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Drosophila melanogaster 间接飞行肌的显微观察解剖方法

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DOI：

10.3791/69185

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2025年11月7日

 ,  ,  , 
1Division of Biological and Biomedical Systems, School of Science and Engineering, University of Missouri Kansas City

本文内容

摘要

Drosophila 是研究肌生成基本机制的有力模型。本方案通过解剖和制备胸部半切片，可对蛹期和成虫期的间接飞行肌进行显微镜分析。该方案支持对细胞形态、蛋白质定位、肌肉结构以及肌生成的其他多个方面进行共聚焦成像分析。

摘要

黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的间接飞行肌（IFMs）是一个强大的遗传模型，可用于探索肌发生的基本原理。其收缩机制及许多肌节组分在从果蝇到脊椎动物的进化过程中高度保守，使得研究人员能够研究从转录调控、RNA加工到代谢和机械生物学等多个调控并精细调节肌肉发育的细胞过程。许多此类细胞通路在人类肌病中发生改变，而对IFM的研究为肌肉疾病的分子病因提供了相关见解。特别是，果蝇非常适合利用显微镜技术，在整个IFM肌发生过程中——从成肌细胞特化、肌原纤维形成、成熟到维持——分析肌纤维和肌节的形态与功能。本文提供了一种用于显微成像的黑腹果蝇（D. melanogaster）IFM在蛹期和成虫期的解剖方案。文中图示了晚期蛹和成虫IFM的半胸廓解剖方法，以及早期蛹IFM的“开书式”解剖方法。同时描述了固定、染色和样本封片的操作流程，并介绍了常见的解剖伪影，辅以代表性数据展示IFM解剖与不同固定试剂的兼容性。该方案被应用于研究RNA结合蛋白运动神经元存活蛋白（Smn）的低效等位基因SmnE33，检测时间点分别为蛹壳形成后26小时（APF）、72小时APF以及成虫期IFM，从而为脊髓性肌萎缩症（SMA）模型提供了新的认识，并展示了该方案的通用性。这一详细的操作流程有助于研究人员更便捷地使用IFM模型系统，获取高质量的显微成像数据，以深入探究肌发生的科学原理。

引言

动物拥有数百块肌肉，控制着从行走、说话到抓握工具等各种运动。为了支持如此多样的功能，肌肉在大小、附着方式、收缩能力、代谢和基因表达方面存在差异1。肌肉生物学领域的一个主要研究重点是理解这些结构和功能差异在发育过程中是如何产生的，以及在肌肉疾病中如何发生改变2。肌肉收缩由肌节驱动，肌节由含肌动蛋白的细丝构成，细丝锚定于Z盘，并与锚定于M线、含双极肌球蛋白的粗丝相互交错3。肌节首尾相连形成肌原纤维，这种在横纹肌中规则排列的结构在显微镜下呈现为明暗相间的条带4，为监测肌节组装和排列的变化提供了一种实用的可视化方法。结合遗传学和生化手段，显微镜技术已为转录调控、RNA加工、代谢和机械信号转导等细胞过程提供了重要见解5,6,7，这些过程指导并精细调节肌肉的发育与功能。许多此类细胞过程在人类肌病和神经肌肉疾病中受到破坏8,9，凸显了理解肌肉发育对于揭示肌肉疾病病因的重要性。基因工程技术的进步使得单个细胞的操作和内源性蛋白标记成为可能10,11，结合成像技术和分辨率的技术进步12,13，确保了显微镜技术在肌肉研究中的持续重要性。因此，具有清晰且易于实施的肌肉解剖和样品制备方案的模型系统在肌肉研究领域具有重要价值。

黑腹果蝇（D. melanogaster）的间接飞行肌（IFMs）是研究肌发生基本原理的一个强大且特征明确的模型系统8。IFMs 每侧胸半区包含六条背纵肌（DLMs），这些肌肉在幼虫期的肌肉模板上形成，同时还包括七条背腹肌纤维（DVMs），后者在蛹期发育过程中从头（de novo）构建14。由于 DLMs 位置靠近中线，易于操作，许多 IFM 研究集中于该肌肉，它是成虫果蝇中最大的肌肉，贯穿整个胸节，长度达 1 mm15。在化蛹初期，IFM 成肌细胞从翅盘铰链处的生态位迁移至胸部，并融合形成合胞体肌管16。在 27 °C 条件下，约化蛹后 24 小时（APF），肌纤维与肌腱连接后，其胞质和细胞骨架逐步组织化、致密化，并于化蛹后 30–32 小时开始肌原纤维生成17。新的肌节不断添加至肌原纤维中，肌纤维持续生长直至填满胸腔，此过程持续至约化蛹后 48 小时。随后，IFMs 进入成熟阶段，伴随转录和剪接模式的改变，逐步获得成体特有的代谢特性、收缩功能以及牵张激活能力18。在 27 °C 条件下，成虫果蝇于化蛹后 90 至 100 小时羽化；而在 25 °C 条件下，雌性果蝇约在化蛹后 98 小时、雄性约在化蛹后 102 小时羽化19。IFMs 是一个多功能且具有高度相关性的模型系统。该系统可在肌发生的各个阶段进行监测，其形态和功能均明显区别于果蝇体内其他类型的肌纤维，并且可利用大量已建立的遗传工具和操作方法8,20。从果蝇到脊椎动物，其收缩机制、基本肌节结构以及许多结构组分均高度保守5，使得从果蝇中获得的肌发生原理可有效转化为人类相关研究。事实上，果蝇已被成功用于建立多种神经肌肉疾病的模型，如强直性肌营养不良、脊髓性肌萎缩症（SMA）、肌原纤维肌病和肌动蛋白病，为揭示这些疾病的病因机制和开发治疗策略提供了重要见解21,22。值得注意的是，果蝇特别适用于显微成像技术，可用于系统分析肌纤维和肌节在整个肌发生过程中的形态变化，涵盖从成肌细胞特化、肌原纤维形成到肌节成熟与维持的各个阶段。

该 果蝇 IFMs 已被用于显微镜研究四十多年，极大地促进了对肌肉生长和发育的理解8在此期间，随着技术的进步，IFM解剖方案不断得到改进，从而产生了多种详略程度不一的方案，这些方案对某些成像技术而言较为理想，而对其他成像技术则可能不够理想。例如，为透射电子显微镜开发的方案涉及强效固定条件、超薄切片以及使用重金属进行对比染色3,23,24,25，但并不适用于光学显微镜观察。已开发出快速从胸部解剖分离间接飞行肌（IFMs）的实验方案，用于生化检测或分子分析26,27 会失去组织结构并可能破坏肌原纤维结构，因此不适合用于显微镜观察。已开发出针对幼虫肌肉或成体腹部肌肉的解剖方法20,28，但不适合完整IFM的分离。活体成像方法需要进行 minimally invasive dissections 或使用特殊培养基，以在成像过程中维持IFM组织的活性29,30，且无需进行免疫组织化学所需的肌肉固定步骤。目前已有多种针对间接飞行肌（IFM）组织的石蜡包埋或冷冻切片方案，这些方法均适用于组织化学或抗体染色。27,31,32，但这些方法通常涉及冷冻和组织脱水，可能改变肌肉超微结构，并限制一抗对某些抗原的识别。直接固定飞行肌（IFMs）的方案可保持肌肉形态，减少抗原构象的改变，因此适用于多种免疫组织化学实验。24然而，这些方案也针对特定应用，例如，解离IFMs的方案可用于单个肌原纤维的荧光显微镜、冷冻电镜或超分辨率显微镜分析20,33,34其他示例包括从胸部解剖完整间接飞行肌纤维的实验方案32,35 或制备整体 mounts 或半胸腔标本20,32,36 能够在完整环境下对肌纤维和肌节进行分析。对于新用户而言，从大量现有方案中进行筛选可能具有挑战性，其中大多数方案仅以文本形式呈现。培训人员和本科研究人员将受益于一种详细应用于标准免疫组织化学实验的完整肌肉纤维（IFM）解剖方案。

本文包含一系列用于解剖与制备的方案 D. melanogaster 用于免疫组织化学显微镜分析的蛹期和成虫期间接飞行肌。该方法已在近期研究中用于追踪RNA结合蛋白Bruno1在发育过程中的功能37 和 Rbfox138 在整个间接飞行肌（IFM）肌发生过程中。该方案包含详细的图示和分步操作图片，指导使用者完成成虫及晚期蛹期（出羽化后48小时至96小时）IFM的半胸廓解剖，其中沿中线将胸部切为两半，同时保持肌纤维结构完整。此外，本方案还涵盖了早期蛹期（出羽化后8小时至48小时）的“开书式”解剖方法，即切开并掀起胸部腹侧部分，如同打开一本书，以暴露仍附着于背侧表皮的完整IFM。方案后续步骤包括固定、染色和样本封片，代表性数据表明，该方法适用于多种固定方式，可用于免疫组织化学和荧光显微镜检测的组织制备。文中提供了典型示例，以帮助新用户识别常见的解剖伪影。该方案已应用于分析发育中IFM的表型特征 SmnE33，运动神经元存活基因（Smn）的一个功能减弱等位基因，用作果蝇模型 脊髓性肌萎缩症（SMA）21,39在26小时、72小时羽化后以及成体间接飞行肌中。本文提供的数据揭示了Smn在肌肉中的特异性功能，并突显了该解剖方案在研究肌肉发育及肌肉疾病病因学中的适用性。

方案

伦理声明：
本方案中的所有实验均使用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster），一种完全变态昆虫。在美国，无脊椎动物不受动物福利法规的约束，其使用无需伦理审批。所有操作均遵循标准的机构生物安全和实验室安全指南，并已获得密苏里大学堪萨斯城分校机构生物安全委员会批准，批准编号为21940（22-11）。

1. 成年果蝇间接飞行肌的半胸腔解剖（图1）

  1. 准备必要的实验用品，包括两把带有生物尖头的Dumont #5镊子、一把Dumont #3镊子、一对Vannas弹簧剪刀、一支塑料移液管、一把画笔、一个24孔板、无绒擦拭纸、载玻片和冷冻切片机刀片（见材料表）。配制1×PBS、0.05% PBS-T和固定液（见补充文件1）。可在补充图1中查看成年果蝇半胸部分解的流程图概览。
  2. 收集所需基因型和日龄的成虫（例如，刚羽化、1日龄成虫或5日龄成虫）。使用CO2或冰对样品果蝇进行麻醉。
    注：本方案中使用的果蝇在温度和湿度受控的培养箱中，于12小时光照：12小时黑暗的循环条件下培养。Drosophila通常在25 °C或27 °C下培养，也可在18 °C下培养，后者可将发育周期从10天延长至约20天。
  3. 在体视解剖显微镜下，使用塑料移液管将一滴1×PBS40转移至载玻片上。
  4. 使用画笔或镊子将样品果蝇分小批转移至载玻片上的PBS液滴中（图1A）。使用Vannas弹簧剪刀去除头部（图1B）、翅膀（图1C – D）和腹部（图1E），保留附着的足部（图1F）。
  5. 使用画笔或镊子将胸部分轻轻转移至24孔板中一个孔内的500 µL固定液中。在摇床/旋转摇床上固定所需时间（通常为15–60分钟）。
    注：本方案适用于多种固定缓冲液，包括多聚甲醛、戊二醛、甲醇、乙二醛溶液等。有关优化固定条件的详细信息，请参见代表性结果和补充文件1。应根据所在机构的危险化学品操作指南，佩戴手套和适当的个人防护装备（PPE）处理固定剂。
  6. 使用200 µL移液器吸除固定液，并在室温下用1 mL 0.05% PBS-T在摇床/旋转摇床上洗涤5分钟。
    注：固定液应按照所在机构的危险化学品处理指南进行处置。对于大多数抗原，固定后的胸部组织可在4 °C下保存于1 mL 0.05% PBS-T中，最长可达2周，之后再进行切片和染色。在使用前应测试更高浓度的Triton X-100，因为长时间的洗涤剂孵育可能破坏肌节结构。
  7. 使用200 µL移液器吸除缓冲液，并用画笔或镊子将胸部组织转移至体视解剖显微镜下载玻片上的一滴0.05% PBS-T液滴中。
  8. 将胸部组织调整为小盾片朝上，并用一对Dumont #3镊子夹稳固定（图1G–H）。
  9. 将冷冻切片机刀片沿胸部横向滑动，以在小盾片上刻出凹口（图1H、J、L），然后沿中线一次性平稳向下切割（图1I、J、L–N），从而获得暴露间接飞行肌（IFMs）的半胸切面（图1K）。
    注：在切割IFMs之前，必须先在体壁上"刻出凹口"或使其产生裂纹，以避免因拉伸造成肌节结构的人为损伤。切勿将刀片"来回锯动"，因为这种动作会机械性损伤IFMs，导致肌原纤维散乱。过多的缓冲液会使胸部组织在镊子间不稳定，增加切割难度。其他替代方法包括将胸部组织逐个固定在双面胶带上以辅助切割，或从胸部腹侧进行切割。
  10. 将胸部的两个半部分移动至载玻片上的适当位置，使其保持被缓冲液覆盖以防止干燥，同时不妨碍后续切割操作。重复步骤1.8–1.10，直至所有胸部组织均被切开。
  11. 使用镊子将载玻片上的胸部半切片转移至24孔板中一个孔内的500 µL 0.05% PBS-T中，随后进行封闭和免疫染色（见下文第4节）。

2. 晚期蛹期间接飞行肌的半胸腔解剖（约羽化后48小时至96小时）（图2，图3）

  1. 将所需基因型和龄期的蛹置于蛹期发育的选定阶段图2）。收集雄性或雌性白色未成熟蛹（图2A，B) 使用湿润的画笔转移，并在60 mm细胞培养皿中湿润的滤纸上孵育。蛹期的分期及从蛹壳中取出的方法此前已有描述20,26.
    注意：蛹在发育过程中会经历多种形态学变化，例如头部外翻以及蛹壳、复眼和刚毛的色素沉着。19,41 (图 2C）。这些形态特征可作为粗略判断蛹龄的依据（图 2D-）以及识别未能正常发育的蛹（图 2F然而，为确保准确的分期时间线，建议在较短的时间窗口内收集白色未成熟蛹，例如每30分钟或每2小时进行一次分期。精确的分期时间点对于区分24小时至35小时成蛹后（APF）期间细胞骨架结构和肌纤维长度发生的主要变化至关重要，同时也用于区分35小时、48小时、60小时、72小时、80小时和90小时成蛹后（APF）肌节结构的差异。18,42.
  2. 准备必要的实验用品，包括一把画笔、两把带生物学尖头的杜蒙特 #5 镊子、一对万纳斯弹簧剪刀、双面胶带、载玻片、塑料移液管、24 孔板、吸水纸（Kimwipes）和冷冻切片机刀片（参见 材料表）。配制 1× PBS、0.05% PBS-T 和固定液（参见 补充文件 1）。以下蛹期半胸节解剖的流程图概览可参见（补充图2).
  3. 在预定时间点，使用画笔在体视解剖显微镜（10–20倍放大）下，将蛹从滤纸上转移至粘附在载玻片上的双面胶带上图 3A，B将蛹沿胶带排列整齐，保持同一方向，腹面朝下。
  4. 使用一对 #5 镊子打开第一只蛹的蛹壳前端，轻轻移除头端上方的卵盖（operculum）图3C，D，I).
  5. 使用5号镊子小心地沿蛹壳背部翅膀上方切开，并以1-2 mm的间隔逐步将蛹壳从蛹体上剥离。操作时从腹侧向背侧方向进行，随剥离过程将蛹壳固定于双面胶带上图3E - G，I）。避免触碰蛹体本身，应将镊子尖端插入蛹壳与包围蛹体的基底膜（蛹囊）之间。
  6. 取出病例后，使用镊子以刮取动作从下方抬起图 3H，我）并轻轻将蛹从茧中移出，置于另一张载玻片上的一滴1×PBS中（图3J，K）以避免脱水。重复步骤 2.4–2.6（图 3I直至所有蛹均从蛹壳中移出。
  7. 使用 Vannas 弹簧剪从解剖后的蛹中移除腹部（图 3L).
    注意：去除腹部以便在后续步骤中使固定剂更好地渗透。为避免损伤胸部，应在腹部直接剪开，保留最多30%的腹部组织附着在胸部。
  8. 轻轻转移带有胸部的蛹头图3M使用毛刷或镊子将样本转移至24孔板的一个孔中，加入500 µL固定液。根据所需时间进行固定（通常为15–60分钟），随后按照步骤1.5–1.6所述，用1 mL含0.05% Tween-20的PBS（PBS-T）洗涤。
  9. 使用200 µL移液器去除缓冲液，并在体视显微镜下（10倍放大）用毛刷或镊子将胸部组织转移至载玻片上的一滴0.05% PBS-T液滴中。
  10. 分离一个样品 从其余部分分离，并将腹侧朝下放置，用一对Dumont #3镊子固定图3N).
  11. 用冷冻切片机刀片沿胸部横向滑动，直至基底膜和角质层被划开，然后沿中线以一次平稳的向下动作切开图3O）以生成暴露出间接飞行肌（IFMs）的胸部半切面（图3P).
    注意：不要 "锯" 前后移动刀片，这种动作会机械性损伤间接飞行肌（IFMs），导致肌原纤维撕裂。缓冲液过多会使镊子间的胸节不稳定，增加切割难度。蛹期胸节可在头部保留的情况下进行切割，头部可朝向左侧或右侧。
  12. 将胸部分成的两半移至载玻片上适当位置，使其保持浸没在缓冲液中以防止干燥，同时不妨碍后续切割操作。重复步骤 2.10–2.12，直至所有胸部组织均完成切割。
  13. 使用镊子将显微镜载玻片上的胸部半切样本转移至24孔板的一个孔中，加入500 µL含0.05% PBS-T的溶液，随后进行封闭和免疫染色（见下文步骤4）。

3. 早期蛹期间接飞行肌的摊书式解剖（约出蛹后15小时至48小时）（图4）

  1. 按照上述方法（步骤 2.1），将所需基因型和龄期的蛹置于蛹期发育的选定阶段（图 2）。
    注意：进行敞书式解剖时，应将蛹以每组不超过 8–10 只果蝇的数量进行分组解剖。
  2. 准备必要的实验用品，包括画笔、两把带生物尖头的 Dumont #5 镊子、Vannas 弹簧剪刀、双面胶带、载玻片、塑料移液管、黑色硅胶解剖皿、黑色玻璃染色皿、昆虫针和无尘擦拭纸（见材料表）。配制 1× PBS、0.05% PBS-T 和固定液（见补充文件 1）。后续蛹体敞书式解剖的流程图概览见（补充图 3）。
  3. 在目标时间点，按照步骤 2.3–2.6 所述方法将蛹从蛹壳中取出。取出后立即将蛹转移至盛有 1× PBS 的黑色硅胶解剖皿中（图 4A）。
  4. 待所有蛹均脱离蛹壳后，使用 Dumont #5 镊子克服表面张力，轻柔地将蛹压至硅胶表面。将蛹排列成一行，置于解剖皿中央附近（图 4B）。
  5. 使用 Dumont #5 镊子将两枚昆虫针插入每只蛹的腹部，以固定其位置（图 4C，D）。确保蛹的腹面朝上。
  6. 使用 Vannas 弹簧剪刀剪开每只蛹的基底膜和头部前区（图 4E）。
  7. 将剪刀插入切口，沿每只蛹的左右两侧剪开（图 4F，G，Q）。调整剪刀位置，紧贴发育中的 notum 下方，从后部剪至胸腹部连接处，以连同腹侧部分一并去除腿和翅。确保剪刀水平插入，避免接触胸部背侧部分（图 4Q）。
  8. 使用 Dumont #5 镊子夹住并提起蛹的腹侧部分，再用 Vannas 弹簧剪刀将其完全移除（图 4H，I，Q）。
  9. 使用 Dumont #5 镊子移除脑、腹神经索（VNC）、气管和肠道（图 4J，K，Q）。操作时需小心，避免扰动正在发育的间接飞行肌（IFMs），因其位于气管和腹神经索下方，附着于胸部背侧的表皮上。
  10. 剪去 200 µL 移液枪头的尖端，以形成更宽的开口。使用该改装后的 200 µL 移液枪，轻柔地将 1× PBS 缓冲液冲洗过胸部区域，以去除大部分残留的脂肪体，暴露 IFMs（图 4L，M）。操作应轻柔，避免撕裂连接肌纤维与表皮的肌腱附着点。
  11. 使用 Vannas 弹簧剪刀沿胸部背侧中线剪开，形成两个含有 IFMs 的"叶片"（图 4N）。
  12. 使用剪刀将胸部背侧的叶片从腹部剪下（图 4O，Q），然后用 Dumont #5 镊子将叶片转移至黑色玻璃皿中含 300 µL 固定液的溶液中（图 4P）。镊取时应夹住头部外壳部分，避免损伤 IFM 肌纤维或肌腱。
  13. 根据需要进行固定（通常为 15 分钟）。使用 200 µL 移液枪小心吸除固定液，并加入 500 µL 0.05% PBS-T 进行洗涤。随后进行封闭和免疫染色（见下文步骤 4）。
    注意：切勿在黑色玻璃皿中对样品进行振荡或摇动。早期蛹阶段的肌肉-肌腱连接极为脆弱，持续的缓冲液扰动会导致其撕裂，造成 IFMs 丢失。更换溶液时，应缓慢而小心地沿液面边缘移液，避免将样品吸入移液枪头内。

4. 固定的IFM样本的免疫染色与组织化学

  1. 准备必要的耗材，包括移液器、移液器吸头以及所需的抗体或染料。配制 0.05% PBS-T、封闭液及抗体/染料混合液（参见补充文件 1）。
  2. 用移液器将洗涤液（0.05% PBS-T）从样本中吸出，加入封闭液。将样本在封闭液中于室温孵育至少 30 分钟（步骤 1–2 需摇动，步骤 3 无需摇动）。
    注意：样本也可在 4 °C 下封闭过夜。本方案中，样本使用含 5% 正常山羊血清（NGS）的 0.05% PBS-T 进行封闭。有关封闭液选择的更多详细信息，请参见补充文件 1。
  3. 用移液器将胸段中的封闭液移除，加入一抗混合液，并于室温孵育至少 2 小时，或在 4 °C 下过夜孵育（步骤 1–2 需摇动，步骤 3 无需摇动）。
    注意：本方案适用于大多数一抗。一抗应使用封闭液进行稀释。本方案中测试的一抗稀释比例范围为 1:10 至 1:2000，具体稀释比例需根据每种抗体实验确定。有关一抗染色优化的更多细节，请参见补充文件 1。
  4. 用移液器移除一抗混合液，使用 0.05% PBS-T 对样本进行洗涤，每次 10 分钟，共洗涤 3 次。
  5. 向样本中加入二抗或染料混合液。用铝箔包裹样本以减少光漂白。于室温孵育至少 2 小时，或在 4 °C 下过夜孵育（步骤 1–2 需摇动，步骤 3 无需摇动）。
    注意：大多数二抗和荧光细胞染料均可用于本方案。许多二抗的使用稀释比例为 1:500。在下文的代表性数据中（参见代表性结果），细胞核使用 DAPI（1 mg/mL 储存液，在 0.05% PBS-T 中 1:1000 稀释）标记，F-肌动蛋白使用罗丹明鬼笔环肽（300 单位/mL 储存液，在 0.05% PBS-T 中 1:500 稀释）标记。
  6. 用移液器移除二抗/染料混合液，使用 0.05% PBS-T 在室温下洗涤样本 4 次，每次 10 分钟。洗涤完成后立即进入封片步骤（步骤 5）。

5. 将染色样本装载到载玻片上以进行显微镜分析（图5）

  1. 准备必要的材料，包括画笔、镊子、磨砂载玻片、盖玻片（#1 厚度）、透明指甲油、封片剂和无绒擦拭布（参见材料表）。
  2. 在载玻片的磨砂书写区域标记相应的样品编号或首选的识别信息（日期、基因型、抗体、玻片编号等）。
  3. 放置盖玻片间隔物（#1 盖玻片），在间隔物之间预留约 1 cm 的空间用于放置样品（图 5A-C）。使用少量 50% 甘油固定间隔物（图 5A，D）。
    注意：在封片较厚样品时，间隔物可防止样品变形。成年果蝇胸部通常需要两个盖玻片厚度的间隔物，48 小时龄蛹胸部需要一个盖玻片厚度的间隔物，而“展开书页”状样品则无需间隔物。
  4. 在盖玻片间隔物之间的凹槽中滴加一滴封片剂；若封片早期蛹样品，则将封片剂滴在载玻片中央（图 5C-D）。将载玻片置于体视解剖显微镜下。
    注意：有多种类型的封片剂可供选择。若使用自固化封片剂，建议选择固化时间数小时的产品，以便在封片剂固化前有足够时间正确调整样品方向。已有研究表明，不同封片剂会影响肌节的尺寸43,44,45，因此同一实验中的所有样品应使用同一种试剂。
  5. 使用移液器尽可能吸除样品中的洗涤缓冲液，并立即用镊子或画笔将样品转移至载玻片上的封片剂液滴中（图 5E）。
  6. 使用 Dumont #5 镊子将样品排列成行和列，确保样品不重叠，并使胸部样品的间接飞行肌（IFMs）朝上（图 5F,J,Q,S）。若刚毛/角质层朝上，则需小心翻转样品以完成正确朝向（图 5G,H,K, L,R）。操作时避免触碰间接飞行肌，以免破坏肌节结构（参见代表性结果）。
  7. 小心地将一片 #1 盖玻片（18 × 18 mm 或 22 × 22 mm）覆盖在胸部样品上方（图 5M）。若使用了间隔物，应轻轻按压盖玻片，直至其与样品两侧的间隔物接触（图 5N）。
  8. 使用移液器吸头或滴管从边缘补充封片剂，直至所有胸部样品完全被浸没（图 5O）。避免产生气泡，否则会影响成像质量。
  9. 使用透明指甲油密封湿封片。注意需同时密封样品盖玻片及间隔用盖玻片的四周（图 5P,S）。
    注意：避免使用顶层涂层或快干型指甲油，因其密封效果差，且随着封片剂蒸发会产生气泡。
  10. 室温下干燥 10 分钟。将玻片存放在玻片盒中，置于 4 °C 保存。样品可在数天至数周内进行成像。
  11. 根据实验设计，在荧光显微镜、共聚焦显微镜或其他成像系统上对样品进行成像。图像采集与分析的相关方案可参考其他文献14,30,46,47,48。

结果

上述解剖方案可用于制备高质量样品，以进行显微镜下分析，研究自蛹壳形成后8小时（APF）起的间接飞行肌（IFM）肌纤维及肌节形态，幼虫期可采用“开放式书本”法（步骤3），成虫期则使用半胸廓解剖法（步骤1和2）。该解剖方法已被应用于研究肌肉和肌节的形成18,42,49、转录因子功能50,51以及RNA调控机制37,38等多个领域。下文提供的代表性结果展示了本方案与不同固定方法的兼容性，详细说明了常见的解剖假象，并利用SmnE33突变体表型，说明该方案在IFM模型中解答形态学和细胞生物学问题的应用价值。

IFM 解剖适用于多种固定方法

组织化学或免疫荧光样本制备的一个关键环节是通过固定准确保存细胞结构。固定剂通过防止降解，并通过交联稳定蛋白质和脂质结构，从而保持组织结构和形态52,53。不同类别的固定剂，例如基于醛类的固定剂与有机溶剂，具有不同的渗透性和交联效率，并通过作用于不同的功能基团，对抗体与靶标的识别产生差异性影响53,54。IFM解剖适用于多种固定方法，包括4%多聚甲醛（PFA）、9%乙二醛和甲醇固定（图6），这凸显了该解剖方案的通用性。

为了比较不同固定方法对肌节大小和形态的影响，对1日龄成年w1118果蝇进行半胸腔解剖。比较了在磷酸盐缓冲液（PBS）中使用4% PFA固定（图6A，E）与在松弛溶液（RS）中使用4% PFA固定的差异（图6B，F）。松弛溶液含有ATP，推荐在量化肌节尺寸时使用，以将肌节保持在其松弛状态20，55（见补充文件1）。4% PFA固定能有效保存肌节形态，但在PBS与RS中进行4% PFA固定时，肌节宽度存在显著差异（图6I，J）。甲醇固定可保留肌纤维和肌节结构（图6C，G），但与4% PFA固定相比，肌节显著更短且更细（图6I，J）。间接飞行肌（IFMs）可通过过夜9%乙二醛固定有效保存（图6D，H）（3%乙二醛固定无效），与4% PFA固定相比，该方法也显著改变了肌节宽度（图6I，J）。综上所述，IFM半胸腔可用多种固定剂有效保存。然而，由于固定剂和缓冲液均可能影响肌节尺寸的测量结果，实验设计应包含适当的对照，并采用明确且一致的固定方案。

IFMs 中常见的解剖与固定伪影

显微镜技术的一个挑战，尤其是对于新手用户和受训人员而言，是区分技术假象与真实样本特征 确凿的 表型。为了帮助区分这一差异 果蝇 IFMs，展示了最常观察到的伪影和解剖失败的代表性数据（图6）。固定步骤需要优化固定剂的类型、浓度和固定时间，以避免固定不足或过度固定52,53,54. 采用固定时间进程的 w1118 1天龄成虫半胸壁解剖样本在含4%多聚甲醛的松弛液中固定，观察发现，15分钟或30分钟的固定时间可准确保存肌节形态，而7分钟固定则导致肌节形态不一致（图6K-M）。此外，组织在较短的固定时间下会变得较不坚硬，使得在不损伤间接飞行肌（IFMs）的情况下切割和切开胸腔更加困难。在切割和装片过程中均可能产生额外的人为假象。如果刀片钝化导致组织撕裂或磨损，间接飞行肌的肌纤维结构可能显得不规则。图6N）或刀片打滑或切割角度倾斜时（图6O）。如果镊子在操作或装片过程中直接接触固定后的间接飞行肌（IFMs），会留下压痕，导致出现凹陷或拉伸，甚至可能将肌节拉开。图 6P）。在切割、操作或制片过程中对胸段施加拉伸或形变，也会将肌节拉开，导致Z线界限不清或消失图 6Q最后，使用镊子或刀片对间接飞行肌（IFMs）进行“锯切”或“摩擦”操作会导致肌原纤维磨损、松散、 fray（末端散开）以及结构紊乱，尤其在肌纤维表面表现明显。图6R潜在用户应熟悉这些技术伪影，并在表型分析中将其排除。

IFMs中SmnE33表型的发育进程

开放式书本切开法和半胸腔解剖法特别适用于追踪肌肉表型的发育轨迹，并精确定位目标基因在发育过程中发挥作用或肌原纤维表型出现的时间点。SmnE33 是RNA结合蛋白“运动神经元存活蛋白”（Survival motor neuron，Smn）的一个功能减弱等位基因，其间接飞行肌（IFM）发育表型作为代表性数据，展示了开放式书本切开法和半胸腔解剖法的广泛应用价值39。

形成剪接体的小核核糖核蛋白（snRNPs）是一种催化mRNA剪接反应的大型复合物7，其组装依赖于SMN复合物。SMN复合物由运动神经元存活蛋白（Smn）和Gemin蛋白组成，在所有生物体中均为生存所必需56。人类SMN水平降低会导致严重的遗传性神经肌肉疾病——脊髓性肌萎缩症（SMA）21。Drosophila已被用作研究SMA病因及Smn细胞功能的模型，其中包括构建功能减弱等位基因SmnE33的研究。SmnE33果蝇虽可存活且具有生育能力，但无法飞行或跳跃39。尽管SmnE33果蝇存在运动神经元分支缺陷，但也表现出间接飞行肌（IFM）结构紊乱以及飞行肌特异性肌动蛋白Actin88F表达的丧失39,57。在果蝇和小鼠中，SMN与α-辅肌动蛋白（alpha-actinin）在Z盘中共定位39，提示Smn可能具有肌肉特异性的功能。

为了更好地了解在肌肉发育过程中肌原纤维结构何时丧失以及何时需要Smn功能，对发育时间进程进行了分析 SmnE33 在26 h APF、72 h APF以及1至5日龄成虫的IFMs中进行了表型分析。而对照组 w1118 72 h APF 和成虫期的 IFMs 均具有强烈的鬼笔环肽染色的 F-actin 信号（图7E，E'，I，I'）以及规则的肌节结构（图7GG，K，K'），鬼笔环肽信号显著减弱（图7F，F'，J，J'）且不存在肌节结构（图7H，H'，L，L）在 SmnE33 IFMs。F-肌动蛋白则在细胞核周围呈现网状结构，或在细胞质中形成不规则束状或“星爆”状结构。图7H，H'，L，L')，与 Act88F 表达的丢失一致18,39 以及无法组装细丝。通过开放式解剖来检查 SmnE33 26 h APF 时的表型，并揭示早期 IFM 发育在 SmnE33。与……相当 w1118 对照组间接飞行肌（IFMs）图7AA', C, C'), SmnE33 果蝇每个半胸节有6条背侧纵向下IFM纤维，在肌原纤维形成之前于肌纤维周边形成有序的F-肌动蛋白束 (图7B，B'），并在整个肌纤维中呈现网状的F-actin结构（图7D，D'这些结果表明，间接飞行肌（IFM）分化的早期阶段能够正常进行，而Smn在IFM发育的后期阶段对于维持Act88F的表达和肌节的构建是必需的。重要的是，这些代表性结果展示了通过敞胸制备法（open-book）和半胸壁解剖法所能达到的表型细节水平和分辨率。

Drosophila thorax dissection process using scissors and forceps; anatomical diagram and steps shown.
图1成年个体间接飞行肌的半切解剖 (A将一只成年果蝇置于载玻片上的1×PBS中。B) 使用镊子（青色，圆点）固定果蝇，用剪刀（橙色）去除头部。(C-E) 去除左侧 (C）和右侧（D）翅和腹部（E). (F弃去头部、腹部和翅膀，将胸部转移至固定液中。 (G，H将固定好的胸部样本置于载玻片上的一滴1×PBS-T中，使其后端（P）和小盾片朝上G），使用镊子固定方向（H). (我-K使用冷冻切片机刀片将胸部沿中线切开（I-J），得到两个胸部半切片（K）。L) 冷冻切片机刀片与胸部示意图，展示产生半切面的矢状切面位置。将刀片向右滑动，切取胸部小盾片处的凹口，然后沿平滑路径向下移动（黄色箭头），以切割胸部（红色虚线）。M,N) 胸部冠状面（M）和横断面（N）示意图，显示主要肌群的位置以及切割位置（位于黄色三角形之间）。图中注明胸部的方向（L，左侧；R，右侧；V，腹侧；D，背侧；A，前侧；P，后侧）。比例尺 = 1 mm。 请点击此处以查看此图的放大版本。

Drosophila pupal development stages and lethality analysis; features, pigmentation changes chart.
图2蛹期分期及蛹发育特征 (A雄性与 (B雌性蛹在出蛹后0-2小时可被识别为白色预蛹。雄性蛹在后端可见成对的圆形透明结构（发育中的睾丸）（箭头所示）。C蛹期发育特征一览表。特征包括蛹壳成熟、头部外翻、蛹体脱离蛹壳、复眼色素形成、刚毛、翅、足、下外生殖器及体壁的色素沉积，以及处女斑（胎粪）的可见性。复眼颜色和色素沉积随发育进程逐渐加深。表中各列顶部标注的蛹期发育时间与阶段（时间点以黑色文字表示，对应的蛹期发育阶段以蓝色文字列于其下）此前由 Bainbridge 和 Bownes 定义。19,41. (D-E) 完整红眼蛹在羽化后0-2小时、24小时、48小时、72小时和96小时的蛹期发育时间进程（D； Mef2-Gal4，fln-GFP）以及从蛹壳中解剖出的具有橙色眼睛的蛹（E； Fln-Gal4）。注意从羽化后48小时到96小时眼睛和刚毛逐渐变暗的过程。（F蛹期致死在发育早期、中期和晚期时间点的示例。Pharate致死果蝇已完全成形，但未能完全从蛹壳中羽化。比例尺 = 1 mm。 请点击此处以查看此图的放大版本。

固定用蛹胸部的制备；分步示意图；使用镊子和剪刀进行解剖。
图3：蛹期间接飞行肌（IFMs）的半切解剖（>48 h APF）。（A-H）从蛹壳中取出蛹。将蛹固定在双面胶带上（A、B）。用镊子在前端脊处轻轻撬开（C），然后移除盖膜（operculum）（D），操作使用Dumont #5镊子（蓝色，箭头表示移动方向，圆点为固定点）。用镊子将蛹壳剪开（E）并逐条剥离（F）（G）。剥离下的蛹壳条粘附于双面胶带上。暴露腹部后，将蛹从蛹壳中提起（H）。（I）示意图展示将蛹从蛹壳中解剖出来的过程。图中各步骤对应的图版已标注（底部）。红色虚线标示了可插入镊子而不损伤蛹体的位置，用于剪开蛹壳。（J-L）将蛹从蛹壳中取出（J）后，转移至载玻片上的一滴1×PBS中（K），使用剪刀切除腹部（L）。（M）弃去腹部，将胸部转移至固定液中。（N）固定后，将蛹胸部转移至载玻片上的一滴1×PBS-T中。使蛹背面向上，并用镊子固定。（O-P）使用冷冻切片机刀片（O）进行蛹体半切（P）。切割位置与图1 M-N相同。比例尺 = 1 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

Isolation of IFMs: dissecting pupae, epithelial leaflet removal, scissors and forceps, experimental diagram.
图4：蛹期间接飞行肌的开放式解剖<48 h APF (A) 去除蛹壳后取出蛹，如图所示 图3 A-I将蛹转移至黑色硅胶解剖皿中的1×PBS溶液内。 (B-D) 用镊子轻轻将蛹推至硅胶培养皿表面（B），并用两枚昆虫针将腹面朝上固定C,D). (E使用剪刀（橙色）剪开头部的基底膜（bm）和角质层。 (F，G沿右侧剪开 (F）和左侧（G）侧。切割位置如图（Q）所示。H，I用镊子提起腹侧部分（H）并用剪刀移除I). (J,K用镊子取出脑（J）、侧部躯干气管和肠道（K）。L-M使用移液器以缓冲液轻柔冲洗，去除脂肪体并暴露间接飞行肌（IFMs）。N将胸部切分为两片瓣状结构。O,P剪下小叶并转移至固定液中。 (Q) 开放式解剖步骤示意图总结。每个步骤对应的图示面板已标注（底部）。提供背面和侧面视图，以说明在蛹体左右两侧进行切口（红色虚线）的位置。通过翅、足和喙（已标注）来区分蛹的背侧与腹侧。 请点击此处以查看此图的放大版本。

Coverslip mounting process; diagram; thorax orientation; glycerol use; sealing wet-mount slides.
图5显微镜载玻片上的样品制备 (A-D使用盖玻片间隔物来封片较厚的胸部半切样本。甘油（A) 用于将垫片（#1 盖玻片）固定到标记的载玻片上（B），并将样品置于垫片之间的空间内，用封片介质封片C）。晚期蛹和成虫的胸部需要两个#1盖玻片间隔物（D）。中期蛹阶段的样本需使用一个#1盖玻片垫片，而早期蛹的解剖样本则可不使用垫片进行封片。E-H) 成年半胸样本用镊子或画笔转移至封片剂中（E）。胸段最初呈随机排列（F），可能需要使用镊子翻转G）以便将IFMs朝上置于盖玻片下方（H). (我-L) 使用镊子将早期蛹期开放式书状解剖的叶状组织转移至载玻片上进行封片（I）。叶状组织呈随机方向排列（J）并可使用镊子翻转（K）使IFMs朝上面对盖玻片（L). (M-P) 样品正确放置后，将盖玻片（M）覆盖在样品上，并轻轻敲击使其与间隔物齐平 (N）。用封片剂填充样品周围O），注意避免产生气泡。用指甲油密封盖玻片和间隔物的所有开放边缘（P) 以避免封片剂蒸发。Q-R正确安装的成年果蝇胸部样本图像 (Q，10 倍放大倍数）放置，使 IFM 朝上紧贴盖玻片R，20倍放大倍数）。(S完成的载玻片示意图，样品在间隔物之间以IFM面朝上放置，指甲油密封所有开放边缘。 请点击此处以查看此图的放大版本。

肌节固定分析；示意图和箱线图比较不同固定方法对长度和宽度的影响。
图6：间接飞行肌解剖适用于多种固定剂。（A-H）对照组w1118 成年果蝇间接飞行肌（IFM）的肌纤维结构共聚焦z投影图像（A-D），或肌原纤维及肌节结构的单平面图像（E-H）。半胸壁解剖可兼容多种固定方法，包括磷酸盐缓冲液（PBS）中的4%多聚甲醛（PFA）（A、E）、松弛液（RS）中的PFA（B、F）、甲醇（C、G）或9%乙二醛溶液（D、H）。DAPI（1:1000），蓝色；鬼笔环肽（1:500）染色F-肌动蛋白，灰色。（I,J）基于图像E-H对肌节长度（I）和宽度（J）的定量分析。固定方法及缓冲液显著影响肌节长度与宽度的测量结果。甲醇固定的肌节长度为3.040 ± 0.2935 µm，显著短于PBS中PFA（3.271 ± 0.2736 µm）、RS中PFA（3.190 ± 0.2586 µm）和9%乙二醛固定（3.217 ± 0.2023 µm）的测量值（p < 0.001）。所有测试的固定方法之间，肌节宽度均存在显著差异（PBS中PFA：1.410 ± 0.1331 µm；RS中PFA：1.284 ± 0.2514 µm；甲醇：1.280 ± 0.1538 µm；9%乙二醛：1.137 ± 0.2032 µm）。箱线图采用Tukey须线，异常值数据点以黑点标出。显著性通过ANOVA结合事后Tukey检验确定（**，p < 0.01；***，p < 0.001）。（K-M）成年w1118果蝇在RS中4% PFA固定不同时间的单平面共聚焦图像，显示与7分钟固定（K）相比，15分钟（L）或30分钟（M）的固定时间可获得良好且一致的肌节结构。（N,O）成年Act88F-Gal4果蝇IFM在4% PFA中固定后的z层叠投影图像，显示肌纤维中常见的解剖伪影。常见伪影包括因刀片钝化导致的切断、毛边或部分缺失的肌纤维（N），或因切割角度不当造成的斜切（O）。（P-R）成年w1118 样本在PBS中4% PFA固定后的单平面共聚焦图像，显示肌节和肌原纤维中常见的技术性伪影。常见技术伪影包括封片过程中镊子接触导致的肌节不规则拉伸（P）、纵向切开时过度拉伸使Z线错位（Q），以及因摩擦或刀片钝化导致的肌原纤维毛边、紊乱或卷曲（R）。DAPI（1:1000），蓝色；鬼笔环肽（1:500）染色F-肌动蛋白，灰色。比例尺 = 100 µm（A-D、N-O），5 µm（E-H、K-M、P-R）。请点击此处查看该图的放大版本。

Microscopy analysis of Drosophila pupal and adult muscle structure, DAPI, and phalloidin staining.
图7：应用解剖技术研究发育中IFM的表型 SmnE33. (A-D) 早期蛹期（出翅后26小时）的肌肉结构。单平面共聚焦图像显示肌纤维结构（A, A', B, B'）以及肌原纤维和肌节结构（C, C', D, D'对照组中的）A, A', C, C'）和 SmnE33(B, B', D, D'）。对照组和 SmnE33 每个半胸节具有六条IFM肌纤维，并形成F-肌动蛋白束。 (E-H晚期蛹体在羽化后72小时的肌肉结构。对照组中肌纤维结构的Z投影图像（E, E'）和 SmnE33 (F, F'）。IFMs 在 SmnE33 根据DAPI染色可见细胞存在，但缺乏强烈的F-actin信号。单平面共聚焦图像显示，对照组IFM具有高度有序的肌节结构（G，G'相比之下， SmnE33 IFMs（H, H'）具有异常的星状F-actin结构（黄色箭头），且缺乏对照组间接飞行肌（IFMs）中所见的有序肌节结构。我-L对照组成年肌肉结构（我, I', K, K'）和 SmnE33(J, J', L, L'). Z轴投影（I, J）以及单平面共聚焦图像（K,L) 显示F-actin含量显著减少以及肌动蛋白结构异常（黄色箭头） SmnE33IFMs。DAPI（1:1000），蓝色；鬼笔环肽（phalloidin，1:500）染色F-actin，品红色或灰色。比例尺 = 50 µm（A, B），10 µm（C, D, G, H, K, L），100 µm（E, F, 我, J). 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充文件 1：本文所用固定和染色方法的详细说明，特别是用于生成图 6和图 7中所示数据的方法。文中还包含了有关确定一抗稀释比例的附加信息，并提供了本实验方案中所用缓冲液组分及配方的列表。这些数据为解剖方案的设计提供了依据，并展示了其在共聚焦显微镜观察及发育期间接飞行肌（IFM）表型分析中的实用性。请点击此处下载该文件。

补充图1：成年果蝇间接飞行肌半胸腔解剖步骤的流程图。 对图1中步骤的文字性总结，用于制备半胸腔间接飞行肌切片。解剖、固定并沿中线切开胸腔后，对组织切片进行染色，以用于显微镜分析。请点击此处下载该图。

补充图2：蛹期间接飞行肌半胸解剖步骤的流程图。 对图3中步骤的文字性总结，用于制备蛹期间接飞行肌的半胸切片。从蛹壳中取出蛹体后，进行固定、沿中线剖开并染色，以用于显微观察。请点击此处下载该图。

补充图3：早期蛹期间接飞行肌开放书式解剖步骤的流程图。 对图4中所示步骤的文字总结，用于在48小时蛹前龄（APF）之前完成蛹期间接飞行肌的开放书式解剖。解剖并固定后，带有附着间接飞行肌的上皮瓣用于显微镜染色观察。请点击此处下载该图。

讨论

本方案介绍了对黑腹果蝇（D. melanogaster）成虫（图1） 以及晚期蛹（48 h - 96 h APF）（图3）间接飞行肌（IFMs）进行半胸腔解剖，以及对早期蛹（8 h - 48 h APF）（图4）IFMs进行开放式书本状解剖的操作流程。本方案特别适用于免疫组织化学和荧光显微镜分析。文中配有解剖步骤的示意图和分步照片，以直观展示操作过程。总体示意图的加入进一步提升了本方案的可读性，便于刚进入果蝇（Drosophila）研究领域的科研人员、本科生及初级研究人员学习掌握。此外，文中还提供了固定不良和样品制备伪迹的典型示例，帮助使用者区分人为伪迹与真实的肌节表型（bona fide sarcomere phenotypes）。

IFM半胸腔解剖中最困难的步骤是将胸部沿中线切开（图1I、J、L 和 图3O）。该步骤需要花费时间和反复练习才能掌握。切割时，为获得额外稳定性，可将单个胸部样本置于双面胶带上进行切割36，但需注意避免IFM组织干燥。也可从胸部腹侧进行切割，将背侧朝下放置，以便新用户测试哪种方法在其实验条件下更为有效。切割应使用新的锋利刀片，以避免损伤IFM，当刀片变钝时应及时更换。本方案采用切片机（冷冻切片机）刀片对胸部进行干净利落地切割，而不同于其他使用针、镊子或手术刀片的方法24,32,36。剃须刀片是实现胸部干净切开的另一种替代选择。在切开前，固定步骤同样至关重要，因为轻微固定的组织虽然结构保存稳定，但可能呈"柔软易压"状态，从而更难切割。固定时间控制在30–60分钟，可在抗原可及性与组织硬度之间取得平衡，有利于切割操作；有经验者可将固定时间缩短至15分钟。

半胸壁制备方法的一个局限性在于抗体的渗透。半胸壁是较厚的样品32，而最佳质量的共聚焦显微图像通常仅能从IFM的最表层10–20 µm范围内获得42,58。去污剂浓度过低或通透时间过短都可能导致染色微弱且不一致。延长一抗孵育时间（2–3天）也有助于改善抗体渗透。使用双光子系统或工作距离更长的物镜也可增加成像深度59。如果实验者需要对IFM肌纤维的完整直径进行成像，应考虑采用其他方法，例如在矢状面进行切片机24,58或冷冻切片27处理。

主方案中未涉及的一个重要方面是图像数据分析。对于在10倍或20倍图像中IFM肌纤维的分析（图6A-D、图7A、B、E、F、I、J），标准分析包括判断肌纤维是否附着，以及肌纤维的整体形态是否完整37,38。可根据实验需求进行定量的参数示例包括肌纤维的长度、宽度、数量、附着数量或撕裂肌纤维的数量37,60。本方案的一个主要优势是与荧光显微镜兼容，能够在60倍或100倍的更高放大倍数下分析肌节和肌原纤维的形态（图6E-H、图7C、D、G、H、K、L）。肌节形态的分析应基于无技术性伪影的样本进行（图6K-P）。已有研究预先定义了多种可能的肌原纤维和肌节表型类别60。最常用的测量方法是通过图像处理软件手动绘制并测量Z盘到Z盘之间的直线距离，或者使用若干种可免费获取的自动化工具进行测量18,45,61。通过引入标记Z盘或M线、粗肌丝或细肌丝的探针，可进一步提升肌节形态的评估效果30,34,58。这些数据可用于定量描述采用本解剖方案制备的对照样本与测试样本之间在肌纤维、肌原纤维及肌节表型上的差异。

实验操作者应注意，固定虽然能够保存肌纤维和肌节的形态，但固定剂、缓冲液以及封片介质可能导致组织收缩或肿胀，从而影响形态学参数的测量45。用于透射电镜的戊二醛固定和脱水过程已知会引起肌节直径缩小43，而纤维去膜和甘油化处理则已被证明会增加肌节直径44,45。这一现象可能是文献中肌节参数存在差异的原因之一，也凸显了在每次实验中同时设置对照样本和测试样本的重要性。为准确比较肌节的定量参数，对照组和实验组的间接飞行肌（IFM）应在相同的缓冲液中同步处理。

本详细方案旨在使初学者和高级果蝇研究者更易于掌握成虫和蛹期间接飞行肌（IFM）的免疫组织化学与荧光显微镜观察解剖技术。该方案也可根据需要调整用于其他昆虫，以及适用于其他成像技术，例如冷冻电子显微镜（cryo-EM）、单分子荧光原位杂交（smFISH）或空间转录组学。结合强大的Drosophila遗传学工具与荧光显微镜技术，可为研究肌发生及肌肉功能的保守机制提供独特的机会。由于间接飞行肌同样适用于分子与生物化学方法26,27，未来将分子表型与肌肉形态、细胞生物学及功能关联的研究将有助于更深入地理解肌发生过程以及肌肉疾病的病因学。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Gregory Matera 提供 SmnE33 等位基因，并就 Smn 相关研究进行了有益的讨论。作者感谢 Frank Schnorrer、Cornelia Schoenbauer、Manuela Weitkunat 和 Aynur Kaya-Copur 提供的宝贵建议与支持。作者感谢布卢明顿果蝇品系中心（Bloomington stock centre）提供果蝇品系。本研究得到了密苏里大学堪萨斯城分校（UMKC）科学与工程学院生物与生物医学系统系（MLS）、UMKC 卓越研究资助计划（MLS）以及 UMKC 本科生科研与创意奖学金办公室（SF, MLS）的启动资金支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
60 mm 组织培养皿Fisher ScientificFB01292160 mm，聚苯乙烯
冰醋酸（ACS 认证）Fisher ScientificA38S-212
三磷酸腺苷（ATP）Millipore SigmaA1852
重型铝箔Amazon12 英寸 × 1000 英尺
黑色硅胶解剖皿：活性炭粉末Millipore SigmaC9157大多数药店也可购买
黑色硅胶解剖皿：Sylgard 184Millipore Sigma761036制备硅胶解剖皿时，将 Sylgard 组分放入自封袋中充分混合。向约 50 g Sylgard 中加入约 200 mg 活性炭粉末，充分混合，剪去袋角，填充至 60 mm 培养皿中，用移液器吸头去除气泡，并过夜固化。 
纸板载玻片托盘，Research Products International CorpFisher Scientific50-136-7558
共聚焦显微镜，Nikon AXR 倒置共聚焦显微镜Nikonwww.microscope.healthcare.nikon.com/
共聚焦显微镜，Zeiss LSM 780 倒置共聚焦显微镜Zeisswww.zeiss.com
Darwin 昆虫饲养培养箱（培养箱）Fisher Scientific/Darwin ChambersIN034可控制光照、温度和湿度的培养箱
解剖皿（黑色玻璃）Mikroskop Technik Diethelm398011Lymphbecken（染色皿/淋巴槽），黑色玻璃，4×4 cm，带透明玻璃盖
Dumont #3 镊子Fine Science Tools11231-30Dumoxel 直头镊子，12 cm，尖端尺寸 0.17 × 0.1 mm 
Dumont #5 镊子Fine Science Tools11252-20Inox 直头镊子，11 cm，生物学级，尖端尺寸 0.05 × 0.02 mm 
EGTA（乙二醇双四乙酸）Millipore Sigma324626
乙醇，无水（200 证明）Fisher ScientificBP28184分子生物学级
Fisherbrand 优质盖玻片（18 × 18 mm）Fisher Scientific12548A玻璃，方形，#1 厚度（0.13 - 0.16 mm）
Fisherbrand 优质盖玻片（22 × 22 mm）Fisher Scientific12548B玻璃，方形，#1 厚度（0.13 - 0.16 mm）
平底细胞培养板（24 孔）Fisher Scientific7200740
荧光解剖显微镜相机，Infinity8 相机Teledyne (Visual Dynamix)600 万像素，低光照，单色
果蝇：Smn[E33]果蝇品系；由 Gregory Matera 惠赠
果蝇：w[1118]Bloomington Stock CenterRRID:BDSC_3605果蝇品系
甘油Fisher ScientificBP229-1分子生物学级
乙二醛溶液（40 wt. % 水溶液 H2O）Millipore Sigma128465 此为 40% 储存液
图像处理软件，Affinity Designer 2Affinityhttps://affinity.serif.com/en-us/
图像处理软件，Image J (Fiji)ImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
昆虫针Fine Science Tools26002-10不锈钢，直径 0.1 mm（微细针）
氯化镁（MgCl2）Fisher ScientificAA12315A1
甲醇（HPLC 级）Fisher Chemical (Fisher Scientific)A452-4使用前于 -20 °C 冷却
载玻片，磨砂面Fisher Scientific12-550-400可书写区域，不带电荷，75 mm × 25 mm × 1 mm
载玻片，普通玻璃Fisher Scientific12-544-4预清洁，75 mm × 25 mm
MX35 超薄切片机刀片epredia (Fisher Scientific)3053835低剖面，34° 切割角；C35 feather 80 mm 刀片效果良好
透明指甲油（Sally Hansen Xtreme Wear 指甲油）Amazon0.4 液体盎司
正常山羊血清Millipore SigmaS26-LITER
摇床（Mini Nutating Rocker，Benchmark）Midwest ScientificH3D1020固定转速 24 rpm；平台尺寸 8 × 6 英寸，带凹陷垫
画笔（圆头 0 号）Amazon0 号圆头或类似美术用刷
多聚甲醛（PFA）Millipore Sigma158127-500G
磷酸盐缓冲液（PBS）：KClMillipore Sigma529552-250GM根据 Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247 配制 PBS
磷酸盐缓冲液（PBS）：KH2PO4Millipore SigmaP0662-500G根据 Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247 配制 PBS
磷酸盐缓冲液（PBS）：Na2HPO4Millipore SigmaS9763-500G根据 Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247 配制 PBS
磷酸盐缓冲液（PBS）：NaClFisher Chemical (Fisher Scientific)S271-1根据 Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247 配制 PBS
PR1MA 移液器吸头（10 µL）Midwest ScientificPR10XLRK-NS通用 10 µL 移液器吸头
PR1MA 移液器吸头（1000 µL）Midwest ScientificPR-1000RK-FL通用 1000 µL 移液器吸头
PR1MA 移液器吸头（200 µL）Midwest ScientificPR-200RK-NS通用 200 µL 移液器吸头
罗丹明-鬼笔环肽Invitrogen, Molecular ProbesR415
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