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方法文章

建立猪模型以研究全眼移植的动态保存与移植

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DOI：

10.3791/69179

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2025年11月25日

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1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Children's Boston, 3Plastic Surgery Research Laboratory, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 4Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, Hospices Civils de Lyon, 5Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, CHU de Rennes, University of Rennes, 6Faculty of Medicine and Health Sciences, University of Antwerp, 7Bioengineering Research Group, Cardiff Metropolitan University, 8Collaboration for the Advancement of Sustainable Medical Innovation, University College London, 9Division of Plastic Surgery Research, Vascularized Composite Allotransplantation Program Development, Cedars-Sinai Hospital

本文内容

摘要

本文详细描述了一种可重复的猪全眼移植模型（WET），涵盖了从手术获取到启动机器灌注的全过程，可用于研究移植中全眼动态保存的效果。

摘要

首例人类全眼移植术（WET）为因严重眼外伤而失明的患者带来了新的希望，但在通过全眼移植实现视力恢复之前，仍有许多重大挑战亟待解决。其中最关键的挑战之一是 离体 保存。眼球，尤其是其神经组织如视网膜和视神经，在离体后数分钟内若未采取适当保存措施，将迅速发生不可逆的退行性变化。静态冷保存（SCS）目前仍是血管化复合组织异体移植（VCA）的金标准，但并不适用于湿性角膜保存（WET） 离体 由于无法充分抑制或维持代谢，导致移植物活力和功能丧失，因此保存效果不佳。亚常温机械灌注（SNMP）作为一种有前景的替代静态冷保存（SCS）的方法应运而生，不仅有望实现移植物的保存，还可对其进行再调节。本课题组已成功将SNMP技术从实体器官移植拓展至多种血管化复合组织异体移植（VCA）模型，验证了其可行性和优势。本文报道了在猪模型中应用SNMP技术保存全下肢移植组织（WET）的方法，详细描述了解剖模型及保存方案。该方法在优化WET保存与移植技术方面具有重要意义。

引言

血管化复合组织异体移植（VCA）是重建外科领域的一项重大进展，为患有复杂病变的患者提供了无与伦比的美学和功能效果1,2。然而，与眼球相关的视力丧失仍是面部损伤患者功能障碍的主要来源。近期完成的首例全眼移植（WET）为患者带来了新的希望3,4。尽管尚未恢复视力，但功能性影像显示大脑皮层对光刺激产生了激活，视网膜电图（ERG）也显示出视网膜感光细胞对光刺激存在减弱但可识别的反应5。尽管取得了卓越的技术成就，要实现功能性全眼移植的临床应用，仍需克服诸多重大挑战。眼球对缺血极为敏感，视网膜和视神经在温缺血时间（WIT）仅数分钟内即会发生不可逆的退行性变，除非维持适当的氧合和pH水平6。因此，全眼移植在VCA领域中面临特殊挑战，必须综合考虑包括眼球后段和前段以及眼外结构在内的多个因素。特别是眼外肌组织对于实现良好的功能预后至关重要，因其极易受到温缺血损伤的影响，而缺血-再灌注过程会进一步加剧损伤7,8。缺氧会导致细胞损伤并释放损伤相关分子模式（DAMPs）。再灌注时，这些DAMPs会激活受体的免疫系统，引发炎症反应和免疫细胞浸润。这种炎症环境通过促进抗原呈递和T细胞活化而加速排斥反应9。除了视神经再连接等挑战外，全眼移植还需要优化的离体灌注（ex vivo perfusion）技术，以防止温缺血时间或静态冷保存（SCS）造成的组织损伤，最终实现视力恢复5,7,9,10,11。

机械灌注（MP）在实体器官移植中已得到广泛应用，是一种预防缺血-再灌注损伤的方法12,13,14，与 亚常温机械灌注（SNMP）在多种模型中显示出优于静态冷保存（SCS）的效果15,16,17我们已成功将SNMP在从啮齿类动物到其他动物模型的范围内进行转化应用18,19 用于猪20,21,22 以及最近的非人灵长类动物23SNMP不仅被证实可在延长保存时间内有效维持移植物活性，还展现出在移植物再 conditioning 及减轻温缺血损伤方面的潜力，从而可在获取后安全地进行长达24小时的再移植。24,25由于SNMP能够部分维持细胞代谢，它还通过将保存阶段转变为可整合到VCA再植与移植方案中的诊断、治疗和预处理平台，开辟了新的途径。我们已开发出一种专门针对VCA优化的SNMP方案，并将其应用于这一极具挑战性的全眼移植情境中。

在本研究中，采用 SNMP 技术在常温（约 20 °C）下对含氧动态器官进行保存。该技术利用蠕动泵和氧合器循环并氧合灌注液。实验采用猪模型，因其在生理特征上与人类高度相似、血管尺寸相近，且具有独特的眶外侧壁缺失结构，故在 WET 移植与保存研究中具有重要相关性。26,27,28这一特性使其特别适用于 离体 实验和异体移植研究，因为颈外动脉与眼动脉直接相连，使得WET仅通过颈外动脉和颈静脉即可获取，无需进行颅内解剖 离体 实验和 体内 原位或异位再植。器官获取在循环死亡后进行，符合心脏死亡后捐献的方案，可延迟获取时间，直至其他实体器官完成 harvesting。因此，该模型进一步探索了SNMP在经历热缺血后对高度敏感移植物进行再条件化处理的潜力，并支持已在其他器官移植领域建立的移植实验室发展WET保存技术，遵循既定的 "3-R" 优化、减少和替代原则29,30此外，该方法在遵循类似步骤的心跳供体器官获取中同样具有相关性。其目标是建立一种基于颈外动脉和颈静脉蒂的可靠保存模型，并评估其用于动态保存的可行性。文中提供了详细的手术步骤，涵盖移植物获取、保存以及实施 SNMP 的关键环节。

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方案

本研究已获得当地机构动物护理和使用委员会的批准（方案编号 #2024N000205）。所有动物实验均遵循《动物研究：In Vivo 实验报告指南》31，并符合美国陆军动物护理和使用审查办公室（ACURO）的建议32。所有全眼移植（WET）均取自接受终末器官获取手术的猪，遵循“3-R”""原则33。实验选用体重在 30 kg 至 50 kg 之间的动物，在给予 100 IU/kg 肝素后通过放血法实施安乐死，左眼全眼移植移植物用于实验，右眼全眼移植作为对照。器官获取在动物死亡后进行，热缺血时间少于 180 分钟。有关本方案中使用的所有试剂和设备的详细信息，请参见材料表。

注意：数据记录在电子表格（例如 Excel）中，并使用适当的统计软件（例如 GraphPad Prism）进行统计分析。显著性水平设定为 5%，采用双尾检验。对于每个监测变量，均计算其均值和均值的标准误差。采用斯皮尔曼检验分析灌注参数之间的相关性。

1. 机器灌注准备（实验前1天）

  1. 设置机器灌注系统34（参见图1）。
    1. 组装灌注系统组件：泵、氧合器、气泡捕获器、连续压力传感器和重量传感器。
      注：管路长度应保持为组装所需组件的最小长度。组装完成后需注意，压力校准针对特定系统，尤其与管路长度相关。
    2. 将系统连接为半封闭循环回路，使灌注液从储液罐泵入氧合器，再进入移植物流入道（颈动脉），静脉流出液则回流至储液罐（补充图1和补充视频1）。
    3. 将压力传感器连接至流入管路。
    4. 将移植物置于电子天平上的三维（3D）打印平台。
    5. 将天平和压力传感器均连接至微控制器。
    6. 将微控制器连接至操作员计算机，用于实时监测和连续数据记录。
    7. 准备好热成像相机以进行温度监测。
      注：重量监测作为水肿形成的替代指标至关重要，因其可在灌注期间作为移植物损伤的早期指标35。
  2. 在启动灌注前彻底清洁回路组件，并特别注意氧合器，尤其是已多次使用的情况下。
    1. 首先用70%乙醇单独冲洗所有管路，随后用无菌去离子水冲洗。
    2. 组装系统后，若氧合器已使用过，则以50–100 mL/min的流速循环2 L无菌去离子水冲洗氧合器。
      注：对于活体动物再植研究，应使用新的无菌氧合器，并用环氧乙烷（ETO）对所有其他灌注组件进行灭菌。
  3. 配制灌注液。对于亚常温机器灌注，使用针对血管化复合组织移植（VCA）优化的Steen+溶液24,34,36。每份移植物共使用1.5 L，具体成分参照先前报道的详细配方34。
  4. 向灌注液中加入氢氧化钠溶液，调节pH至7.5–7.6。初始值应有意设为偏高，因为在循环过程中，当碳合气体混合物（95%氧气，5%二氧化碳）溶解时，pH会下降。
  5. 校准重量和压力传感器，以确保测量准确。
    1. 对天平去皮，以扣除平台重量。
    2. 为精确测量血管压力，需根据所用导管规格和流速进行系统校准：在常规流速间隔（每0.5 mL递增，从0至20 mL/min）下，测量可能使用的每种导管尺寸的系统压力。
    3. 实验过程中，计算动脉压力时，需从测得的总压力中减去校准压力。本实验所用校准表作为示例提供（补充图2）。
      注：校准针对每个具体装置而定。每次更换管路、氧合器或灌注液后均需重复校准，因为这些改动可能改变系统压力。

2. 死后全眼移植供体摘取

注意：为模拟心脏死亡后捐献和/或死后器官获取，应根据当地 IACUC 指南对动物实施安乐死。优先选择放血法而非静脉注射戊巴比妥钠，以避免药物毒性对研究造成干扰。

  1. 将安乐死后的动物保持俯卧位。剃除并清洁头部和颈部区域，铺无菌巾。
    注意：解剖模型在 图2，并提供了逐步解剖指南 补充文件 1.
  2. 绘制皮瓣的皮肤标记。
    1. 确保标记线围绕眼眶，距离眶缘2 cm，并从外眦向下颌方向延伸1 cm的切口。
    2. 用手术刀进行切口°使用23号手术刀在眼眶的上缘和下缘，从皮肤和皮下组织切至骨膜，包括骨膜。在皮瓣的前缘和后缘，确保切口达到筋膜平面。
  3. 使用史蒂文斯剪刀和艾德森镊子从眼眶的前部开始解剖。
    1. 使用骨膜剥离器在骨膜下平面将眼眶内容物向眼眶壁方向抬起。
    2. 使用镊子识别并分离靠近眶壁的结构°15号刀片手术刀，包括斜肌止点和眶静脉丛，后者出眶后汇入额静脉。
      注意：额静脉汇入面静脉，若保留与眼静脉的吻合支，可牺牲面静脉以节省时间。
  4. 继续解剖眼眶的后部区域。使用手术刀在颧骨附着处切除咬肌，随后使用Liston骨剪切除下颌支的升支。通过向外旋转下颌骨碎片，手动使髁突脱位。
  5. 从颧突至额骨切开眶韧带，以暴露颞肌的眶部。切除颞肌。
  6. 使用骨膜剥离器，在颧弓下方至眶前缘处创建一个骨膜下隧道。使用往复锯切割骨骼。辨认位于颞肌下方眶锥体下外侧部分的眼动脉。
  7. 使用咬骨钳切除颧弓及眶下前壁。
    注意：这些步骤可暴露眶锥的下外侧部分及其血管蒂。
  8. 使用精细的Stevens剪刀和显微外科镊子识别并游离进入眶内容物的两条眼动脉分支。
    注意：大多数血管（如颈外动脉和浅颈静脉）位于下颌骨下方，而面静脉除外，其位置在下颌骨表浅处。
  9. 在分离出所需长度的颈外动脉和颈静脉后，使用手术刀切断视神经、动眼神经及血管蒂，完成解剖。

3. 灌注前准备

  1. 在侧桌处，使用显微外科扩张器扩张颈动脉，并插入套管针。用3-0丝线固定插管。
    注意：在本方案中，所有动脉均使用18 G套管针。如果动脉蒂较短，需注意不要将导管插入过深，以免仅选择性地插入股动脉的两个眼动脉分支之一。除非使用闭合循环灌注系统（本方案未采用），否则无需插管颈静脉。
  2. 使用连接压力传感器的10 mL注射器（与灌注装置所用压力传感器相同）冲洗颈动脉。用10 mL肝素（100 IU单位/mL）冲洗血管，直至流出液澄清。压力应保持在35 ± 5 mmHg以下，因为过高的压力可能导致微血管损伤和灌注失败。

4. 亚常温机械灌注

  1. 将移植物的插管动脉连接到机械灌注系统的流入管路，并将移植物放入天平中。
  2. 启动泵，流速设定为 2–4 mL/min。
    注意：灌注流量和压力参数取决于所使用的方案。对于血管化复合组织异体移植（VCA），采用稳定且低流量的方案，以防止毛细血管损伤和水肿形成。
  3. 在预设的每个时间点，使用 1 mL 注射器从流入端和流出端采集样本，并利用血气分析仪（例如，血气指标 [pH、pCO2、pO2、乳酸、碱剩余、碳酸氢根]、葡萄糖、钠、钾、钙、氯）进行分析。这使我们能够根据表 1中列出的公式计算移植物的代谢状态。
    注意：本方案中，灌注持续 18 小时，在前 6 小时内每小时采集一次流入和流出样本，随后在剩余的 12 小时内每 3 小时采集一次。

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结果

在SNMP期间进行了为期6小时的初步可行性测试，随后使用全血进行2小时的常温机械灌注（NMP），以评估整个移植物的正常再灌注情况并模拟再植过程。在SNMP阶段观察到稳定的流出液，随后的全血再灌注模拟显示整个移植物成功恢复颜色。灌注参数进一步证实了该技术的可行性（补充图3）。

在随后进行的7次重复实验中，实验在稳定的低流速条件下进行，流速范围为2 mL/min至3 mL/min，导致灌注开始时平均动脉压为57.6 ± 4.0 mmHg，并在实验过程中逐渐下降，至灌注结束时平均动脉压降至36.7 ± 4.2 mmHg。灌注结束时的平均增重为9.3 ± 3.3%。血管压力和重量变化的典型示例如图3所示。

确定了两个不同的灌注阶段。第一阶段出现在灌注开始后的最初6 h内，由于在热缺血期间积聚的代谢物被冲洗出来，代谢物水平呈现下降趋势，标志着恢复期，此阶段同时伴随着毛细血管的进行性扩张。第二阶段为随后的12 h灌注期，称为保存期，其特征是所有参...

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讨论

在首例临床病例出现二十多年后，血管化复合组织移植（VCA）仍面临重大的免疫学和ex vivo保存挑战，限制了其广泛应用37。这些挑战在眼球移植（WET）中尤为突出，尽管WET为视力恢复带来了令人期待的前景，但也存在独特障碍，例如实现视神经成功再连接、维持眼前段和眼后段的功能性，以及保护眼周结构的完整性。对于眼部VCA而言，移植前尤其关键的是防止眼球发生缺血性损伤，因为若不能维持适当的氧合和pH水平，视网膜可能在数分钟内发生不可逆的功能丧失6；因此，提高保存质量和延长保存时间对于成功将WET转化为临床应用至关重要，以最大程度提高视力恢复的可能性。机械灌注技术近年来作为VCA中的一种潜在解决方案崭露头角，其在改善实体器官保存方面的有效性已得到证实；本文中，我们展示了该技术在WET中的适用性。

本报告介绍了一种用于眼球外（ex vivo）保存完整眼球组织（WET）的实验方案。猪模型因其与人类生理结构的高度相似性以及缺乏眶外侧壁的解剖特点，具有显著优势，这一特...

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披露

部分作者声明存在竞争利益。Uygun博士、Lellouch博士和Cetrulo博士拥有与本研究相关的专利申请。Korkut Uygun博士和Basak Uygun博士在Sylvatica Biotech Inc.公司拥有经济利益，并担任该公司的科学顾问委员会成员，该公司致力于开发非冻结状态下的高亚零度器官保存技术。MGH研究人员的竞争利益由MGB根据其利益冲突政策进行管理。其余所有作者均声明不存在利益冲突。

致谢

本工作部分由美国国立卫生研究院资助，资助编号分别为 R01AR082825（BEU）、R01EB028782（KU）、美国国防部再生医学研究计划 RT240044（KU、AGL、CLC）、Shriners 儿童医院 84308（YB）以及 ARPA-H 子项目 FY25.1065.001（CLC），并由美国国家科学基金会资助，项目编号 EEC 1941543（KU）。HO 和 YB 获得了 Fondation des Gueules Cassées 的资金支持。特此感谢法国整形、重建与美容外科学会（SOFCPRE，法国）对 HO 和 YB 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Adson 镊子Fine Science Tools11019-12外科工具
Affinity Pixie 氧合系统MedtronicBBP241氧合器
Angiocath（24 G）Becton Dickinson381112插管导管
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA9647灌注液组分
氯化钙二水合物Sigma-Aldrich223506灌注液组分
二氧化碳氧气混合气AirgasUN3156二氧化碳氧气混合 气体 
导管 24 GDutscher921048动脉插管
D-(+)-葡萄糖一水合物Sigma-Aldrich49159灌注液组分
地塞米松Sigma-AldrichD2915灌注液组分
右旋糖酐Thermo scientific406271000灌注液组分
扩张镊AROSurgical11.946.1102外科工具
Excel Microsoft电子表格软件
肝素钠注射液Eugia Pharma63739-953-25灌注液组分
Humulin 正规胰岛素（人源）Lilly0002-8215-01灌注液组分
氢化可的松琥珀酸钠Pfizer0009-0011-03灌注液组分
LigaclipEthiconMCS20外科血管夹
Liston 骨剪Fine Science Tools16104-19外科工具
氯化镁六水合物Sigma-AldrichM9272灌注液组分
MasterFlex L/SCole-Parmer77200-32滚压泵
显微外科镊Fine Science Tools11253-20外科工具
骨膜剥离器AROSurgical46.415.18外科工具
聚乙二醇 35000Sigma-Aldrich25322-68-3灌注液组分
氯化钾Sigma-Aldrich7447-40-7灌注液组分
便携式压力监测仪 PM-P-1Living Systems InstrumentationPM-P-1压力传感器
Prism GraphPadv. 10.1.1统计分析软件
Radnoti 气泡捕获兼容室Radnoti130149气泡捕获器
RAPIDPoint 500Siemens500血气分析系统
往复锯Stryker5100-37外科工具
咬骨钳Fine Science Tools16002-18外科工具
手术刀片（n15）Fine Science Tools10015-00外科工具
手术刀片（n23）Fine Science Tools10023-00外科工具
丝线缝合线 3-0EthiconP683H缝合线
碳酸氢钠Sigma-AldrichS5761灌注液组分
氯化钠Sigma-AldrichS9888灌注液组分
氢氧化钠Sigma-Aldrich72068灌注液组分
磷酸二氢钠二水合物 Sigma-Aldrich71505灌注液组分
Stevens 剪刀AROSurgical07.367.13外科工具
注射器 1 mLBD309659样本采集
注射器 10 mLDutscher300912移植物冲洗
热成像相机Flir Onehttps://www.flir.fr/products/flir-one-gen-3/?vertical=condition+monitoring&segment=solutions灌注温度监测
管路（n°16）Masterflex13-310-282机器灌注装置
盐酸万古霉素Slate run pharmaceuticals70436-021-82灌注液组分

参考文献

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