型，而是为了再现进行瓣下介入手术的手术条件。

该模型作为一个标准化的外科框架，用于研究瓣膜下结构干预、评估新型心脏手术器械，并为实验性心脏手术提供可重复的训练平台，包括经主动脉左心室外置暴露和受控瓣膜下切除的外科培训，以及在定义结构干预后进行的急性组织级和组织学研究。

Protocol

所有动物手术均由中国医学科学院复外医院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，批准号0106-1-20-ZX（X）-21。所有实验均按照ARRIVE指南和美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南进行。动物在标准环境条件下饲养（温度20-26°C，湿度40-60%，12小时明暗周期），并自由获取食物和水。

1. 实验动物制备

1. 从北京认证的实验猪供应商处获得正常成年的巴马迷你猪（许可证号SCXK（Jing）2018-0008）。
   注：该方法在三只健康雌性巴拉马迷你猪中得到了验证，年龄约为33-35周，手术时体重为30-35公斤。
2. 在手术前，动物至少在标准屏障环境中饲养7天以适应高原，环境受控温度（20-26°C）、湿度（40-60%），并保持12小时的明暗循环，并自由获取食物和水。
3. 手术前24小时进行全面健康评估，包括精神状态、食欲、粪便特征、皮肤完整性、步态和呼吸状况评估。
4. 术前应暂停进食12小时，水4小时，以降低麻醉期间吸入的风险。
5. 手术前完成体重测量和识别登记，并记录基线生命体征。
6. 手术当天，将动物转移到手术区进行静脉通路建立和麻醉诱导准备。

2. 术前准备

1. 耳静脉通路建立
   1. 麻醉诱导前，通过边缘耳心静脉建立静脉通路，具体如下：
      1. 对边缘耳静脉近端施加轻微压力，以便静脉填充。使用22-G静脉导管（22 GA× 1.00英寸;0.8 × 25毫米），沿血管远端向近端方向插入针头。
      2. 观察到血液回流后，拔出导管，将导管完全推进静脉。取下针芯，连接三通阀塞，并注入少量无菌生理盐水以确认通畅。
      3. 确认没有皮下膨出，输注顺利进行，然后用胶带固定止塞以稳定导管。
2. 麻醉
   注意：在进行任何侵入性手术以防止压力或疼痛前，请确认麻醉深度和反射丧失。
   1. 通过耳静脉注射1%丙泊酚溶液，剂量为2-4 mg/kg，诱导麻醉。一旦动物失去站立能力，意识下降并倒下，立即将其转移到手术台中央。
   2. 将动物置于仰卧状态，并用约束带将四肢固定在手术台两侧。在背部和颈部下方放置软垫以防止压迫性损伤。
   3. 确认昏迷后，静脉注射芬太尼（3-5 μg/kg）以缓解疼痛，随后给予阿曲库铵（0.2 mg/kg）以缓解肌肉松弛。
   4. 通过用喉镜暴露声门进行气管插管。将合适尺寸的带袖管管（推荐内径6.5-7.5毫米）插入气管内，并推进至胸腔段，以避免右侧颅支气管堵塞。
   5. 将管子连接到机械呼吸机。将呼吸机设定为10-12毫升/千克，呼吸频率12-16次/分钟，FiO₂ 100%，I：E比为1：2。确认双侧肺通气后再固定气管内导管。
   6. 手术期间使用持续静脉输注丙泊酚（6-10 mg/kg/h）维持麻醉。根据动物的生命体征调整芬太尼剂量。
   7. 持续监测心电图（ECG）、血压（BP）、血氧饱和度（SpO₂）和体温（体温）。
   8. 保持体温在37±0.5°C，以降低代谢需求，确保心肌在心肺旁路手术下得到保护。保持_{SpO 2}≥95%，并将血压保持在稳定的生理范围。
3. 外科手部准备
   1. 按照机构的规范进行标准的外科手部消毒。洗手后，使用无菌手术毛巾擦干手部，再戴上手套。
4. 导丝引导下的中心静脉导管
   注意：导尿过程中请严格采用无菌技术。小心使用针头和导线，以防止意外受伤。
   1. 选择正确的外颈静脉以供静脉通路。彻底消毒局部皮肤区域，然后皮下注射5毫升2%利多卡因以实现局部麻醉。
   2. 将穿刺针连接到注射器，并以20-30°的角度沿颈静脉向颅方向插入。
   3. 在持续吸气的同时缓慢推进针头，直到观察到静脉血回流。轻轻将导丝插入针内血管腔内。稳定导丝，小心地抽出针。将扩张器推进导丝以扩张穿刺道，然后取出扩张器。
   4. 将中央静脉导管插入导丝进入静脉。将导管推进约10-15厘米深，确保导管尖端位于颅腔静脉内，但不进入右心房，以避免干扰术中心脏阻塞。
   5. 拆掉导线。通过抽吸确认每个腔的通畅度。用肝素化生理盐水（50 IU/mL）冲洗每个腔，并用相同溶液锁住导管以保持通畅。
   6. 用无菌缝线固定导管。在穿刺部位涂上透明无菌敷料。清晰标注腔功能和导管插入深度。
5. 尿导管
   1. 麻醉诱导和定位后，使用浸有聚维酮碘溶液的无菌棉球消毒会阴区域，并让其自然干燥。在周围区域铺设无菌布，只露出尿道口。仅使用母猪以促进尿道导管插入。
   2. 在无菌条件下，打开导尿管套装。请戴无菌手套，润滑导管尖端，并轻柔地将其插入尿道。观察到尿流后，将导尿管再前移1-2厘米。将无菌蒸馏水注入导尿管球囊以固定其位置。轻轻牵引以确认固定。
   3. 将导管连接到封闭引流袋上。用胶带将管子固定在手术台尾部或侧面，以防止张力或污染。记录导尿管插入时间及手术细节。手术期间，持续监测尿量和引流通畅性。
6. 覆盖与无菌外科区的建立
   1. 再次按照临床标准进行手术手部消毒。干燥后，回到手术台。
   2. 与助理合作，布置手术区域。首先，放置小型无菌窗帘，并用毛巾夹固定。然后贴上中等大小的布帘，覆盖除手术区域外的全身。
   3. 确保暴露区域从胸骨握部延伸至剑突，长度约20-25厘米，宽约10-12厘米，包括胸骨中线和双侧肋缘。
   4. 披挂后，再次进行快速手部消毒。在护士的协助下，穿戴无菌手术服和手套。放置一块大型无菌布帘并设有窗户，确保只有切口部位暴露，其他区域则完全覆盖。将窗户对准切口中心，固定边缘以防止液体泄漏，从而完成无菌手术区的建立。

3. 心脏暴露与动员

1. 胸腔暴露
   注意：胸骨切开术时请保护操作者的手和眼睛。确保牵开器缓慢使用，以避免组织撕裂或骨折。
   1. 沿胸骨中线切口，从胸骨上切迹延伸至剑突下方约2厘米处，使用手术刀切开皮肤和皮下组织。切口长度保持约20厘米。
   2. 使用电灼设备将胸大肌和胸骨骨膜分离，完全暴露胸骨前表面。
   3. 在助手协助下，轻柔地拉开外侧组织，以保持手术区域清晰。
   4. 露出胸骨后，将Lebsche刀插入剑突下方，施加向上牵引。
   5. 用小锤子小心均匀地敲击勒布舍刀的近端，沿中线逐渐切开胸骨，然后向颅内切割直到胸腔打开。
   6. 在整个过程中保持持续向上牵引，以避免心包偏移或受伤。完成胸骨切开后，放置Finochietto肋骨牵开器，并缓慢双侧扩张胸腔以扩大手术区域。避免过度回缩以防止胸膜损伤或肋骨骨折。
2. 心脏动员
   1. 识别沿心包外侧表面运行的双侧膈神经的走向（图1A）。
   2. 切开心包上缘，并沿动物长轴延伸切口，保持靠近中线，以最大限度降低神经损伤风险（见图1B）。
   3. 双侧钝性清扫，将心包与纵隔胸膜及邻近结缔组织分离。
   4. 完成解剖后，在直接视觉下暴露心脏。确认明确识别关键解剖结构，包括主动脉、肺动脉、左心房附肢、心脏顶端和冠状窦。
3. 心肺旁路（CPB）的建立
   注意：确保所有CPB电路连接牢固且接地良好。小心使用电器和灌注设备，以防止泄漏或触电。
   1. 在达到足够的心脏暴露后，在左心房附肢底部放置一根细绳缝线。在缝线环内切开一个小切口，并沿左心房附肢轴斜向下插入静脉引流导管，建立心肺旁路的静脉回流通道。
   2. 将导管前移约3-4厘米，确保其尖端进入左心房腔。用丝线缝线将导管固定在心房附肢上，以防止滑脱或渗漏。
   3. 在冠状窦入口处放置一根包绳缝线。在缝线环内开一个小切口，插入灌注导管，作为心脏停血和心肌灌注的入流通道。
   4. 将灌注导管推进约1-2厘米进入冠状窦。用丝线固定，确保位置稳定。
   5. 将所有导管连接到心肺旁路机。用800毫升乳酸林格氏液、1000毫升琥珀酰化明胶溶液和2毫升肝素混合物为电路做预备。彻底排气并进行压力测试以确认稳定性。
   6. 在整个过程中持续监测灌注参数和流量，并通过全身肝素化保持活化凝血时间（ACT）超过480秒。
   7. 启动静脉回流泵，启动部分静脉引流。逐渐打开动脉泵，保持灌注压力在60-80 mmHg。确认无漏气且回路畅通前，再进行全心肺旁路。
   8. 达到稳定的CPB后，通过冠状窦缓慢输注冷却的高钾心肌瘫痪溶液。观察心肌收缩逐渐减弱，直到完全心脏骤停，心电图（ECG）显示平线。记录心脏骤停的时间。
   9. 确保在启动瓣下介入前，实现完全机电停滞和足够的心肌冷却。确认无心室收缩和稳定停止状态后，开始组织操作。
   10. 该方案中，给定单剂量心脏麻痹剂，足以在整个瓣下干预期间维持心肌停止。由于主动脉交叉夹的持续时间相对较短（约30-40分钟），通常不需要重新剂量。
   11. 在心脏表面涂抹预先准备好的碎冰盐水，进一步降低心肌温度，降低代谢需求，增强心肌保护。

4. 左心室暴露及主动脉通路的瓣下结构干预

注意：主动脉切口和组织切割时请谨慎使用锋利器械和剪刀。避免过度抓地，以免损坏周围结构。

1. 实现心肌停搏和低温保护后，在升主动脉前壁上切开约1.0-1.5厘米长的横切口，位于主动脉瓣环上方约1.5-2.0厘米，垂直于主动脉长轴。
2. 分别从左背侧和腹侧插入两个弯曲的片钩进入主动脉切口。轻柔地向外侧拉开切口，打开主动脉根并扩展手术区域（见图2A）。
3. 在手术区域引入带有预装牵引缝线的针架。将缝线放置在靶的瓣膜下组织上，以便术中牵引和精准定位。
4. 沿主动脉轴向左心室腔推进小弯剪刀。使用牵引缝线暴露目标瓣膜下区域（图2A）。
5. 在直接可视化下，将剪刀水平放置，并以受控方式切割指定的瓣下结构（见图2B）。取出切除组织并交给助理。
6. 用无菌生理盐水彻底冲洗左心室腔和主动脉腔，去除残留组织碎片。
7. 用连续可吸收缝线闭合主动脉切口。从切口一端开始，依次将针穿过内膜和中介，使用均匀间距的缝线，以确保完全防水闭合。缝合完成后，再次用无菌生理盐水冲洗闭合部位的外表面以清洁该区域。

5. 心肺复苏与心肺旁路逐步脱离

注意：恢复循环前，请确认心腔和灌注管的完全脱风，以防止空气栓塞。

1. 主动脉闭合完成后，逐渐降低冠状窦灌注速率并停止心肌休眠输注。同时，逐步降低心肺旁路泵流量，以便逐步恢复自发性心电活动。
2. 持续使用心电图（ECG）监测心律，以检测窦性心律的恢复或是否有心律失常。
3. 成功断开CPB后，通过施用蛋白胨中和循环肝素，恢复正常凝血功能，逆转全身肝素化。
4. 如果几分钟内没有发生自发性心跳复动，应直接将除颤器电极放在心脏表面进行除颤。施加一次低能量电击，必要时重复，直到有组织的电活动恢复。
5. 恢复正常心电图波形后，评估心尖冲动、冠状动脉搏动及整体心肌收缩力。
6. 一旦心律稳定且收缩强度满意，依次拔除冠状窦灌注导管和左心房引流导管。用缝线封闭每个插管部位以实现止血。
7. 断开CPB系统。记录CPB总持续时间、主动脉交叉夹闭时间及心脏复苏时间。
8. 用无菌生理盐水彻底冲洗心包腔，并抽取残留液体或血栓。
9. 在胸骨闭合前，在心包腔内放置两根闭合引流管，分别位于心脏两侧。将引流管通过肋间空间外部连接，并连接到外部引流瓶。
10. 用四根不锈钢线断断缝合胸骨。随后，进行胸壁的常规分层闭合。

Results

该手术方案能够稳定暴露并控制左心室内的瓣膜下结构切除。手术过程中，主动脉切口位置准确，通过主动脉口进入，清晰可见左心室出流路及相关瓣下区域。外科医生通过牵引预置缝线定位切口区域，并在直接视线下使用小弯剪完成靶向的瓣下组织切除。术后检查显示切口边缘整齐，周围组织结构完好，未发现明显撕裂或过度牵引痕迹。主动脉瓣结构得以保存，未见小叶损伤，且所有手术动物均未观察到反流（100%非反流率）。

主动脉切口闭合后，心脏灌注恢复，所有动物均观察到自发心跳复跳（恢复率100%），且窦性心律稳定。在心肺旁路顺利断奶后，动物在术中保持良好状态，未发生手术中死亡。切除部位通过细缝和温和电凝实现止血，确保术中血流动力学稳定且无显著出血。所有动物均幸存，术后观察期间体况良好，无明显并发症或不良事件。

手术总时间约为3小时，心肺旁路维持60-71分钟，以确保心肌保护充足和灌注稳定（见表1）。这些结果表明，这种基于临床相关经主动脉通路的手术方法，能够稳定地...

Discussion

左心室瓣膜下结构异常代表肥厚型心肌病（HCM）患者的关键解剖结构变化，导致心室顺应性受损、舒张压升高以及左心室出流道（LVOT）阻塞。这些结构异常构成了临床心功能障碍和不良结局的主要病理基础^10,11 。本研究建立了一种在正常巴拉马猪中通过经主动脉方法进行解剖暴露和针对LVOT及瓣下区域组织切片的手术方法，从而实现瓣下结构干预。与此前报道的动物模型相比，采用经顶端方法或能量消融技术处理左心室局部异常，本方法在操作流程、解剖通路和术中环境控制方面更能复制临床实践 ^8,9。该方法为瓣下干预研究提供了更高的结构保真度和程序可控性。

在心肌停滞和低温灌注下，通过前升主动脉切口进行胸中切开术，以访问LVOT。该方法能够精确暴露瓣下区域，并通过受控组织切割重塑局部解剖结构。该手术的成功依赖于几个...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% 氯化钠注射液	-	-	用于灌洗和溶液稀释
麻醉机	-	-	提供吸入麻醉剂和呼吸支持
麻醉药物（丙泊酚、芬太尼、阿曲库铵）	-	-	用于麻醉诱导和维持
主动脉钳	SINOVIEW	RT37008-25	用于牵拉主动脉以提高可视性
无损钳	SINOVIEW	FC22500-24	用于抓握组织同时最大限度地减少创伤
心脏停搏液（St. Thomas）	-	-	用于心脏骤停和保护
体外循环机及管路	-	-	用于维持体外循环期间的循环
中心静脉导管套件	-	-	建立中心静脉通路
气管插管套件和呼吸机	-	-	手术期间维持气道通畅
平钩钳	SINOVIEW	RT37000-00	用于胸腔内组织牵拉
通用钳	-	-	用于牵拉组织并暴露手术区域
止血钳	-	-	用于夹持血管或组织进行止血
肝素钠注射液	-	-	用于抗凝
静脉导管·不透射线22 GA × 1.00英寸	BD Angiocath	381123	用于建立静脉通路
显微手术器械篮	SINOVIEW	90X0003	用于存放和运输显微手术器械
微创弯剪	SINOVIEW	SC40230-25	用于微创手术进行弯曲切割
微创双关节剪	SINOVIEW	SC55001-29	用于在深手术区域进行精确切割
针持钳	-	-	用于缝合时持缝线针
手术刀柄和刀片	-	-	用于切开皮肤和组织
无菌手术布、缝线、手套、口罩	-	-	用于维持无菌手术场
精密器械灭菌盒	SINOVIEW	90X0401	用于清洁和灭菌手术器械
组织钳（齿状/无齿）	-	-	用于抓握组织
组织剪	SINOVIEW	SC35101-25SC	用于一般组织切割
三关节显微钳	SINOVIEW	FC17010-301	用于显微手术进行精细操作
超锐剪	SINOVIEW	SC35101-23UC	用于精确组织剥离
尿导管和引流袋	-	-	用于尿液引流和监测
生命体征监测器	-	-	监测心电图、血压、SpO2、体温