探索基于表面增强拉曼散射的生物感测技术在疾病诊断和治疗中的应用

Summary

本文介绍了利用无标记表面增强拉曼光谱（SERS）分析单个小型细胞外囊泡（sEV）的方案，实现微创疾病诊断和评估sEV作为治疗载体。

Abstract

该方案提出了一个全面的无标记平台，将表面增强拉曼光谱（SERS）与机器学习（ML）相结合，用于检测和分子分析单个小型细胞外囊泡（sEVs），用于诊断和治疗应用。该方法首先通过尺寸排斥色谱法或超速离心法进行sEV分离。分离的囊泡随后在工程化的等离激元金纳米金字塔二维阵列基板上进行分析，该阵列具备单囊泡灵敏度。通过利用内在的拉曼生化指纹，该方案实现了无需外部标签的高特异性检测。在光谱采集后，数据经过预处理，并利用训练有素的机器学习算法（如LDA、SVC）进行分析，以分类疾病状态，利用组织、血浆和唾液的sEV成功区分胃癌与健康对照，分类准确率分别为90.1%、70.9%和60.7%。此外，其治疗应用还通过量化单次sEV中的多柔比星负载，这一测量通过使用石墨烯涂层底物作为内部标准得到了增强。该方法实现高通量分析，捕捉群体异质性，这对于早期疾病检测和单囊泡层面的药物负载效率理解至关重要。

Introduction

细胞外小囊泡（sEVs），直径通常在30到200纳米之间，由细胞自然分泌到生物液体中，携带指示其细胞起源的蛋白质、脂质和核酸，^1,2,3。作为唾液、尿液及其他体液中的非侵入性生物标志物^4，它们在早期疾病诊断、预后和治疗监测方面具有潜力，尤其是在^{肿瘤学领域5,6,7}。然而，由于其在复杂生物矩阵中的高度异质性和低丰度，其临床翻译受^阻。为克服这些挑战，该方案采用表面增强拉曼光谱（SERS），这是一种强大的分析方法，能够通过等离激元基底^9,10,11将拉曼散射放大多达10^{10-10 11倍。}SERS能在几秒钟内捕捉单个sEV的分子“指纹”光谱，实现超灵敏单囊泡分析....

Protocol

人类标本采集依据赫尔辛基宣言进行，并获得加州大学洛杉矶分校机构审查委员会（IRB）批准。所有捐献者在参与研究前均提供了书面知情同意。

注：本研究共使用了4个细胞系，分别是AGS（CRL-1739）、A549（CCL-185）、NCI-N87（CRL-5822）、Hs 738.St/Int（CRL-7869），均从商业供应商处购买。这些细胞系严格按照供应商的说明和试剂进行培养和传代。处理后，培养基在-20°C下收集并储存。在韩国三星医疗中心，捐献者自愿捐献了组织、血浆和唾液样本。胃癌组织在手术切除过程中获得，非癌症对照组的活检则通过内镜采集。血浆采集于EDTA管内，按照标准临床方案进行。从每位受试者采集约5毫升未受刺激的全唾液，然后在2600×克下离心，在4°C下离心15分钟。 为保留细胞外RNA，上清液补充了20 U/mL的SUPERase-In RNase抑制剂。所有标本均保持在-80°C，等待进一步处理。sEVs通过按照既定方案从条件培养基和临床样本中分离^出来。

1. sEV的分离与表征

1. 准备sEV样本
   1. 将清除的细胞培养上清液完全解冻在室温下。
   2. 将上清液通过无菌的0.22微米注射器过滤器....

Results

单囊泡SERS协议的成功实施可从单个SV中获得不同的拉曼光谱，从而实现下游诊断分类和治疗药物负荷监测。 图1 展示了胃癌诊断研究和药物负载sEVs监测应用的工作流程，分别使用我们这里报告的协议。

图1：研究流程图。 （A）基于单囊泡SERS的胃癌诊断工作流程。临床囊泡被分离并沉积在等离子激元底物上，单独进行拉曼扫描，并利用多元机器学习分析，以实现疾病区分和亚群体追踪。（B）治疗负载单囊泡定量化工作流程。药物培养的囊泡被纯化，沉积在石墨烯覆盖的基底.......

Discussion

该方案的一个关键方面是底物的制备和sEV纯化。无标签SERS的性能高度依赖于产生均匀、高共形等离子激元底物，并具有强增强“热点”。同样， 通过 尺寸排除色谱进行高纯度sEV分离对于生成可靠且可重复的SERS光谱至关重要。蛋白质聚集体或脂蛋白等杂质不仅会削弱囊泡信号，还可能通过引入谱噪声干扰下游机器学习分类。

我们平台的一个显著优势是其经过验证的单囊泡分辨率，这是克服sEV异质性挑战的关键因素。虽然激光斑点大于单个囊泡，但由于金纳米金字塔几何形状的超线性信号放大，信号主要由靠近等离激元热点的sEV主导。这一点，加上基底上的低囊泡密度，确保每个光谱都代表单个sEV的分子快照。这一能力使得识别出在西方印迹或质谱等体质分析方法中容易被遮蔽的不同sEV亚群。

该方案的临床威力通过其成功应用于同一患者群体的多种生物流体——组织、血浆和唾液——得以体现。我们的发现表明，虽然组织来源的sEV提供了最高的诊断准确率（90.1%），但临床可得的血浆（70.9%）.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	赛莫飞世尔科学	J61196。美联社
300网格铜网	电子显微镜科学	EMS200-Cu
4%对甲醛溶液	西格玛·奥尔德里奇	1004960700
4″硅片及nbsp;	MSE供应	<强>WA0810	（100）定向
A549细胞系	空军交通管制委员会	CCL-185
AGS细胞系	空军交通管制委员会	CRL-1739
离心机转子F-35-6-30,5430	埃彭多夫	<强>22654306<强>
CHA Mark 40	CHA Mark 40	https://chaindustries.com/mark-40-system/	电子束蒸发
Cr蚀刻溶液	西格玛·奥尔德里奇	651826-500ML
多索鲁比星 D-4000	LC实验室	D-4000_3g
ExoView R100系统与ExoView人类四叉蛋白套件	纳米视野生物科学	https://www.nowmedicalstudios. com/portfolio/nanoview- biosciences-3d-product-illustrations
FeCl溶液	西格玛·奥尔德里奇	451649
高频解决方案	西格玛·奥尔德里奇	695068-500ML
Hs 738.St/Int 细胞系	空军交通管制委员会	CRL-7869
通过共聚焦拉曼显微镜	雷尼肖	https://www.renishaw.com/en/ invia-confocal-raman-microscope --6260？srsltid=AfmBOoqbZlyW qv2KDdcXV0UZnp8tdLNgYZ0 GbZvGOWI6z1OKi48rg5-b
KOH解决方案	西格玛·奥尔德里奇	417661
MaxQ 4000 台式孵化/冷藏摇床	热力科学	SHKA4000（4320）
MCO-19AIC孵化器	三洋	8380-30-0035
Millex-GP滤波器	米利波尔西格玛	SLGPM33RS	0.22 和微型;m
纳米SEM 230显微镜	国际飞船	SEM-FEI-014
纳米视线 NS300	马尔文泛林	https://www.malvernpanalytical .com/en/support/product-support /nanosight-range/nanosight-ns300
NCI-N87细胞系	空军交通管制委员会	CRL-5822
Optima TLX 超速离心机	贝克曼·库尔特	8043-30-1197
牛津等离子实验室80加	牛津等离子实验室	https://plasma.oxinst.com/ 产品/RIE/Plasmapro-800-RIE产品
聚苯乙烯球	阿尔法·艾萨尔	<强>AA42711AB<强>	500纳米
qEVoriginal/35纳米	伊宗	ICO-35
单层石墨烯	MSE供应	ME0408
T-75 酒壶	VWR	156800
TF20 高分辨率电磁仪	国际飞船	https://eicn.cnsi.ucla.edu/project/fei-tf20-tem/
醋酸铀酰溶液	电子显微镜科学	22400-1