通过实时监测针灸诱导的皮下结缔组织动态变化 体内 激光共聚焦成像

摘要

本研究建立 体内 激光共聚焦成像作为一种实时追踪活体大鼠针灸诱导的形态动力学（如血管扩张和胶原重塑）的方法。通过荧光素钠标记，该技术可捕捉组织的即时与延迟响应，为定量评估包括针灸和艾灸在内的物理疗法提供了一种新工具。

摘要

实时动态监测针灸效应对于阐明其生物学机制至关重要，然而传统组织学方法无法捕捉活体微环境中瞬时发生的变化。本文建立了一种基于 在体 激光共聚焦成像，可实现对针灸干预后局部组织形态学变化的高分辨率、实时观察。在大鼠静脉注射荧光素钠后，于针灸过程中动态追踪微循环及细胞外基质（如胶原纤维排列）的变化。结果显示，该方法能够清晰区分针灸诱导的即时反应（如血管扩张）与延迟反应（如炎症反应），空间分辨率达0.5 µm，时间分辨率达3.5 fps。后续的定量分析可对形态学参数进行客观测量。本研究所述方案为针灸效应的可视化研究提供了一种有效工具 体内 针灸机制研究，并为评估其他物理刺激（如艾灸）的效果提供技术参考。

引言

针灸作为传统医学的核心组成部分，通过复杂的组织层面反应发挥治疗作用^1,2,3,4。然而，由于传统组织学仅能捕捉静态图像，难以揭示活体组织中形态适应性变化（如血管调节、细胞外基质重塑）的实时动态过程，其机制研究仍受到限制⁵。尽管活体显微成像技术具备动态成像潜力，但在针灸研究中的应用仍十分有限，尤其是在量化物理刺激引发的时空响应方面^6,7。相比之下，本研究采用的共聚焦成像方法能够定量提取深层组织（如肌肉层及足三里/阳陵泉穴位 ST 36/GB 34）中的结构与动态参数——例如红细胞运动速度的变化率和胶原排列情况——克服了传统活体显微成像在空间分辨率、三维成像及长期追踪方面的局限性⁸。

激光共聚焦成像已成为一种强大的工具 体内 细胞分辨率下的可视化^{9,10,11,12,13}然而，现有研究主要集中在浅表组织（如皮肤或角膜），极少涉及深部针灸靶点，也缺乏定量形态学分析的整合。尤为关键的是，据我们所知，目前尚无标准化的方法可用于关联针灸操作与活体组织的动力学变化。

在此，我们建立了一种基于共聚焦成像的方法学平台，用于实时追踪针灸诱导的形态学事件，从而填补这一空白。通过静脉注射1%浓度、0.1 mL/100 g体重的荧光素钠作为对比剂，我们实现了对微循环和基质变化的高分辨率监测（空间分辨率为0.5 µm，时间分辨率为3.5 fps），观测视野为450 µm × 450 µm，深度可达400 µm，能够捕捉从针灸刺激期间即刻发生的血管扩张到延迟性炎症级联反应的全过程。该方法还可实现胶原纤维重排的三维重建与参数量化，克服了终点组织学分析的局限性。

实施本方案的实际考虑因素包括：（i）推荐的硬件应包含分辨率≥0.5 µm、采集速率≥3 fps的共聚焦成像系统；（ii）常见的限制因素包括连续成像超过90秒后出现的光漂白现象，以及对呼吸或组织运动的敏感性；（iii）在高度致密或强散射的组织中，成像深度穿透能力可能降低。据我们所知，本研究不仅首次提供了针刺诱导组织重构的动态图谱，还为在活体系统中评估物理疗法（如艾灸）建立了先例。通过将瞬时的生理反应转化为可量化的指标，我们为神经调节疗法的机制研究提供了一种新的研究范式。

方案

所有实验程序均经中国中医科学院针灸研究所动物伦理委员会批准（编号：D2023-01-29-01）。实验所用八只雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（8周龄，200–220 g）购自生物技术有限公司（许可证号：SCXK（京）2020-0001）。动物饲养于无菌隔离环境中，环境条件控制为：12小时光照-黑暗循环，21℃ ±± 2 °C温度下饲养，自由摄取标准颗粒饲料和水。所有实验均符合机构指南和《实验动物护理与使用指南》。​

注意：主要操作流程的示意图见图1。

1. 动物与示踪剂的准备：荧光素钠（FS）

1. 配制1%荧光素钠（FS）染色液：将0.1 g FS溶解于10 mL无菌生理盐水（0.9% NaCl）中，室温（RT）保存备用。
2. 采用异氟烷诱导麻醉SD大鼠（诱导浓度：5%异氟烷，维持浓度：2.5%异氟烷）。使用电动剪刀去除颅部区域（头部除外）的毛发，随后涂抹脱毛膏并保持5分钟。用温水冲洗以清除残留的脱毛膏和毛发。
   ​注意：操作过程中应保持剪刀刀头与皮肤表面平行，以防皮肤损伤影响定量成像分析。冲洗时必须严格使用温水，以避免动物低体温影响实验结果。

2. FS的注射

1. 固定大鼠。
   1. 通过腹腔注射10%水合氯醛（1 g/10 mL，生理盐水配制），剂量为1.0 g/kg，对脱毛后的大鼠进行麻醉。
   2. 待大鼠完全麻醉后，将其仰卧位固定于手术平台上。使用镊子轻轻夹压后肢足趾，观察无回缩反射；再用湿润的棉签轻触角膜，确认角膜反射消失。
   3. 在开始操作前，确认大鼠持续无反应且呼吸频率稳定。麻醉期间，使用37 °C加热垫维持动物体温。
      NOTE: 必须确认完全麻醉，以防止不自主运动影响成像窗口的重新定位。
2. 通过尾静脉以每100 g体重0.1 mL的剂量静脉注射1% FS溶液。
   1. 使用配备27 G针头的1 mL注射器进行尾静脉注射。用温水轻轻擦拭尾部以促进血管扩张，随后用70%乙醇消毒。
   2. 将针头斜面向上，沿静脉长轴以浅角度（≤15°）插入。以0.1–0.2 mL/min的速度缓慢注射溶液。
   3. 确保注射过程无阻力、无血管周围水肿，并通过瞳孔、耳廓和足掌出现黄色染色来确认注射成功。
      ​NOTE: 必须严格避免误入动脉注射。

3. 在体 探针式共聚焦激光内窥显微成像（pCLE）系统设置

1. 启动pCLE系统，并检查扫描探头连接端和远端尖端的清洁度。
2. 使用蘸有生理盐水的棉签清洁探针远端尖端（也称为扫描尖端），然后用镜头纸轻轻擦干。
3. 将激光探头置于目标观察区域（如大腿内侧区域）。使用可调节夹具固定共聚焦成像探头，确保探头与组织表面稳定接触且无压迫伪影，通过拧紧调节旋钮将其固定。
4. 将探头连接至pCLE系统，并设置采集参数（如视野范围[FOV]、存储目录）。本实验所用的具体参数如下：深度：18 µm；激光功率：219 mW；亮度：76%；速度：1920 × 540；增益：2400；缩放：1× (464 µ微米）；滤光片：长通515；查找表：灰度扫描。
   注意：成像参数（扫描深度/激光功率）经过反复优化，直至获得清晰的组织结构可视化效果。保持信号强度一致对于纵向图像的可比性至关重要。添加37 °C 在探针与组织界面处的生理盐水液滴消除了在早期迭代中观察到的信号丢失。本研究中使用的激光功率低于光毒性公认的阈值 体内 共聚焦成像

4. 使用pCLE对组织结构进行成像及图像采集

1. 将探头置于皮肤表面，启动数据采集以观察组织结构。
   1. 以执笔式握持探头；移动探头至目标区域（例如视野内含有血管或纤维结缔组织的区域），将探头远端直接放置在成像区域，然后通过探头臂固定探头。
2. 首先在生理条件下采集1分钟的基础组织结构图像，随后在针灸干预期间持续记录5分钟。干预结束后终止数据采集。数据文件将自动保存至步骤3.3-3.4中指定的目录。
   注意：文件以图层堆栈格式（.tiff）和单帧图像格式（.tiff）保存。

5. 针刺干预

注意：成像步骤中的采集需在干预过程中进行。

1. 将一根1寸（中国长度单位，约13 mm）的一次性不锈钢针插入探头观察组织附近的穴位。将一根导线连接至不锈钢针，另一参考电极固定于大鼠尾部。
2. 采用以下参数进行电针（EA）刺激：强度1 mA，疏密波（2/15 Hz），持续5分钟。
   注意：针刺部位与探头之间应保持足够距离（>3 mm），以避免电针引起的皮肤震颤影响图像稳定性。

6. 图像分析

1. 在 ImageJ 中打开获取的图像堆栈。将空间校准转换为微米，并将图像格式转换为 8 位以兼容插件（图像 > 类型 > 8 位）。
   ​注意：默认图像尺寸单位为英寸（系统特定设置）。
2. 定义感兴趣区域（ROIs）：微循环：单个毛细血管段；基质结构：胶原纤维区域。在连续图像中保持相同的感兴趣区域，以确保纵向一致性。
3. 微循环分析
   1. 选择需要观察的红细胞所在区域，并裁剪图像以去除其他干扰区域（矩形 > 图像 > 裁剪）。使用阈值工具对红细胞（RBC）进行单独分割（图像 > 调整 > 阈值工具）。
   2. 加载 MTrack2 插件。根据红细胞大小（本实验中为 10–42 像素）设置适当的追踪参数，以排除干扰并确保红细胞追踪的准确性（插件 > 追踪 > MTrack2）。
4. 基质结构分析
   1. 加载 Directionality 插件，选择 傅里叶分量 模式，并对 0° 至 180° 方向范围内胶原纤维的分布比例进行统计分析（分析 > Directionality）。

7. 数据定稿

1. 使用以下命名规范将分析后的数据导出为 TIFF/XSL 格式：[组别]_[日期].扩展名。将所有原始文件和处理后的文件备份至指定的安全服务器。在汇总电子表格中记录定量输出结果，用于统计分析。

8. 安全与废弃物管理

1. 个人防护装备（PPE）：操作乌拉坦、异氟烷或荧光素钠时，应佩戴丁腈手套、实验服和安全护目镜。
2. 麻醉剂操作：涉及乌拉坦或异氟烷的操作应在通风橱内进行，以最大限度减少吸入暴露。
3. 锐器防护：所有针头和其他锐利物品使用后应立即丢弃至指定的防刺穿锐器容器中。
4. 电针（EA）安全：确认电针设备的电气隔离性，并固定导联连接，防止漏电流或短路。
5. 废弃物处理：根据机构规定，将异氟烷瓶作为医疗废物丢弃；染料污染的材料（如棉签、组织）应置于密封的危险废物容器中处理；锐器应收集于经认证的锐器废弃箱中。
   注意：所有操作必须符合机构的安全与环境健康法规。

结果

本方案展示了pCLE在实时动态评估针灸对微循环和细胞外基质结构影响方面的应用价值。通过尾静脉注射荧光素钠后，观察局部毛细血管内红细胞流速的变化以及胶原纤维排列的重组情况，以评估相关改变。

针刺后5分钟的代表性结果显示红细胞运动加快（P < 0.05，t检验）（图2A），胶原纤维重新排列为有序的束状结构（图2B、C）。针刺引起的局部血流动力学加速和间质渗透压变化导致纤维束分离，表现为成像中纤维间间隙增宽及亮区范围增加。我们还注意到，针刺后毛细血管通透性升高可能导致局部荧光素渗漏，这可能部分解释了观察到的信号增强现象。该机制进一步支持了针刺在促进微循环动态变化中的作用。

尽管可以...

讨论

如结果所示，本研究建立的体内共聚焦成像方案利用常规商用设备和标准荧光标记方法，能够在针灸干预过程中同步定量分析微循环和细胞外基质的动态变化。该方案的成功依赖于两个关键步骤：精确控制荧光素钠的注射时机，以确保微血管对比度持续稳定¹⁴；以及严格固定实验动物，这对纵向追踪胶原纤维至关重要。

为解决技术难题，实施了针对性优化：在探头与组织界面处添加37 °C的生理盐水液滴，消除了初期实验中出现的信号丢失现象；同时，保持电针位点与探头之间大于>3 mm的距离，减少了振动伪影。这些改进显著提高了数据的可重复性。

尽管本方案可实现 0.5 µm 分辨率的实时观测，但仍存在局限性：成像深度受限（有效范围 ≤200 µm，不足以穿透深层组织）。未来的改进可考虑整合双光子成像模块以增强深度穿透能力，或应用 体内 光学透明化技术^15,16.<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 寸针灸针	Hwato, 苏州, 中国	N/A	13 mm/0.25 mm
10% 荧光素钠	广西梧州制药有限公司, 中国	H45021477
动物麻醉机	RWD, 深圳, 中国	R620IE
体温监测仪	RWD, 深圳, 中国	69026
电针仪	Hwato, 苏州, 中国	SDZ-III
脱毛膏	Veet, 法国
ImageJ	美国国立卫生研究院, 美国	https://imagej.nih.gov/ij/
活体探头共聚焦激光内窥显微镜	Optiscan, 澳大利亚	ViewnVivoB30	直径：4 mm 手持式刚性探头，抗弯曲，长期使用仍保持结构完整性。长度：≥46 mm。扫描模式：具备变焦扫描功能。
异氟烷	RWD, 深圳, 中国	R510-22-16
氨基甲酸乙酯	Sigma-Aldrich, 美国	94300