探索基于表面增强拉曼散射的单个sEV生物传感在疾病诊断与治疗中的应用

摘要

本文介绍了一种利用无标记表面增强拉曼光谱法（SERS）分析单个小细胞外囊泡（sEVs）的实验方案，该方法可实现疾病无创诊断，并评估sEVs作为治疗递送载体的应用潜力。

摘要

本方案介绍了一种全面的无标记检测平台，通过将表面增强拉曼光谱（SERS）与机器学习（ML）相结合，实现对单个小细胞外囊泡（sEVs）的检测及其分子特征分析，用于诊断和治疗应用。该方法首先采用尺寸排阻色谱法或超速离心法分离sEVs。分离得到的囊泡随后在工程化的等离子体金纳米金字塔二维阵列基底上进行分析，该基底具有单囊泡检测灵敏度。通过利用内源性拉曼生化指纹图谱，本方案可在无需外源标记的情况下实现高特异性检测。在获取拉曼光谱后，数据经过预处理，并采用训练好的机器学习算法（如LDA、SVC）进行分析，以分类疾病状态，成功利用来自组织、血浆和唾液的sEVs将胃癌患者与健康对照组区分开来，分类准确率分别为90.1%、70.9%和60.7%。此外，通过量化单个sEV中阿霉素的载药量，展示了该方法在治疗领域的应用潜力，其中采用石墨烯包覆基底作为内标，提高了测量的准确性。该方法可实现高通量分析，能够捕捉群体异质性，对于早期疾病检测以及在单囊泡水平上理解药物装载效率至关重要。

引言

小型细胞外囊泡（sEVs），通常大小在30至200之间 直径为 nm 的细胞外囊泡天然分泌至生物体液中，携带源自其母细胞的蛋白质、脂质和核酸^1,2,3作为存在于唾液、尿液及其他体液中的非侵入性生物标志物⁴它们在疾病早期诊断、预后评估及治疗监测方面具有广阔前景，尤其在肿瘤学领域。^5,6,7然而，由于它们在复杂的生物基质中具有高度异质性和低丰度，其临床转化受到阻碍⁸为克服此类挑战，本方案采用表面增强拉曼光谱法（SERS），这是一种强大的分析技术，可将拉曼散射信号增强高达10¹⁰-10¹¹ 次 通过 等离激元基底^9,10,11SERS 捕获内在分子 "指纹" 在数秒内获取单个sEV的光谱，实现超灵敏的....

方案

人体标本的采集严格遵循《赫尔辛基宣言》进行，并已获得加州大学洛杉矶分校机构审查委员会（IRB）的批准。所有供体在参与研究前均签署了书面知情同意书。

注意：本研究共使用了4种细胞系，分别为AGS（CRL-1739）、A549（CCL-185）、NCI-N87（CRL-5822）和Hs 738.St/Int（CRL-7869），均购自商业供应商。这些细胞系的培养和传代均严格按照供应商提供的说明和试剂进行。收集条件培养基后，于-20 °C保存，待后续处理。在韩国三星医疗中心，志愿者自愿捐献了组织、血浆和唾液样本。胃癌组织样本在手术切除过程中获取，而非癌症对照组的活检样本则通过内窥镜采集。via标准临床操作规程，使用EDTA管收集血浆。每位受试者采集约 5 mL未刺激的全唾液，随后在 4 °C条件下以2,600 × g离心15 min。为保护细胞外RNA，上清液中加入SUPERase-In RNase抑制剂至终浓度为20 U/mL。所有样本均在-80 °C保存，直至进一步处理。sEVs根据既定方案从条件培养基和临床样本中分离²¹。

1. sEV 的分离与表征

1. 制备sEV样品
   1. 将澄清的细胞培养上清液在室温下完全解冻。

结果

成功实施单囊泡SERS方案可获得来自单个sEV的独特拉曼光谱，从而实现下游的诊断分类及治疗性药物载荷监测。图1分别展示了利用本研究中所述方案进行胃癌诊断研究以及载药sEV监测应用的工作流程。

图1研究流程图 (A胃癌单囊泡SERS诊断工作流程。临床囊泡经分离后沉积于.......

讨论

该方案的一个关键环节是基底制备和小细胞外囊泡（sEV）的纯化。无标记表面增强拉曼散射（SERS）的性能在很大程度上依赖于制备均匀、高共形且具有强增强效应的等离激元基底。 "热点"同样，高纯度sEV的分离 通过 尺寸排阻色谱对于获得可靠且可重复的表面增强拉曼光谱（SERS）至关重要。蛋白质聚集体或脂蛋白等杂质不仅会削弱囊泡信号，还可能因引入光谱噪声而干扰后续基于机器学习的分类分析。

我们平台的一个显著优势是其经过验证的单囊泡分辨率，这对于克服小细胞外囊泡（sEV）异质性带来的挑战至关重要。尽管激光光斑大于单个囊泡，但由于金纳米金字塔结构带来的超线性信号放大效应，信号主要来自最接近等离激元热点的sEV。结合基底上较低的囊泡密度，可确保每个光谱代表单个sEV的分子快照。这一能力使得能够识别出在整体分析方法（如蛋白质印迹或质谱）中通常被掩盖的不同sEV亚群。

该方案的临床价值体现在其在同一患者队列的多种生物流体（包括组织、血浆和唾液）中的成功应用。我们的研究结果表明，尽管组织来源的sEVs提供了最高的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x PBS	Thermo Fisher Scientific	J61196.AP
300目铜网	Electron Microscopy Sciences	EMS200-Cu
4% 甲醛溶液	Sigma Aldrich	1004960700
4″ 硅片	MSE Supplies	WA0810	(100) 取向
A549 细胞系	ATCC	CCL-185
AGS 细胞系	ATCC	CRL-1739
离心机转子 F-35-6-30, 5430	Eppendorf	22654306
CHA Mark 40	CHA Mark 40	https://chaindustries.com/mark-40-system/	电子束蒸发
铬蚀刻液	Sigma Aldrich	651826-500ML
阿霉素 D-4000	LC Laboratories	D-4000_3g
ExoView R100 系统及 ExoView 人源四跨膜蛋白检测试剂盒	NanoView Biosciences	https://www.nowmedicalstudios. com/portfolio/nanoview- biosciences-3d-product-illustrations
FeCl3 溶液	Sigma Aldrich	451649
HF 溶液	Sigma Aldrich	695068-500ML
Hs 738.St/Int 细胞系	ATCC	CRL-7869
inVia 共聚焦拉曼显微镜	Renishaw	https://www.renishaw.com/en/ invia-confocal-raman-microscope --6260?srsltid=AfmBOoqbZlyW qv2KDdcXV0UZnp8tdLNgYZ0 GbZvGOWI6z1OKi48rg5-b
KOH 溶液	Sigma Aldrich	417661
MaxQ 4000 台式恒温/制冷摇床	Thermo Scientific	SHKA4000 (4320)
MCO-19AIC 培养箱	SANYO	8380-30-0035
Millex-GP 滤器	MilliporeSigma	SLGPM33RS	0.22 µm
NanoSEM 230 显微镜	FEI	SEM-FEI-014
Nanosight NS300	Malvern Panalytical	https://www.malvernpanalytical .com/en/support/product-support /nanosight-range/nanosight-ns300
NCI-N87 细胞系	ATCC	CRL-5822
Optima TLX 超速离心机	Beckman Coulter	8043-30-1197
Oxford Plasmalab 80 Plus	Oxford Plasmalab	https://plasma.oxinst.com/ products/rie/plasmapro-800-rie
聚苯乙烯微球	Alfa Aesar	AA42711AB	500 nm
qEVoriginal/35 nm	Izon	ICO-35
单层石墨烯	MSE Supplies	ME0408
T-75 培养瓶	VWR	156800
TF20 高分辨率电镜	FEI	https://eicn.cnsi.ucla.edu/project/fei-tf20-tem/
醋酸铀酰溶液	Electron Microscopy Sciences	22400-1