一种改进的基于气溶胶的经气管博来霉素递送方法，用于建立可重复且微创的小鼠肺纤维化模型

摘要

在此，我们介绍一种通过气溶胶化博来霉素递送在小鼠中建立肺纤维化模型的实验方案 通过 气管。该优化方法能够在无需手术切口的情况下实现均匀、定量且精确的递送，从而提高博来霉素诱导纤维化的可重复性和可靠性。

摘要

肺纤维化的特点是肺实质内进行性沉积纤维化瘢痕组织，导致气体交换严重受损。该病变是多种慢性间质性肺疾病的基础，尤其是特发性肺纤维化，其预后极差。由于目前缺乏有效的治疗方法，可靠的动物小鼠模型对于阐明其潜在的病理机制以及评估新型抗纤维化干预措施至关重要。博来霉素诱导的肺纤维化模型仍是目前应用最广泛的实验模型。在小鼠中常用的给药途径包括静脉注射、腹腔注射、侵入性开放式气管滴注以及非侵入性气管滴注。然而，侵入性外科方法常引起继发性组织损伤，可能影响模型的可重复性和稳定性；而非侵入性气管滴注通常导致博来霉素在肺叶间分布不均，并存在窒息风险，从而降低可重复性并增加技术难度。为克服这些局限，本研究开发了一种改进的基于气溶胶的经气管递送方法，该方法操作简便、创伤极小、可重复性高，并通过显著减少动物痛苦而具有更高的伦理优势。通过使用小动物喉镜直接观察声门裂，将一种特制的雾化针插入气管，该针直径明显小于小鼠气管内径。在精确控制的压力下注入博来霉素溶液，产生细密的气溶胶，从而确保药物在肺实质内均匀且高效地分布。此外，通过将针头导向相应的支气管，可选择性地靶向左肺或右肺。该优化模型的剂量-效应关系已通过系统监测肺功能变化、组织病理学表现以及肺组织羟脯氨酸含量得到充分表征。这一改进的实验方案有望促进实验室间的标准化，最终加速新型抗纤维化治疗药物的开发与临床前验证。

引言

肺纤维化（Pulmonary Fibrosis, PF）是一组以进行性肺实质损伤和异常修复为特征的致死性疾病，其中特发性肺纤维化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF）占30%–40%，患者诊断时的中位年龄为65岁，超过80%的患者年龄大于60岁^1,2。随着全球老龄化加剧，IPF的发病率逐年上升，全球IPF年发病率为3–9/100,000，而根据美国一项针对65岁以上人群的研究，该人群的年发病率高达93.7/100,000^3,4。

肺纤维化最早建立的历史模型是博来霉素诱导模型，该模型在学术界广泛应用，是目前表征最充分、使用最广泛的动物模型⁵，能够重现特发性肺纤维化（IPF）及其他纤维化间质性肺疾病（ILDs）的多种特征，包括肺部炎症、上皮细胞损伤、成纤维细胞增殖以及细胞外基质（ECM）过度沉积⁶。此外，根据博来霉素给药剂量和频率的不同，该模型可模拟急性或慢性肺纤维化。已有报道显示，博来霉素暴露后5–7天内肺组织进入急性炎症期，随后约在第7天开始进入纤维化阶段。至第21天通常可观察到明显的纤维化重塑，从而使该模型能够以明确的时间顺序重现早期炎症反应和晚期纤维化病理过程⁷（图1A）。这使得研究人员能够系统研究从初始损伤到纤维化阶段的整个疾病进程，对于各阶段的药物开发和机制研究具有重要意义^8,9。

博来霉素建模途径多样，可通过局部或全身方式给药，包括经气管、鼻腔、静脉和腹腔途径。其中最常用的是经气管注射。其缺点在于需对小鼠进行手术切口，影响建模小鼠的存活率¹⁰。后续改进采用了留置针进行气管插管并实施滴注给药¹¹。然而，注射器推注的药物只能在肺内呈团块状分布，导致博来霉素在各个肺叶中分布不均，产生局部过密区域，影响小鼠模型的稳定性。此外，也曾使用雾化室雾化器 cartridge 进行博来霉素递送，但每只小鼠吸入的博来霉素气溶胶剂量难以精确量化，且单次诱导时间较长¹²。因此，开发了一种优化的基于气溶胶的经气管博来霉素递送方法，用于建立可重复且创伤最小的肺纤维化小鼠模型。该方法将博来霉素雾化，实现其在肺组织中的均匀分散与沉积，从而更真实地模拟肺部疾病的病理特征。期望该方法的出现能够加速研发出可彻底治愈肺纤维化的药物。

方案

所有动物实验均在机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的机构指南下进行。实验全程实施了适当的动物福利措施。选用6至8周龄、体重约25 g的雄性C57BL/6小鼠进行实验。材料表列出了本研究中使用的所有动物、试剂和设备及其商业来源。

1. 动物选择与适应性饲养

1. 在特定病原体阴性条件下饲养所有小鼠，保持12小时光照/12小时黑暗循环 随意摄取 食物和水的获取
2. 在启动基于气溶胶的模型前，将小鼠在设施中适应5-7天。

2. 博来霉素溶液的制备

警告：博来霉素是一种细胞毒性抗肿瘤药物。操作时须穿戴适当的个人防护装备，并在经认证的生物安全柜中进行所有步骤。

1. 使用无菌的 1 mL 注射器，吸取 3 mL 无菌 0.9% 氯化钠溶液，并将其注入含有 15 U 盐酸博来霉素的药瓶中。
2. 轻轻旋转药瓶，直至粉末完全溶解，得到浓度为 5 U/mL 的储备液。
3. 将储备液分装至无菌的 1.5 mL 微量离心管中。用无菌生理盐水稀释，配制浓度分别为 3.75 U/mL 和 2.5 U/mL 的工作液。
   注意：对于 25 g 的小鼠，这些浓度分别对应 7.5 U/kg 和 5 U/kg 的剂量。若小鼠体重不同，需相应调整浓度。
4. 工作液可在 4 °C 保存最多 1 周，或在 -80 °C 保存最多 1 个月。使用前解冻并恢复至室温。

3. 基于气溶胶的气管内博来霉素递送

1. 麻醉准备与给药
   1. 通过将 0.1 g 戊巴比妥钠粉末溶解于 10 mL 无菌生理盐水中，配制麻醉工作液。使用 0.22 μm 聚醚砜（PES）膜滤器过滤。将溶液在避光条件下于 4 °C 保存，并在配制后 3 天内使用。
   2. 使用带有 26 号针头的 1 mL 注射器，以 60 mg/kg 体重剂量经腹腔注射戊巴比妥钠溶液。若麻醉深度或持续时间不足，可根据动物反应在执业兽医指导下调整剂量。
   3. 注射后数分钟，用力夹捏脚趾以评估麻醉深度，并确认无回缩反射后，再进行后续操作。
2. 气溶胶递送装置的准备
   1. 准备气溶胶递送装置，确保雾化针、雾化注射器和剂量柱均齐全且无菌（图 1B）。
   2. 将气溶胶递送注射器浸入无菌生理盐水中，缓慢吸取液体并暂停 8 秒，然后迅速排出液体。重复此过程三次，以填充并冲洗系统。
   3. 最后一次排空后，用生理盐水重新填充注射器。安装雾化针，确保连接处充满生理盐水。
   4. 将组装好的针头浸入生理盐水中，再重复三次吸液-暂停-排液循环，以排除气泡。
      注意：为确认准备就绪，可在深色背景下排出生理盐水进行观察，确保快速喷出的液体在深色背景下形成扇形雾状。
3. 经气管气溶胶递送操作
   1. 用博来霉素工作液对气溶胶针进行预处理，吸取并排出三次，每次暂停 8 秒。
   2. 在 50 µL 剂量柱上方安装一个 25 µL 剂量柱以校准体积。吸取所需体积（50 µL），排出多余液体。
      注意：此剂量配置可最大限度减少人为误差，确保递送一致性。
   3. 将麻醉后的小鼠置于插管平台，钩住上门齿并用胶带固定四肢以保持稳定（图 1C）。
      注意：确认胸部有节律性起伏。若动物表现活跃，应追加麻醉剂量。
   4. 使用弯头镊子轻柔拉出舌头，插入小动物喉镜以暴露声门（图 1D）。
   5. 将雾化针垂直穿过声门，迅速递送博来霉素气溶胶（图 1E）。
      注意：应将针尖朝向目标肺叶倾斜以实现靶向递送。避免插入过深，以防造成损伤。雾化针尖端应靠近但不接触小鼠气管的分叉点（第一分叉处），以达到最佳建模效果。若针尖仅插入气管中段，气溶胶可能仅撞击气管壁，形成大液滴而被咳出或吞咽；若针尖过于接近气管分叉处，则存在损伤气管的风险。

4. 术后恢复

1. 将小鼠置于加热垫上以维持体温。持续观察小鼠，直至其从麻醉状态恢复（通常为1–2小时）。
2. 进行足趾夹捏以检查反射，确认小鼠存活。
3. 进行为期21天的每日临床监测，包括体重、活动水平、理毛行为及呼吸状况。
4. 当出现以下任一情况时，实施安乐死：(i) 与治疗前基线相比，体重下降>20%，或体重下降≥15%并伴有其他痛苦的临床体征；(ii) 静息状态下持续出现严重呼吸困难（费力或腹式呼吸、明显呼吸急促或呼吸过缓、鼻翼扇动或张口呼吸），无论是否伴有四肢发绀；(iii) 无法自主摄取食物或水、明显嗜睡或濒死状态（对操作无反应和/或翻正反射消失）；或 (iv) 严重脱水、低体温或其他经主管兽医判断为不可逆恶化的体征。达到上述人道终点时，应使用过量戊巴比妥钠（≥150 mg/kg，腹腔注射）实施安乐死，随后采用辅助物理方法（如颈椎脱位），以确保动物死亡并最大程度减轻疼痛与痛苦。

5. 末期肺功能测定与组织采集

1. 第21天，使用90 mg/kg的相同麻醉剂腹腔注射麻醉小鼠 用于诱导深度麻醉并抑制呼吸的溶液
2. 确认麻醉完全 通过 脚趾挤压。剪开皮肤并分离肌肉以暴露气管。
3. 在气管上做一个小的斜面切口，插入插管针，并用手术缝线固定。
4. 将小鼠转移至计算机控制的小动物肺功能呼吸机。启动机械通气，并确保无自主呼吸。使用呼吸机系统测量肺功能参数。
5. 用5-10 mL无菌生理盐水进行右心室灌注，直至肺组织呈苍白色。
6. 取出整个肺组织。将左肺置于中性缓冲甲醛溶液中固定24小时。
7. 将固定的肺组织包埋于石蜡中，切片，并进行H&E 染色、Masson 三色染色以及 COL1A1 和 α-SMA 的免疫组织化学染色。
8. 将右肺组织放入含珠子的2 mL匀浆管中。根据羟脯氨酸检测试剂盒的说明书加入适量水，进行匀浆处理，随后按试剂盒步骤完成检测。

结果

在本研究中，我们提出了一种基于气溶胶的支气管内递送方法，利用博来霉素在小鼠中诱导肺纤维化。在初步实验中，将绿色染料雾化后递送至不同小鼠的肺部。染料在肺组织中呈现斑点状分布模式，表明基于气溶胶的支气管内给药可使药物均匀分散至所有肺叶（图1F）。图1F所示的绿色墨水递送操作采用的程序与后续博来霉素给药所用程序相同。

在主要实验中，小鼠通过气雾吸入方式给予博来霉素，剂量为5 U/kg或7.5 U/kg体重，对照组小鼠则接受生理盐水作为假手术对照。在第21天，动物按照机构批准的方案实施安乐死，随后进行肺功能检测并采集肺组织，操作步骤如前所述（图1A）。组织病理学分析被视为评估肺纤维化的金标准，首先采用苏木精和伊红（H&E）染色进行。与生理盐水组相比，5 U/kg组小鼠表现出肺泡壁轻度增厚及局部纤维化病灶。相比之下，7.5 U/kg组则显示出明显的肺泡壁增厚、肺泡结构严重破坏、肺组织塌陷以及广泛的纤维化区域...

讨论

本研究提出了一种优化的非侵入性气管雾化博来霉素诱导小鼠肺纤维化模型。使用小型动物喉镜定位声门，并将一根微细雾化针插入小鼠气道，通过手动施加压力将药物雾化送入肺部，从而减轻了传统非侵入性注射中留置针引起的不适与窒息感^13,14。此外，这些气溶胶可在小鼠任意肺叶中以斑点状均匀分布。该模型在3R原则与实验稳定性之间实现了平衡，在不对小鼠造成额外伤害的同时，精确控制博来霉素的剂量与肺部分布，为肺纤维化的临床前药物研发提供了更为可靠的工具¹⁵。

该模型的优势在于能够实现气溶胶化博来霉素的快速、精确且可重复给药，同时避免了气管手术的复杂性。该方法可减少操作差异，最大限度地降低动物应激和创伤，支持符合伦理的动物实验实践¹⁶。与既往报道的雾化箱方法相比，该方法消除了因小鼠年龄和体重差异导致的博来霉素吸入剂量个体间变异¹²。此外，该模型经过实...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 μm 聚醚砜注射器滤器	Cytosci	CSTPE3320
1 mL 一次性注射器	BD	300481
1.5 mL 微量离心管	Servicebio	EP-150-M
2.0 mL 加强型裂解管	Servicebio	HT-200-M
4 °C 实验室冰箱	美菱	BCD-402WPCX
50 mL 锥形离心管	Servicebio	EP-5001-J
-80 °C 超低温冰箱	海尔生物医疗	DW-86L828J
无水乙醇	国药集团化学试剂有限公司	100092683
酸性分化液	Servicebio	G1039
小动物插管用气溶胶微喷器	上海玉研仪器有限公司	Yan-30012
基础外科器械套装	上海玉研仪器有限公司	YAN-21A3
盐酸博来霉素溶液	汉晖制药有限公司	H20055883
蓝化试剂	Servicebio	G1040
计算机控制小动物肺功能呼吸机	北京易迈康生物科技有限公司	FX-2
电工绝缘胶带	3M	1500
伊红Y染色液	珠海贝索生物技术有限公司	BA4022
绿色标记墨水	Pilot	Chiku-rin
苏木精染色液	Servicebio	G1004
羟脯氨酸定量检测试剂盒	Abcam	ab222941
层流罩	HDL	DL-CJ-1N
小动物手术用喉镜	深圳碧莱德生物科技有限公司	DXSHJ0
光学显微镜	Nikon	E100
低毒性脱蜡液	Servicebio	G1128
Masson三色染色试剂盒	珠海贝索生物技术有限公司	BA4079B
带吸光度检测功能的酶标仪	Agilent	Synergy H1
中性缓冲福尔马林	Servicebio	G1101-3ML
中性封片介质	国药集团化学试剂有限公司	10004160
重组兔单克隆抗COL1A1抗体	Huabio	HA722517
冷冻离心机	Eppendorf	5424R
无RNase水	Generalbiol	TYJC002
小动物气管插管平台	上海玉研仪器有限公司	CG-02M
无菌0.9%氯化钠溶液	中国大冢制药有限公司	H12020024
组织匀浆器	Servicebio	KZ-III
二甲苯	国药集团化学试剂有限公司	10023418
氧化锆研磨珠	Servicebio	G0203