本研究建立 体内 激光共聚焦成像作为一种实时追踪活体大鼠针灸诱导的形态动力学（如血管扩张和胶原重塑）的方法。通过荧光素钠标记，该技术可捕捉组织的即时与延迟响应，为定量评估包括针灸和艾灸在内的物理疗法提供了一种新工具。
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方法文章
* These authors contributed equally
本研究建立 体内 激光共聚焦成像作为一种实时追踪活体大鼠针灸诱导的形态动力学（如血管扩张和胶原重塑）的方法。通过荧光素钠标记，该技术可捕捉组织的即时与延迟响应，为定量评估包括针灸和艾灸在内的物理疗法提供了一种新工具。
实时动态监测针灸效应对于阐明其生物学机制至关重要，然而传统组织学方法无法捕捉活体微环境中瞬时发生的变化。本文建立了一种基于 在体 激光共聚焦成像，可实现对针灸干预后局部组织形态学变化的高分辨率、实时观察。在大鼠静脉注射荧光素钠后，于针灸过程中动态追踪微循环及细胞外基质（如胶原纤维排列）的变化。结果显示，该方法能够清晰区分针灸诱导的即时反应（如血管扩张）与延迟反应（如炎症反应），空间分辨率达0.5 µm，时间分辨率达3.5 fps。后续的定量分析可对形态学参数进行客观测量。本研究所述方案为针灸效应的可视化研究提供了一种有效工具 体内 针灸机制研究，并为评估其他物理刺激（如艾灸）的效果提供技术参考。
针灸作为传统医学的核心组成部分，通过复杂的组织层面反应发挥治疗作用1,2,3,4。然而，由于传统组织学仅能捕捉静态图像，难以揭示活体组织中形态适应性变化（如血管调节、细胞外基质重塑）的实时动态过程，其机制研究仍受到限制5。尽管活体显微成像技术具备动态成像潜力，但在针灸研究中的应用仍十分有限，尤其是在量化物理刺激引发的时空响应方面6,7。相比之下，本研究采用的共聚焦成像方法能够定量提取深层组织（如肌肉层及足三里/阳陵泉穴位 ST 36/GB 34）中的结构与动态参数——例如红细胞运动速度的变化率和胶原排列情况——克服了传统活体显微成像在空间分辨率、三维成像及长期追踪方面的局限性8。
激光共聚焦成像已成为一种强大的工具 体内 细胞分辨率下的可视化9,10,
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所有实验程序均经中国中医科学院针灸研究所动物伦理委员会批准（编号：D2023-01-29-01）。实验所用八只雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（8周龄，200–220 g）购自生物技术有限公司（许可证号：SCXK（京）2020-0001）。动物饲养于无菌隔离环境中，环境条件控制为：12小时光照-黑暗循环，21℃ ±± 2 °C温度下饲养，自由摄取标准颗粒饲料和水。所有实验均符合机构指南和《实验动物护理与使用指南》。
注意：主要操作流程的示意图见图1。
1. 动物与示踪剂的准备：荧光素钠（FS）
2. FS的注射
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本方案展示了pCLE在实时动态评估针灸对微循环和细胞外基质结构影响方面的应用价值。通过尾静脉注射荧光素钠后，观察局部毛细血管内红细胞流速的变化以及胶原纤维排列的重组情况，以评估相关改变。
针刺后5分钟的代表性结果显示红细胞运动加快（P < 0.05，t检验）（图2A），胶原纤维重新排列为有序的束状结构（图2B、C）。针刺引起的局部血流动力学加速和间质渗透压变化导致纤维束分离，表现为成像中纤维间间隙增宽及亮区范围增加。我们还注意到，针刺后毛细血管通透性升高可能导致局部荧光素渗漏，这可能部分解释了观察到的信号增强现象。该机制进一步支持了针刺在促进微循环动态变化中的作用。
尽管可以.......
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如结果所示，本研究建立的体内共聚焦成像方案利用常规商用设备和标准荧光标记方法，能够在针灸干预过程中同步定量分析微循环和细胞外基质的动态变化。该方案的成功依赖于两个关键步骤：精确控制荧光素钠的注射时机，以确保微血管对比度持续稳定14；以及严格固定实验动物，这对纵向追踪胶原纤维至关重要。
为解决技术难题，实施了针对性优化：在探头与组织界面处添加37 °C的生理盐水液滴，消除了初期实验中出现的信号丢失现象；同时，保持电针位点与探头之间大于>3 mm的距离，减少了振动伪影。这些改进显著提高了数据的可重复性。
尽管本方案可实现 0.5 µm 分辨率的实时观测，但仍存在局限性：成像深度受限（有效范围 ≤200 µm，不足以穿透深层组织）。未来的改进可考虑整合双光子成像模块以增强深度穿透能力，或应用 体内 光学透明化技术15,16.<.......
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作者无任何利益冲突需要披露。
本研究由国家重点研发计划（2024YFA1209900、2024YFA1209903、2024YFA1209904）；国家自然科学基金专项基金（82050006）；湖北省中医药管理局中医药研究项目（ZY2025Z015）；江汉大学科研基金（2024JCYJ13）资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 寸针灸针 | Hwato, 苏州, 中国 | N/A | 13 mm/0.25 mm |
| 10% 荧光素钠 | 广西梧州制药有限公司, 中国 | H45021477 | |
| 动物麻醉机 | RWD, 深圳, 中国 | R620IE | |
| 体温监测仪 | RWD, 深圳, 中国 | 69026 | |
| 电针仪 | Hwato, 苏州, 中国 | SDZ-III | |
| 脱毛膏 | Veet, 法国 | ||
| ImageJ | 美国国立卫生研究院, 美国 | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| 活体探头共聚焦激光内窥显微镜 | Optiscan, 澳大利亚 | ViewnVivoB30 | 直径：4 mm 手持式刚性探头，抗弯曲，长期使用仍保持结构完整性。长度：≥46 mm。扫描模式：具备变焦扫描功能。 |
| 异氟烷 | RWD, 深圳, 中国 | R510-22-16 | |
| 氨基甲酸乙酯 | Sigma-Aldrich, 美国 | 94300 |
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