利用慢病毒载体高效制备携带超过10 kb外源基因的嵌合抗原受体（CAR）T细胞

摘要

本文介绍了一种利用慢病毒载体生成携带超过10 kb大尺寸转录单元的嵌合抗原受体（CAR）T细胞的优化工作流程。

摘要

将多种受体整合到嵌合抗原受体（CAR）T细胞中已成为一种有效的策略，可预防抗原阴性复发并降低靶向/脱瘤毒性。然而，多受体CAR T细胞的制备仍面临挑战，因为慢病毒转座子尺寸的增加会显著降低病毒滴度和T细胞转导效率。目前的生产流程通常依赖细胞分选技术，以从低产量产物中富集转导的T细胞。然而，细胞分选技术无法增加CAR T细胞的绝对数量，并且进一步增加了本已复杂的制造流程的复杂性。因此，这些限制因素阻碍了多受体CAR T细胞的临床转化，并制约了下一代免疫疗法的开发。

本文介绍了一种经过优化的详细分步生产流程，用于生成携带大型慢病毒转基因的CAR T细胞。利用该流程，我们在一系列不同大小的转基因中观察到转导效率随尺寸增加而提升，其中对于10.1 kb的慢病毒载体，转导效率最高提升了14.8倍。重要的是，该流程支持T细胞的高效扩增，并无需进行细胞分选。通过克服当前慢病毒基因转移中存在的尺寸限制，该流程实现了多受体CAR T细胞的高效制备，从而推动先进免疫疗法的开发。

引言

嵌合抗原受体（CAR）T细胞已彻底改变了免疫治疗领域。然而，尽管取得了显著成功，仍存在一些关键挑战，包括由肿瘤微环境（TME）介导的免疫抑制、抗原阴性肿瘤复发以及靶向/脱瘤毒性^1，2。通过多种合成受体（如双特异性CAR、CAR与TCR联合结构或细胞因子转换受体）对CAR T细胞进行工程化改造，有望克服这些障碍^3，4。在血液系统肿瘤中，为效应T细胞配备双CAR可同时靶向两种不同的抗原（如CD19和CD20）⁵，从而降低肿瘤抗原逃逸的风险。在实体瘤中，可通过引入例如合成Notch（synNotch）受体回路等方式减轻靶向/脱瘤毒性，该回路可实现逻辑门控的CAR表达并提高靶向精确性^{6，7，8，9，10，11，12，13}。然而，由于多个受体导致转基因尺寸增加，生产携带多种受体的CAR T细胞仍然面临挑战。目前，在研究和临床规模上生产CAR T细胞的金标准是来源于人类免疫缺陷病毒（HIV）1型的自失活第三代慢病毒载体¹⁴。为了生成CAR T细胞，慢病毒载体被设计为在长末端重复序列（LTR）之间插入定制的CAR表达盒，这些LTR序列介导其整合到T细胞基因组中。当前慢病毒载体的最大有效包装容量（EPC）约为9.2千碱基对（kb）（LTR至LTR），相当于HIV-1的天然基因组大小。由于慢病毒滴度随载体长度增加呈半对数下降¹⁵，构建包含多个受体的大尺寸转基因会显著降低慢病毒的生产产量，最终阻碍CAR T细胞的制备¹⁶。虽然可以使用细胞分选技术（如磁珠激活细胞分选或荧光激活细胞分选，即MACS或FACS）从低产量产物中富集CAR T细胞，但这些方法无法增加CAR T细胞的绝对数量，并且进一步增加了本已复杂的制造流程的复杂性。因此，携带大尺寸慢病毒转基因的CAR T细胞在制造上的挑战仍是临床前研究和临床应用的主要障碍。

我们近期建立了一种针对携带大型慢病毒转基因（如单载体 synNotch（svsNotch）系统¹⁷）的效应T细胞优化的CAR T细胞制备流程。本文以逐步操作方案的形式详细阐述该方法，以促进其广泛应用。作为概念验证，我们展示了在慢病毒转基因大小从5.7 kb至9.2 kb以及10.1 kb范围内，转导效率随尺寸增加而提升的效果。总体而言，该优化流程使转导效率最高提升了14.8倍，从而无需进行细胞分选，即可高效生成携带超过10 kb转基因的效应T细胞。

方案

人类T细胞由宾夕法尼亚大学人类免疫学核心实验室提供，该实验室遵循优良实验室规范原则，具备标准化的样本接收、处理、冻存和分析的标准操作程序或方案，符合MIATA及宾夕法尼亚大学伦理指南的要求。

注意：慢病毒和CAR T细胞生产的优化流程示意图见图1。关键优化步骤与当前标准流程的比较总结于表1。所有细胞培养均在37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中进行，使用T细胞培养基（TCM），其成分为RPMI-1640培养基，添加10%热灭活胎牛血清（FBS）、10 mM HEPES缓冲液、2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（见材料表）、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素。

图1：携带大基因片段的慢病毒及CAR T细胞制备的优化流程。 慢病毒制备（上）与CAR T细胞生成（下）的示意图，突出关键步骤及可提高病毒滴度和转导效率的优化环节。请点击此处查看该图的放大版本。

		标准流程	优化流程
病毒	病毒包膜	VSV-G	Cocal-G
	转染	L2000	L30001
	慢病毒收获	24 h2 + 48 h2	30–36 h3
T细胞	培养容器	T25培养瓶	96孔平底板
	表面积/体积比	可变	5.12 cm2/mL4
	佐剂	无	SF1085
1每1 µg DNA使用3 µL L3000，不更换培养基
2在圆底管中以106,800 × g离心2.5小时
3在锥形底管中以12,300 × g过夜离心
4转导后额外补充培养基
555 µg/mL

表1：标准流程与优化流程的比较。 改进流程相较于当前标准流程的关键优化。本表格经Rommel等人许可改编。¹⁷

1. 慢病毒生产

1. HEK293T 细胞的培养与维持
   1. 确保HEK293T细胞均匀分布，无团块，且融合度达到50-70%（典型产量：1.0-1.5 × 10⁷ 每T150培养瓶的细胞数。
   2. 吸弃上清液，从培养瓶上方加入20 mL室温（RT）PBS，避免冲散细胞，轻轻晃动使PBS覆盖细胞，然后吸弃洗涤液。
   3. 加入3 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，室温下左右轻摇培养瓶，孵育15–30秒。观察细胞脱落情况。
   4. 加入7 mL冷的TCM，将细胞从培养瓶底部吹打重悬，形成单细胞悬液，并转移至50 mL离心管中。用10–20 mL冷的TCM洗涤培养瓶，将洗涤液一并加入同一离心管中。
   5. 离心细胞（300 × g，5 分钟，4 °C），吸除上清液，加入 10 mL TCM 重悬细胞，计数细胞。
   6. 将HEK293T细胞以每T150培养瓶3 × 10⁶个细胞的密度接种⁶ 每2天传代一次（例如周一和周三），每瓶细胞数为1 × 10⁶ 每3天传代一次，每个培养瓶接种细胞，使用预热至37 °C的30 mL TCM（例如，周五接种以在周末进行传代）。
2. 用于慢病毒生产的HEK293T细胞转染
   注意：进行小规模预实验以确定接种密度，确保细胞在培养2天后融合度稳定达到70–80%。转染时，HEK293T细胞的融合度不得超过80%（见讨论部分）。转染实验采用低血清最低必需培养基及商用脂质体转染试剂（L3000 和 P3000，参见 材料表).
   1. 通过上述胰蛋白酶消化法收集 HEK293T 细胞，并接种 4 × 10⁶ 每T150培养瓶接种细胞，加入30 mL预热至37 °C的TCM。
   2. 2 天后，确认细胞培养物分布均匀，融合度达 70–80%。
   3. 将50 mL低血清最低必需培养基升温至室温。解冻慢病毒质粒，轻轻混匀后短暂离心。脉冲振荡脂质转染试剂，短暂离心后置于室温。
   4. 配制DNA预混液。每个培养瓶中依次加入：2 mL低血清最低必需培养基、39 µg慢病毒包装质粒（18 µg pTRP Gag-Pol、18 µg pTRP RSV-Rev、3 µg pTRP Cocal-G）、15 µg转移质粒以及108 µL P3000试剂（每微克DNA加2 µL P3000）。根据需要按比例放大，并将终体积至少增加10%，以补偿移液过程中的损耗。短暂涡旋振荡，快速离心，室温保存。
   5. 配制L3000预混液。每个培养瓶中按以下顺序加入：1.84 mL低血清最低必需培养基和162 µL L3000（每微克DNA使用3 µL L3000）。根据需要按比例放大，并将终体积至少增加10%，以补偿移液过程中的损耗。短暂涡旋振荡，快速离心，室温孵育5分钟。
   6. 5 分钟后，向每瓶对应的 DNA 主混合液中加入 2 mL L3000 主混合液，使总体积近似达到 1:2 的稀释比例。从离心管底部开始缓慢加入 L3000 混合液，避免接触管壁。用移液器充分混匀，并在室温下孵育 15 分钟。
   7. 同时，小心地从每份HEK293T细胞培养物中移除6 mL上清液，并标记每个培养瓶。
   8. 孵育15分钟后，将培养瓶向顶部倾斜，缓慢将4 mL转染混合物释放到培养瓶顶部的上清液中，避免冲起细胞。用移液器缓慢吹打两次，将培养瓶恢复至原来位置，轻轻摇匀，放回培养箱，并记录时间。
      注意：在收获慢病毒前，请勿干扰培养物。这与制造商建议的转染后用新鲜培养基替换含有L3000转染混合物的HEK293T上清液的操作相反¹⁸省略此步骤可保持更高的慢病毒滴度¹⁷.
3. 慢病毒上清液的收集、浓缩与冷冻
   注意：所有操作步骤中，慢病毒上清液均需置于冰上或4 °C保存，以防止降解。
   警告：慢病毒载体被归类为感染性材料。应遵循适当的生物安全防护措施，包括使用个人防护装备（如双层手套、一次性实验服）。所有工作表面须先用10%次氯酸钠溶液消毒，再用70%乙醇处理。所有被污染的耗材和液体废物在丢弃前须用10%次氯酸钠溶液消毒，并按照机构生物安全指南作为生物危害废物处置。
   1. 用10%次氯酸钠溶液清洁超速离心机设备（桶、锥形管和锥形适配器），然后用水冲洗。短暂晾干后，在组织培养罩内喷洒70%乙醇，再晾干。
   2. 将超速离心机及其转子预冷至 4 °C。
   3. 转染后30-36小时收集慢病毒上清液，转移至50 mL离心管中。通过离心（500 × g，5 分钟，4 °C），经 0.45 µm 孔径滤器过滤后，置于冰上保存。
   4. 将锥形适配器插入离心桶中，将过滤后的上清液转移至锥形超速离心管中，并装入离心桶。用冷的TCM平衡相对的离心桶，确保重量差异低于0.1 g。
   5. 通过超速离心在 12,300 × g 4 °C 下过夜
   6. 次日早晨，小心取出桶并将其置于冰上保存。
   7. 准备一个装有干冰的盒子用于冷冻，以及贴好标签的冻存管用于分装。
   8. 在组织培养罩内，打开每个桶，用镊子取出其中的超速离心管。对每根离心管按以下步骤操作：
   9. 小心吸出上清液，直至距离管底0.5英寸处，将剩余液体倾入6孔板中。轻轻敲击管壁，以去除部分残留液体。
   10. 加入300 µL冷的TCM，轻轻重悬30秒，将悬液转移至冻存管中。
   11. 用200 µL冷的TCM洗涤离心管，并将洗涤液加入同一冻存管中。
   12. 轻轻混匀后，分装60 µL用于慢病毒滴度测定（见步骤1.4），若干份100 µL用于CAR T细胞制备，并另留一管剩余体积作为备用。立即在干冰上速冻分装样品。转移分装样品至-80 °C长期保存。
4. 使用原代T细胞滴定浓缩的慢病毒
   注意：约 1 × 10⁵ 每个稀释度的慢病毒都需要 T 细胞。例如，6 种慢病毒，每种 8 个稀释度，需要：6 × 8 × 1 × 10⁵ = 4.8 × 10⁶ T细胞。应额外准备细胞以弥补移液过程中的损失。使用包被有抗CD3和抗CD28抗体的磁性激活珠刺激T细胞（见材料表）。
   1. T细胞活化（第0天）
      1. 前提：保持纯化的人CD4⁺ 和 CD8⁺ TCM 中的 T 细胞已准备就绪。
      2. 计数CD4⁺ 和 CD8⁺ T细胞并以1:1的比例混合。
      3. 按下述步骤洗涤活化磁珠：向离心管中加入1 mL TCM，涡旋振荡重悬磁珠，转移所需量以达到磁珠与T细胞3:1的比例。将离心管置于磁力架上，使磁珠沿管壁形成沉淀。静置30秒后，小心吸除上清液，将离心管从磁力架上取下，加入1 mL TCM重悬磁珠。重复洗涤两次。
      4. 将激活磁珠加入T细胞中，并调整终浓度至1 × 10⁶ 细胞/mL，使用预热至37 °C的TCM。
      5. 充分混匀后，将悬浮液转移至试剂储槽中。使用多通道移液器，每孔加入100 µL TCM，将细胞接种于96孔平底板中。每1-2分钟充分混匀一次，以防止磁珠沉降。
   2. T细胞转导（第1天）
      注意：对于携带较大转基因片段的慢病毒（例如，LTR-to-LTR 9 kb），需制备6个条件，采用1:2倍比稀释（未稀释、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32）。对于携带较小转基因片段的慢病毒（例如，LTR-to-LTR 7 kb），需制备8个条件，采用1:4倍比稀释。其余孔用作未转导（UTD）对照。
      1. 室温下解冻60 µL每种浓缩的慢病毒，并置于冰上保存。
      2. 在96孔圆底板中制备梯度稀释系列：将60 µL慢病毒加入最上一排孔中，随后在下方每排孔中加入30 µL冷TCM，从最上排转移30 µL至第二排并混匀（1:2稀释），再从第二排转移30 µL至第三排并混匀（1:4稀释）。依此类推，共制备六种条件（未稀释、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32）。稀释后立即用于转导实验。
      3. 在珠子刺激后23-26小时，使用多通道移液器将稀释板中的慢病毒以每孔25 µL加入T细胞中进行转导。向未转导对照孔中每孔加入25 µL TCM。
   3. T细胞培养（第3天）
      1. 使用多通道移液器，向每个孔中轻轻加入 125 µL 预热至 37 °C 的 TCM。
   4. T细胞去磁珠及流式细胞术分析（第5天）
      1. 为每种条件准备三组1.5 mL螺口离心管，并取下管盖。将三组中的两组放入磁力架中。
      2. 重悬各孔细胞，转移至第一组试管中，使磁珠沿管壁形成沉淀。30秒后，小心将上清液转移至第二组试管。静置30秒（此时磁珠应不可见），再将上清液转移至第三组试管，置于冰上保存。
      3. 对T细胞进行适当的转导标志物染色（例如，抗CD19 CAR或抗HER2 synNotch），使用相应抗体（参见 材料表并通过流式细胞术分析标志物表达。
      4. 确定转导率低于30%的条件，该范围大致对应于病毒体积与转导率之间的线性区间。
      5. 使用以下公式计算慢病毒滴度：
         滴度（TU/mL）=（初始T细胞数量 × 转导细胞百分比 × 稀释因子）/ 病毒体积（mL）
         例如，慢病毒原液按1:32稀释时，CAR表达率为20%：
         (100,000 个细胞 × 0.2 × 32) / (0.025 mL) = 2.56 × 10⁷ TU/mL

2. CAR T 细胞制备

注意：CAR T细胞制备的典型起始细胞数量为每组1-5 × 10⁶ 个T细胞。未转导（UTD）对照组的细胞数量应增加50%，因为该组还将用于后续实验中转导效率的标准化。整个扩增过程中预计可实现5-6次群体倍增。T细胞转导优化采用了嵌段共聚物作为增强剂（见材料表），并在96孔平底板中采用特定的表面积与体积培养比例¹⁷。

1. 100 mg/mL 增强剂储备液的制备
   1. 将 5 g 共聚物增强剂加入塑料瓶中，再加入 45 mL 超纯水。室温下搅拌过夜。
   2. 将溶液转移至量筒中，用超纯水定容至 50 mL。
   3. 用 0.22 µm 孔径滤器过滤溶液，并于 4 °C 保存。
2. T 细胞激活（第 0 天）
   1. 前提条件：准备好含纯化人 CD4⁺ 和 CD8⁺ T 细胞的 TCM 培养基。
   2. 计数 CD4⁺ 和 CD8⁺ T 细胞，并按 1:1 比例混合。
   3. 按以下步骤洗涤激活磁珠：
      1. 向离心管中加入 1 mL TCM，涡旋重悬磁珠，根据所需磁珠与 T 细胞 3:1 的比例加入适量磁珠。将离心管置于磁力架上，使磁珠沿管壁形成沉淀。
      2. 30 秒后，小心吸除上清液，将离心管从磁力架上取下，用 1 mL TCM 重悬磁珠。重复洗涤两次。
   4. 将激活磁珠加入 T 细胞中，用预热至 37 °C 的 TCM 调整最终细胞浓度至 1 × 10⁶ 个细胞/mL。
   5. 充分混匀后，将悬液转移至试剂储液槽中。使用多通道移液器将细胞以每孔 50 µL TCM 的量接种至 96 孔平底板中。每 1–2 分钟彻底混匀一次，防止磁珠沉降。
3. T 细胞转导（第 1 天）
   注意：根据前期滴定结果选择慢病毒用量，确保各组最终转导效率相近（通常为 20% 至 30%）。为避免多重慢病毒整合，最大转导效率应保持在 ≤ 30%。携带较大外源基因的慢病毒通常需要使用未稀释病毒或 1:4 至 1:8 的稀释度。调整分组规模以避免慢病毒剩余，因为每次冻融循环都会降低慢病毒滴度。慢病毒母液配制后应立即使用。
   1. 在室温下解冻所需量的浓缩慢病毒，并置于冰上保存。
   2. 在冷 TCM 中配制 2 mg/mL 的增强剂工作液，例如将 100 µL 增强剂（100 mg/mL 储备液）与 4.9 mL TCM 混合。
   3. 根据滴定结果配制慢病毒母液，并加入增强剂至终浓度为 275 µg/mL。总体积至少增加 10%，以补偿移液损失。例如，为实现 100 孔的 1:16 稀释：
      总体积：100 孔 × 每孔 12.5 µL 慢病毒 × 110% = 1,375 µL
      1:16 稀释：1,375 µL / 16 = 85.9 µL 慢病毒
      增强剂：189 µL（终浓度 275 µg/mL）
      最终母液：1,100 µL TCM + 85.9 µL 慢病毒 + 189 µL 增强剂 = 1,375 µL
   4. 在磁珠刺激后 23–26 小时，使用多通道移液器向每孔加入 12.5 µL 慢病毒母液进行 T 细胞转导，使增强剂终浓度为 55 µg/mL。在未转导（UTD）对照孔中加入 12.5 µL TCM。
4. T 细胞喂养（第 3 天）
   1. 使用多通道移液器向每孔轻柔加入预热至 37 °C 的 125 µL TCM。
5. T 细胞去磁珠（第 5 天）
   注意：为每份培养物准备一个无菌储液槽和三组 50 mL 离心管。总洗涤体积应限制在 T 细胞培养物体积的 ≤ 20%，以避免细胞稀释至低于 8 × 10⁵ 个细胞/mL。
   1. 使用多通道移液器将每份培养物汇集至无菌储液槽中，用 TCM 洗涤原培养板，并将洗涤液加入储液槽。将每份细胞悬液转移至第一组 50 mL 离心管中。
   2. 将离心管置于磁力架上，使磁珠沿管壁形成沉淀。30 秒后，小心将上清液转移至第二组离心管，并再次置于磁力架上。等待 30 秒（磁珠应不再可见），然后将上清液转移至第三组离心管，并置于培养箱中保存。
   3. 对每份培养物进行计数，并用预热至 37 °C 的 TCM 调整至 8 × 10⁵ 个细胞/mL。根据最终体积接种至合适的培养容器中（表 2）。
   4. 让 T 细胞静置 1 天，然后从第 7 天开始每日喂养（见下一步）。
6. T 细胞喂养（第 7 天及之后每日进行）
   注意：T 细胞大约每 24–36 小时倍增一次，在静止前经历 5–7 次群体倍增。使用基于电阻抗的细胞计数仪（见 材料表）监测 T 细胞体积，以确定最佳冻存时间点。
   1. 汇集每份培养物，充分混匀并计数细胞。
   2. 用预热至 37 °C 的 TCM 将每份培养物调整至 8 × 10⁵ 个细胞/mL，并重新接种至合适的培养容器中（表 2）。
   3. 继续扩增，直至平均细胞体积降至 320 µm³ 以下，然后进入冻存步骤。
7. 使用流式细胞术验证 T 细胞转导效率
   注意：可在第 5 天至冻存当天之间的任意时间点评估 T 细胞转导效率。随着扩增进行，表达水平会逐渐下降，因此早期检测可确保在流式细胞术分析中清晰区分阴性和阳性细胞群。
   1. 从每份培养物中收获 2 × 10⁵ 个 T 细胞。
   2. 使用相应抗体（见 材料表）对 T 细胞进行转导标志物染色（如抗 CD19 CAR 或抗 HER2 synNotch），并通过流式细胞术分析标志物表达。
8. T 细胞冻存（通常在第 10–12 天进行）
   注意：为提高解冻后细胞活力，应在 T 细胞进入静止期前或刚进入静止期时进行冻存。平均体积 320 µm³ 可作为冻存的临界值。一旦细胞体积低于 300 µm³，T 细胞停止分裂，总数量开始下降。确保所有组在冻存时具有可比的细胞体积，某些组可能需要额外培养一天。使用适当的冻存容器（如无酒精细胞冻存盒，见 材料表）以 -1 °C/分钟的恒定速率冷冻细胞。
   1. 将每份培养物汇集至适当规格的离心管中（如 500 mL），计数细胞并置于培养箱中保存。
   2. 计算细胞总数及所需分装量。
   3. 离心细胞（300 × g，10 分钟，4 °C），吸除上清液，用冻存液重悬每份培养物至 2 × 10⁷ 个细胞/mL（冻存液含 50% 无血清培养基、40% 热灭活 FBS 和 10% 二甲基亚砜（DMSO））（见 材料表）。
   4. 将细胞分装至冻存管中（每管 250 µL 至 1 mL，对应每管 5–20 × 10⁶ 个细胞）。将冻存管放入细胞冻存盒中，于 -80 °C 过夜保存。
   5. 将冻存管转移至液氮中进行长期保存。
9. T 细胞解冻
   注意：对于每组 T 细胞，准备一支含 50 mL 预热至 37 °C 的 TCM 的离心管，用于解冻后稀释冻存液中的 DMSO。另准备预热的 TCM 用于后续接种。
   1. 在 37 °C 水浴或流动温水中快速解冻冻存管。
   2. 一旦液体可见，立即转移至细胞培养超净台，加入 500 µL 预热的 TCM，轻柔混匀，然后将细胞转移至含 50 mL TCM 的预装离心管中。
   3. 用 500 µL TCM 洗涤冻存管，并将洗涤液加入同一离心管中。
   4. 在室温下孵育 10 分钟。
   5. 离心细胞（300 × g，10 分钟，室温），吸除上清液，并将细胞重悬至 4 × 10⁶ 个细胞/mL。
   6. 将细胞接种至合适的培养容器中（表 2）。
   7. 在培养箱中静置过夜，再进行后续实验。

容器	最小体积	最大体积
96孔板	0.1 mL/孔*	0.25 mL/孔
48孔板	0.2 mL/孔	1 mL/孔
24孔板	0.5 mL/孔	2 mL/孔
12孔板	1 mL/孔	4 mL/孔
6孔板	2 mL/孔	6 mL/孔
T25（水平放置）	3 mL	8 mL
T75（水平放置）	8 mL	20 mL
T150（水平放置）	20 mL	60 mL
* 培养体积暂时减少至 50 µL/孔，以增强T细胞转导效率

表2：CAR T细胞扩增推荐的培养基体积。 T细胞扩增过程中常用容器规格的培养基最小和最大使用体积。

结果

为了展示优化工作流程（图1）在多种转基因大小范围内所实现的改进效果，我们选择了三种慢病毒载体大小：5.7 kb（CD19 CAR）、9.2 kb（HER2-MSLN svsNotch）和 10.1 kb（HER2-MSLN-CBG svsNotch）（图2A）。慢病毒在标准条件或优化条件下进行制备（图2B：std 与 opt，以及 表1）。

对于最小的5.7 kb载体，在一个生产批次中仅观察到T细胞转导效率的适度提升（图2B：上方，使用未稀释病毒时为73% vs. 88%）。与此一致，慢病毒滴度仅略有增加，约为1.5倍（图2C：上方，2.86 × 10⁸ TU/mL vs. 4.35 × 10⁸ TU/mL）。相比之下，9.2 kb载体表现出显著改善的效果，最大T细胞转导率根据批次不同提高了约5.4倍或3.8倍（图2B：中图，使用未稀释病毒时为8.3%/16.6% vs. 45.1%/63.1%），功能滴度提高了约3.3倍（图2C：中图；3.1 × 10⁶ TU/mL vs. 10.1 × 10⁶ TU/mL）。最显著的效果出现在10.1 kb载体上，转导率提高了约12.4倍或9.8倍（图2B：下方，使用未稀释病毒时为1.4%/1.5% vs. 17.3%/14.7%），功能滴度提升了约10倍（图2C：下方，0.24 × 10⁶ TU/mL vs. 2.41 × 10⁶ TU/mL）。

接下来，使用在标准或优化条件下产生的慢病毒载体，按照相应的实验流程对健康供体的T细胞进行转导（图3 和 表1）。为了比较转导效率，在每种实验流程中使用等量的慢病毒，并调整病毒剂量以使转导率保持在30%或以下，从而避免多重整合事件的发生。与使用标准条件及标准慢病毒生产方法转导的T细胞相比，5.7 kb载体的转导效率平均提高5.1倍，9.2 kb载体提高13.3倍，10.1 kb载体提高14.8倍（图3A 和 补充表1）。采用优化流程生成的部分T细胞培养物进一步扩增至静息状态（图3B、C）。群体倍增次数根据T细胞供体的不同介于5.3至6.7之间（图3B）。每日T细胞体积测量显示细胞碎片极少，表明扩增过程中无毒性迹象。在冷冻保存前，通过染色检测CAR/synNotch受体表达或测量mTag-BFP2¹⁹荧光来评估转导率（图3C 和 补充图1）。5.7 kb载体的转导率为31.2%（黑色；慢病毒稀释1:512），9.2 kb载体为29.8%（红色；慢病毒稀释1:16），10.1 kb载体为20.2%（蓝色；慢病毒稀释1:4）。有关所生成的svsNotch T细胞和CAR T细胞功能性能验证的更多功能数据见我们的配套研究¹⁷。重要的是，采用优化方案产生的效应T细胞在群体倍增次数和T细胞表型方面与标准流程生成的细胞相比无显著差异¹⁷。

图2：标准与优化工作流程下的慢病毒生产。 (A) 慢病毒载体的示意图及其对应的转基因大小¹⁷。顶部：由人延伸因子-1α（EF1α）启动子驱动表达的靶向CD19的嵌合抗原受体（CD19 CAR），总转基因大小约为5.7 kb。中间和底部：通过EF1α启动子驱动，利用2A自剪切肽（P2A）共表达HER2 synNotch受体与蓝色荧光报告蛋白（BFP2）（中间）或萤火虫绿色荧光素酶（CBG）（底部）。靶向间皮素（MSLN）的嵌合抗原受体（MSLN CAR）的表达由GAL4特异性的最小巨细胞病毒（CMV）启动子（GAL4-CMV）调控。HER2-MSLN svsNotch（中间）的总转基因大小约为9.2 kb，HER2-MSLN-CBG svsNotch（底部）约为10.1 kb。SIN = 自失活载体；LTR = 长末端重复序列。(B) 使用(A)中所述载体，在标准（std）和优化（opt）条件下产生的慢病毒进行系列稀释后对T细胞的转导效果。每种载体进行两次独立生产（圆形和三角形），每次生产包含两个批次，每个批次使用两名不同的T细胞供体。转导率在不同T细胞供体间取平均值。(C) (B)中所示的标准（std，空心圆）和优化（opt，实心圆）病毒生产的功能性滴度。数据来自两次独立的慢病毒生产，每次包含两个批次，每个批次使用两名不同的T细胞供体。所有误差线表示均值±标准差（SD）。统计学显著性采用双尾配对t检验计算。*p < 0.03，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。本图经Rommel等¹⁷许可改编。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：标准与优化工作流程下的CAR T细胞制备。 (A) 优化（opt）工作流程相较于标准（std）工作流程在T细胞转导率上的倍数提升（另见表S1）。数据来自两次或三次使用不同供体的独立T细胞扩增实验以及两次独立的慢病毒生产。(B) 采用优化工作流程生成的T细胞扩增群体的群体倍增数。对于每种载体，展示了来自不同健康供体（ND）的两次独立T细胞扩增，每次扩增均使用独立的慢病毒生产。(C) 流式细胞术图显示在第7天（10.1 kb）或第10天（5.7 kb和9.2 kb）扩增后的效应T细胞中CAR、BFP2和synNotch受体的表达情况（另见补充图1）。 所有误差线表示均值±标准差（SD）。统计学显著性通过双尾配对t检验计算。*p < 0.03，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。本图经许可改编自Rommel等人的研究¹⁷。 请点击此处查看此图的放大版本。

补充图1：评估CAR、synNotch受体和BFP2表达的设门策略，相关于图3C。代表性流式细胞术图显示用于确定扩增T细胞培养物中CAR、synNotch和BFP2表达的设门策略。请点击此处下载该文件。

补充表 1：不同 T 细胞扩增中的转导效率，与 图 3A 相关。 采用标准流程和优化流程生成的 T 细胞扩增的转导效率。本表格经许可改编自 Rommel 等人¹⁷。 请点击此处下载该文件。

讨论

本文介绍了一种逐步操作的实验方案，详细描述了用于高效生产携带大型慢病毒转基因（如 svsNotch T 细胞）的 CAR T 细胞的优化流程。该流程无需进行细胞分选，即可高效生成携带大型慢病毒转基因的效应 T 细胞。采用此方法，我们常规可制备出携带 9–10 kb 慢病毒转基因的效应 T 细胞，其最高转导效率可达 60–70%（9 kb）或 15–20%（10 kb）。

在排查病毒滴度低或转导效率低的问题时，应考虑几个关键因素。首先，HEK293T细胞的质量至关重要。HEK293T细胞应按照一致的传代周期进行培养，且培养密度绝不能超过50-70%的汇合度。根据我们的经验，若之前发生过过度生长的HEK293T细胞，即使其形态上已恢复正常，所产的慢病毒载体滴度仍会降低。我们常规使用传代次数超过30代的HEK293T细胞成功制备出高滴度的病毒载体，这表明只要细胞得到妥善维护，较高的传代次数是可以耐受的。除了细胞质量外，转染时HEK293T细胞的汇合度也是一个关键因素。我们发现，在高汇合度（90-100%）下转染HEK293T细胞会导致慢病毒滴度下降。

其次，必须严格遵守本方案中规定的操作时间、浓度和体积，因为许多步骤已在先前的研究中经过充分优化¹⁷。例如，共聚物增强剂（见材料表）的浓度已通过滴定确定，可在无明显毒性的情况下实现最大转导效率。虽然更高浓度可进一步提高转导率，但也会引起毒性并抑制T细胞扩增。类似地，在推荐的30–36小时窗口之外收集慢病毒上清液（如在24小时或48小时）时，相应的时间进程实验显示病毒滴度降低¹⁷。相比之下，严格维持1:1的CD4与CD8 T细胞比例并非必需，因为在使用CD4/CD8比例不同的总T细胞时，我们未观察到转导效率存在显著差异。然而，偏离该比例可能会影响扩增持续时间和群体倍增次数。因此，为保持实验间的一致性，我们通常维持1:1的CD4与CD8 T细胞比例。

未来的优化工作可着眼于其他策略 通过优化培养基配方或定制细胞因子方案等策略，可进一步提升T细胞对更大慢病毒转基因的转导效率。将该工作流程拓展至其他免疫细胞类型，如自然杀伤细胞和巨噬细胞，有望扩大其治疗应用范围。重要的是，该技术的临床转化 工作流程还有助于降低慢病毒修饰细胞治疗产品的生产成本。

本文提供的全面逐步操作方案为制备携带大型慢病毒转基因的CAR T细胞提供了实用参考，并为开发针对实体瘤和血液肿瘤的新型CAR T细胞奠定了基础。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗体 - 抗 CD19 CAR	Cytoart	200101	抗 CD19 CAR（独特型），AF647 标记，1:100
抗体 - 抗 HER2 synNotch	R&D Systems	FAB95471G	抗曲妥珠单抗（独特型），AF488 标记，1:80
漂白剂	Clorox	杀菌漂白剂
细胞冻存容器	Biocision	FTS30	无酒精型
离心机（大型）	Thermo Scientific	Legend XTR
离心机（小型）	Fisher Scientific	Sprout Plus
离心机（微型）	Eppendorf	5425
库尔特计数器	Beckman Coulter	Multisizer 4	基于电学阻抗的细胞计数仪，用于测定细胞数量和细胞体积
冻存管	Thermo Scientific	375418
二甲基亚砜（DMSO）	Cell Signaling Technology	12611P
磷酸盐缓冲液（无钙、无镁）	Gibco	14190-136
Dynabeads（CD3/CD28）	Gibco	40203D	用于T细胞刺激的激活磁珠
乙醇	Decon Laboratories	200 证明
胎牛血清（热灭活）	Avantor (VWR)	97068-091
流式细胞仪	BD	LSRFortessa (647177)
超低温冰箱（-80 °C）	Panasonic	MDFU76VA-PA
液氮冰箱	MVE HEco	1500-190
冰箱（4 °C）	Fisher Scientific	Isotemp
手套（丁腈）	Halyard	55082
GlutaMAX 补充剂	Gibco	35050-061	L-丙氨酰-L-谷氨酰胺
HEPES（1 M）	Gibco	15630-080
干冰	n.a.	n.a.
湿冰	n.a.	n.a.
冰桶	Fisher Scientific	07-210-108
实验服（一次性）	Kappler	PVS112WH-MD
慢病毒包装质粒	专有	n.a.	pTRP Gag-Pol, pTRP RSV-Rev, pTRP Cocal-G
慢病毒转移质粒	专有	n.a.	例如 pTRPE svsNotch
Lipofectamine 3000 转染试剂	Invitrogen	L3000015	商用脂质体转染试剂；包含 Lipofectamine 3000（L3000）及其增强试剂（P3000）
磁力架（大型）	Stemcell	EasySep 18103	适用于 5 mL/15 mL
磁力架（小型）	Invitrogen	DynaMag-2 12321D	适用于 1.5 mL 管
磁力搅拌子	Fisher Scientific	14-513-82	搅拌子套装
磁力搅拌平台	Thermo Scientific	S88857100
量筒（100 mL）	VWR	76019-316
超纯水（MQ 水）	Merck	Q-POD	超纯水；使用 Millipak 40 Express 终端过滤器，0.22 微米（MPGP04001）
多通道移液器	Fisher Scientific	见注释	30-300 µL： FBE1200300；5-50 µL： FBE1200050
Opti-MEM（含 L-谷氨酰胺，酚红）	Gibco	31985-070	低血清基础培养基，用于DNA转染
青霉素-链霉素（10,000 U/mL，10,000 µg/mL）	Gibco	15140-122
移液管	Fisherbrand	见注释	50 mL：13-678-11F；25 mL：13-678-11；10 mL：13-678-11E；5 mL：13-678-11D
吸液移液管	Falcon	357558	2 mL
单道移液器	Gilson	PIPETMAN P10/P20/P200/P1000
移液控制器	Hirschmann	Pipetus Z314951
移液器吸头	Thomas Scientific	见注释	1000 µL：1159M42；200 µL：1159M40；20 µL：1159M43；10 µL：1159M41
塑料储液瓶（500 mL）	Corning	430282
试剂储液槽	Celltreat	3054-2007
RPMI-1640（含 L-谷氨酰胺，酚红）	Gibco	11875-085
天平	Ohaus	Pioneer	最小精度要求为 0.1 g
Steriflip 滤器（0.45 µm）	Millipore	SE1M003M00
Synperonic F 108（SF108）	Sigma-Aldrich	07579-250G-F	用于增强T细胞转导的嵌段共聚物
细胞培养瓶 - T150	Corning	430825
细胞培养瓶 - T25	Corning	430639
细胞培养瓶 - T75	Corning	430641U
细胞培养超净台	Thermo Scientific	1300 系列 A2
细胞培养孵箱	Thermo Scientific	Heracell 150i
细胞培养板 - 6孔	Corning	3516
细胞培养板 - 96孔平底	Falcon	353072
细胞培养板 - 96孔圆底	Falcon	353077
胰蛋白酶-EDTA（0.05%）	Gibco	25300-054
离心管 - 1.5 mL 螺口	Sarstedt	72692005
离心管 - 15 mL	Falcon	352099
离心管 - 5 mL	MSP	62-1028-2
离心管 - 500 mL	Corning	431123
离心管 - 50 mL	Falcon	352098
超速离心机	Beckman Coulter	Optima XPN-100
带吊篮转子的超速离心机	Beckman Coulter	SW 32 Ti
超速离心管适配器（用于锥形管）	Seton Scientific	4230
超速离心管（锥形）	Seton Scientific	5067
涡旋振荡器	Fisher Scientific	02215414
水浴锅（37 °C）	Fisher Scientific	Isotemp 210	使用 Lab Amor Beads（Gibco）代替水
X-VIVO-15	Lonza	04-418Q	无血清培养基，用于T细胞冻存