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方法文章

探索基于表面增强拉曼散射的单个sEV生物传感在疾病诊断与治疗中的应用

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⸱

DOI：

10.3791/69258

⸱

2026年3月13日

 ,  ,  , 
1Department of Materials Science and Engineering, University of California Los Angeles, 2Cornea Division, Stein Eye Institute, University of California Los Angeles

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用无标记表面增强拉曼光谱法（SERS）分析单个小细胞外囊泡（sEVs）的实验方案，该方法可实现疾病无创诊断，并评估sEVs作为治疗递送载体的应用潜力。

摘要

本方案介绍了一种全面的无标记检测平台，通过将表面增强拉曼光谱（SERS）与机器学习（ML）相结合，实现对单个小细胞外囊泡（sEVs）的检测及其分子特征分析，用于诊断和治疗应用。该方法首先采用尺寸排阻色谱法或超速离心法分离sEVs。分离得到的囊泡随后在工程化的等离子体金纳米金字塔二维阵列基底上进行分析，该基底具有单囊泡检测灵敏度。通过利用内源性拉曼生化指纹图谱，本方案可在无需外源标记的情况下实现高特异性检测。在获取拉曼光谱后，数据经过预处理，并采用训练好的机器学习算法（如LDA、SVC）进行分析，以分类疾病状态，成功利用来自组织、血浆和唾液的sEVs将胃癌患者与健康对照组区分开来，分类准确率分别为90.1%、70.9%和60.7%。此外，通过量化单个sEV中阿霉素的载药量，展示了该方法在治疗领域的应用潜力，其中采用石墨烯包覆基底作为内标，提高了测量的准确性。该方法可实现高通量分析，能够捕捉群体异质性，对于早期疾病检测以及在单囊泡水平上理解药物装载效率至关重要。

引言

小型细胞外囊泡（sEVs），通常大小在30至200之间 直径为 nm 的细胞外囊泡天然分泌至生物体液中，携带源自其母细胞的蛋白质、脂质和核酸1,2,3作为存在于唾液、尿液及其他体液中的非侵入性生物标志物4它们在疾病早期诊断、预后评估及治疗监测方面具有广阔前景，尤其在肿瘤学领域。5,6,7然而，由于它们在复杂的生物基质中具有高度异质性和低丰度，其临床转化受到阻碍8为克服此类挑战，本方案采用表面增强拉曼光谱法（SERS），这是一种强大的分析技术，可将拉曼散射信号增强高达1010-1011 次 通过 等离激元基底9,10,11SERS 捕获内在分子 "指纹" 在数秒内获取单个sEV的光谱，实现超灵敏的单囊泡分析，同时避免长时间的检测过程。

我们的方法协同结合了基于无标记的表面增强拉曼散射（SERS）技术，以实现对单个小型细胞外囊泡（sEVs）快速且超灵敏的表征12,13,14,15,16。无标记SERS可捕获内在的生化特征，当与线性判别分析（LDA）、支持向量分类（SVC）等机器学习模型结合时，已被证明能够高特异性地区分来源于健康细胞与病变细胞的sEVs13。为进一步提高本平台的可重复性与定量能力，该方法完全兼容石墨烯覆盖的拉曼基底16。单层石墨烯提供化学均一的表面，可稳定等离激元热点并增强分子吸附17,18，更重要的是，单层石墨烯可作为SERS信号的"内置"标尺12,19，从而实现对检测分子的定量分析。尽管拉曼激光束直径（~ 1 µm）大于典型的sEV，但由于物理机制与统计机制的独特协同作用，本平台仍可实现有效的单囊泡分辨率。准周期性金纳米金字塔基底产生尺寸小于100 nm的高度局域化等离激元"热点"，以超线性方式放大拉曼信号12。因此，在激光束范围内最接近最强热点的sEV所产生的信号在光谱中占主导地位。此外，扫描电镜（SEM）成像证实sEVs分布稀疏（> 1 µm间隔），最大限度减少了光谱重叠，而拉曼强度图谱显示信号定位与单个囊泡的尺寸相符13,14。这些特性共同确保了每条采集的光谱主要对应单个sEV，从而实现具有统计稳健性的无标记单囊泡分析。与传统方法（如需要大量样本且无法分辨单个囊泡的蛋白质印迹、质谱或常规拉曼散射）相比20，我们的单囊泡SERS平台在灵敏度、通量和分子分辨率方面具有显著优势。该工作流程适用于致力于开发微创、高分辨率诊断工具，或在个体化治疗研究中探索sEV异质性及药物负载效率的研究人员。在本方案中，我们展示了该SERS平台如何利用单个sEV实现疾病检测和治疗应用，特别是在癌症研究中的应用，包括囊泡分离、等离激元基底制备、拉曼信号采集以及基于机器学习的数据分析在内的完整工作流程。

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方案

人体标本的采集严格遵循《赫尔辛基宣言》进行，并已获得加州大学洛杉矶分校机构审查委员会（IRB）的批准。所有供体在参与研究前均签署了书面知情同意书。

注意：本研究共使用了4种细胞系，分别为AGS（CRL-1739）、A549（CCL-185）、NCI-N87（CRL-5822）和Hs 738.St/Int（CRL-7869），均购自商业供应商。这些细胞系的培养和传代均严格按照供应商提供的说明和试剂进行。收集条件培养基后，于-20 °C保存，待后续处理。在韩国三星医疗中心，志愿者自愿捐献了组织、血浆和唾液样本。胃癌组织样本在手术切除过程中获取，而非癌症对照组的活检样本则通过内窥镜采集。via标准临床操作规程，使用EDTA管收集血浆。每位受试者采集约 5 mL未刺激的全唾液，随后在 4 °C条件下以2,600 × g离心15 min。为保护细胞外RNA，上清液中加入SUPERase-In RNase抑制剂至终浓度为20 U/mL。所有样本均在-80 °C保存，直至进一步处理。sEVs根据既定方案从条件培养基和临床样本中分离21。

1. sEV 的分离与表征

  1. 制备sEV样品
    1. 将澄清的细胞培养上清液在室温下完全解冻。
    2. 将上清液通过无菌的0.22 µm注射器滤器，以去除碎片和较大的污染物。
    3. 用1× PBS溶液平衡35 nm尺寸排阻色谱（SEC）柱。
    4. 加入500 µL过滤后的样品至层析柱中。
    5. 根据制造商说明书，用1×PBS洗脱样品。
    6. 收集富含EV的组分，并将其置于干净的小瓶中，在−20 °C下保存。
  2. 测定颗粒浓度与粒径
    1. 将sEVs样品用无菌DPBS稀释至最终颗粒浓度为107-109 颗粒/mL
    2. 使用纳米颗粒跟踪分析仪，对每个样本记录5段60秒的视频。相机灵敏度设为14，恒定流速设为25。
    3. 使用仪器配套软件分析视频，应用稀释因子以确定最终颗粒浓度（particles/mL）和平均直径（nm）。
  3. 表征四跨膜蛋白表达
    1. 预先扫描人源四跨膜蛋白芯片（1 cm × 1 cm，预包被抗CD9、抗CD63和抗CD81抗体），以建立基线信号。
    2. 将稀释后的sEV样品加入芯片中，置于密封的24孔板内，室温孵育过夜。
    3. 加入35 µL检测抗体（anti-CD9 CF488、anti-CD63 CF647、anti-CD81 CF555），室温孵育1小时。
    4. 按照制造商的方案清洗芯片。
    5. 使用生物标志物表征读取仪及其配套扫描软件检测囊泡四次跨膜蛋白的表达水平。
  4. 通过透射电子显微镜确认sEV形态
    1. 用约100 µL的4%多聚甲醛固定约100 µL sEVs，孵育30分钟。
    2. 将约100 µL固定后的sEVs加样至300目铜网上，孵育5分钟。
    3. 用去离子水冲洗载网。
    4. 用蒸馏水配制的1%醋酸铀酰溶液（约20 µL）对载网进行染色。
    5. 用清水进行最后一次漂洗，并让载网自然完全晾干。
    6. 成像样品 通过 透射电子显微镜（TEM）用于确认小细胞外囊泡（sEV）的大小和形态。

2. SERS 等离子体基底的制备 12,18,19

  1. 制备纳米球单层膜
    1. 在朗缪尔-布洛杰特槽内的水面上铺展直径为500 nm的聚苯乙烯小球。
    2. 轻轻按压微球，形成紧密排列的六方单层结构。
    3. 将球形单层转移至一片4英寸Si晶圆（带有约50 nm热生长SiO₂层）上2通过将晶圆浸入槽中并缓慢向上提起。
  2. 蚀刻纳米球阵列
    1. 使用氧气等离子体（O₂）反应离子刻蚀系统将球体直径从500 nm减小至约250 nm2 气体流速为100 sccm，时间50 s，功率200 W。有关制备过程的更多细节，请参见我们此前发表的文献。12,18,19.
    2. 在收缩的球阵列上沉积一层50 nm的Cr层 通过 电子束蒸发，速率为每秒1.5 Å。
    3. 用丙酮去除聚苯乙烯小球，从而在SiO上留下带孔的Cr掩膜2 表面
    4. 刻蚀暴露的SiO2 在Cr开口处使用25 sccm Ar和25 sccm CHF的混合气体进行沉积3，射频等离子体刻蚀功率为200 W，持续2分钟。
  3. 制备倒金字塔结构
    1. 将晶圆浸入60 wt% KOH溶液中，在60 °C下反应2分钟，以在硅表面蚀刻出倒金字塔形凹坑。
    2. 使用铬刻蚀剂去除铬掩模，持续5分钟。
    3. 去除 SiO2 在6:1缓冲氧化物刻蚀液中刻蚀至完全清除。
    4. 采用电子束蒸发法在倒金字塔结构表面保形沉积一层200 nm的Au薄膜。
  4. 完成等离子体基底
    1. 将快干环氧树脂（约 1 mL）涂抹于另一片 SiO₂ 基底上2/Si 衬底。将镀金晶圆压在环氧树脂上，形成金层位于中间的三明治结构。
    2. 将环氧树脂从硅胶模具上剥离，待环氧树脂完全固化后，形成自支撑的金等离激元基底。

3. 将石墨烯转移至等离激元基底

  1. 制备石墨烯薄膜
    1. 配制 1 M FeCl₃ 溶液3 溶液（通过将81 g无水氯化铁溶解于水中，制备1 M的储备液）3 在去离子水中稀释至终体积500 mL，用于从PMMA包覆的单层石墨烯片上蚀刻铜基底。
    2. 将石墨烯涂层铜片正面朝下放置在 FeCl 溶液表面3 溶液直至铜完全溶解。
  2. 清洗石墨烯薄膜
    1. 使用洁净的玻璃载玻片，小心地将漂浮的石墨烯薄膜转移至去离子水浴中，以冲洗掉刻蚀剂残留物。
    2. 重复此洗涤步骤三次。
  3. 将石墨烯转移至基底
    1. 将SERS等离激元基底浸入最后一次去离子水浴中，使其位于石墨烯薄膜下方。
    2. 轻轻抬起基底，使石墨烯均匀地贴附在其表面。
    3. 室温下将石墨烯涂层基底风干1小时。
    4. 转移至真空干燥箱中，在180 °C、减压条件下干燥1小时。
  4. 清洁最终底物
    1. 将干燥的基底浸入50 °C的丙酮浴中1 h，以溶解PMMA。
    2. 用异丙醇将底物冲洗三次。
    3. 将清洁后并转移了石墨烯的等离激元基底在使用前置于干燥器中干燥。

4. SERS 样品制备与光谱采集

  1. 在基底上制备样品
    1. 用移液器将约 5 µL sEV 样品滴加到适当的等离子体基底上。
      注意：对于载药 sEV 的定量，应将囊泡施加到金-石墨烯基底上。对于所有其他实验，请使用普通的金等离子体基底。
    2. 将基底放入干燥器中，使液滴完全干燥（约 15 分钟）。
  2. 校准拉曼系统
    1. 将基底转移至共聚焦拉曼显微镜。
    2. 使用仪器软件（WiRE 版本 4.4）启动数据采集。
    3. 将激发激光设置为 785 nm，功率为 5 mW。
    4. 通过将硅参考峰对准 520 cm-1 来校准系统。
  3. 从金基底获取光谱（诊断用途）
    1. 在 300 µm × 300 µm 区域内进行初扫，使用静态模式定位单个囊泡，设置如下：50% 功率，0.1 s 曝光时间，步长 10 µm。
    2. 找到 sEV 后，在 5 × 5 网格内以静态模式进行高分辨率成像，设置如下：1 µm 步长，50% 功率，每点曝光 0.2 s。
  4. 从石墨烯基底获取光谱（治疗用途）
    1. 在 300 µm × 300 µm 区域内进行初扫，使用静态模式定位单个囊泡，设置如下：50% 激光功率，0.1 s 曝光时间，步长 10 µm。
    2. 在扩展模式下，使用 2 × 2 网格进行高分辨率成像，设置如下：1 µm 步长，1% 激光功率，每点曝光 10 s。

5. 数据预处理

  1. 进行光谱质量控制
    1. 筛查初始原始光谱，排除噪声过高或光谱形状异常的信号。
    2. 使用基于阈值的检测方法或局部偏差滤波法去除孤立的宇宙射线尖峰。
  2. 滤波并归一化光谱
    1. 对每条光谱应用Savitzky-Golay滤波器，以降低荧光背景并平滑数据。
    2. 计算每条光谱的信噪比（SNR），通常采用峰-基线比或标准差方法。进一步说明：通常将每条光谱的信噪比计算为代表性拉曼峰（基线扣除后）的峰强度与噪声标准差的比值。噪声通过从原始光谱中减去经Savitzky-Golay平滑处理后的光谱（窗口大小 = 11，多项式阶数 = 3）得到的残差光谱来估计，从而分离出高频波动。为经验性确定合适的SNR阈值，将所有光谱按SNR升序排列，并评估特征性生化峰——特别是苯丙氨酸峰（~1002 cm-1，氨基酸）、酰胺I峰（~1650 cm-1，蛋白质）和CH2变形峰（~1440 cm-1，脂质）——在排序后光谱中的持续存在情况。阈值设定为这些诊断峰之一持续消失于基线噪声中的临界点。对于本研究使用的金纳米金字塔SERS基底及采集参数（785 nm激发，5 mW激光功率，0.2 s积分时间），该经验阈值对应于SNR为28。
    3. 根据上述5.2.2节确定的SNR阈值，排除所有低于该阈值的光谱。在本工作流程中，SNR低于28的光谱将被排除在训练数据集之外，因为将阈值设在此水平可确保仅保留高质量光谱用于后续分析，并提高模型的鲁棒性。
    4. 将每条光谱归一化至最大峰强度或曲线下的总面积。

6. 机器学习光谱分析

  1. 训练模型
    1. 为每个光谱测量数据分配一个标签，以对应其来源（例如，胃癌患者 vs. 健康对照）。
    2. 将光谱数据输入具有线性核的支持向量分类器（Support Vector Classifier, SVC）中。
    3. 采用分层随机打乱划分方法进行5折交叉验证。
    4. 对每折的准确率指标取平均值，以评估模型性能。
  2. 降维与分类
    1. 使用线性判别分析（Linear Discriminant Analysis, LDA）将高维表面增强拉曼散射（SERS）数据在低维空间中可视化。
    2. 利用LDA模型对样本组之间进行直接分类。
  3. 评估模型
    1. 在一组独立保留的盲法患者样本上评估已训练的模型，以模拟真实世界中的诊断场景。更多详细信息，请参考我们课题组的以下文献13,15,22。
      注意：所有步骤均需使用洁净工具并在无尘环境中进行。单层石墨烯在铜基底上生长或采购获得，并涂覆一层PMMA以在转移过程中提供保护。

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结果

成功实施单囊泡SERS方案可获得来自单个sEV的独特拉曼光谱，从而实现下游的诊断分类及治疗性药物载荷监测。图1分别展示了利用本研究中所述方案进行胃癌诊断研究以及载药sEV监测应用的工作流程。

sEV isolation process, SERS measurement, and model training diagram for gastric cancer detection.
图1研究流程图 (A胃癌单囊泡SERS诊断工作流程。临床囊泡经分离后沉积于...

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讨论

该方案的一个关键环节是基底制备和小细胞外囊泡（sEV）的纯化。无标记表面增强拉曼散射（SERS）的性能在很大程度上依赖于制备均匀、高共形且具有强增强效应的等离激元基底。 "热点"同样，高纯度sEV的分离 通过 尺寸排阻色谱对于获得可靠且可重复的表面增强拉曼光谱（SERS）至关重要。蛋白质聚集体或脂蛋白等杂质不仅会削弱囊泡信号，还可能因引入光谱噪声而干扰后续基于机器学习的分类分析。

我们平台的一个显著优势是其经过验证的单囊泡分辨率，这对于克服小细胞外囊泡（sEV）异质性带来的挑战至关重要。尽管激光光斑大于单个囊泡，但由于金纳米金字塔结构带来的超线性信号放大效应，信号主要来自最接近等离激元热点的sEV。结合基底上较低的囊泡密度，可确保每个光谱代表单个sEV的分子快照。这一能力使得能够识别出在整体分析方法（如蛋白质印迹或质谱）中通常被掩盖的不同sEV亚群。

该方案的临床价值体现在其在同一患者队列的多种生物流体（包括组织、血浆和唾液）中的成功应用。我们的研究结果表明，尽管组织来源的sEVs提供了最高的...

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披露

作者声明，他们与本工作无任何利益冲突。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院国家转化科学促进中心的资助，资助编号为 4UH3TR002978-03 和 1U18TR003778-01，以及加州再生医学研究所（CIRM）的资助（资助编号 TRAN1-14649）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1x PBSThermo Fisher ScientificJ61196.AP
300目铜网Electron Microscopy SciencesEMS200-Cu
4% 甲醛溶液Sigma Aldrich1004960700
4″ 硅片 MSE SuppliesWA0810(100) 取向 
A549 细胞系ATCCCCL-185 
AGS 细胞系ATCCCRL-1739
离心机转子 F-35-6-30, 5430Eppendorf22654306
CHA Mark 40CHA Mark 40https://chaindustries.com/mark-40-system/电子束蒸发
铬蚀刻液Sigma Aldrich651826-500ML
阿霉素 D-4000LC LaboratoriesD-4000_3g
ExoView R100 系统及 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒NanoView Bioscienceshttps://www.nowmedicalstudios.
com/portfolio/nanoview-
biosciences-3d-product-illustrations
FeCl3 溶液Sigma Aldrich451649
HF 溶液Sigma Aldrich695068-500ML
Hs 738.St/Int 细胞系ATCCCRL-7869
inVia 共聚焦拉曼显微镜Renishawhttps://www.renishaw.com/en/
invia-confocal-raman-microscope
--6260?srsltid=AfmBOoqbZlyW
qv2KDdcXV0UZnp8tdLNgYZ0
GbZvGOWI6z1OKi48rg5-b
KOH 溶液Sigma Aldrich417661
MaxQ 4000 台式恒温/制冷摇床Thermo ScientificSHKA4000 (4320)
MCO-19AIC 培养箱SANYO8380-30-0035
Millex-GP 滤器MilliporeSigmaSLGPM33RS 0.22 µm
NanoSEM 230 显微镜FEISEM-FEI-014 
Nanosight NS300Malvern Panalyticalhttps://www.malvernpanalytical
.com/en/support/product-support
/nanosight-range/nanosight-ns300
NCI-N87 细胞系ATCCCRL-5822
Optima TLX 超速离心机Beckman Coulter8043-30-1197
Oxford Plasmalab 80 PlusOxford Plasmalabhttps://plasma.oxinst.com/
products/rie/plasmapro-800-rie
聚苯乙烯微球Alfa AesarAA42711AB500 nm
qEVoriginal/35 nmIzonICO-35
单层石墨烯MSE SuppliesME0408
T-75 培养瓶VWR156800
TF20 高分辨率电镜FEIhttps://eicn.cnsi.ucla.edu/project/fei-tf20-tem/
醋酸铀酰溶液Electron Microscopy Sciences22400-1

参考文献

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拉曼光谱小型细胞外囊泡sEV 分离机器学习分类等离激元基底金纳米金字塔阵列石墨烯基底阿霉素载药
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