本文介绍了一种研究lncPVT1如何调控甲状腺癌细胞中HIF-1α稳定性及糖酵解基因表达的实验方案，可用于探索代谢调控机制及潜在的治疗靶点。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文介绍了一种研究lncPVT1如何调控甲状腺癌细胞中HIF-1α稳定性及糖酵解基因表达的实验方案，可用于探索代谢调控机制及潜在的治疗靶点。
作为最常见的内分泌系统癌症，甲状腺癌在人群中的流行病学趋势呈加速上升。尽管治疗手段已取得进展，复发和转移仍是临床面临的挑战。长链非编码RNA PVT1（lncPVT1）已被证实是多种癌症中保守的促癌调控因子，但其在甲状腺癌（TC）中的具体功能仍需进一步研究。本研究聚焦于利用TC细胞系TPC-1和K1，在常氧和缺氧条件下探讨lncPVT1对糖酵解的影响。在缺氧条件下，lncPVT1的过表达显著增强了葡萄糖消耗和乳酸生成，证实其具有促进糖酵解的能力。此外，lncPVT1上调了关键糖酵解基因如GLUT1, HK1, HK2和PGK1的表达，并促进了TC细胞的增殖。在机制上，lncPVT1通过抑制缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的降解，增强其稳定性，导致HIF-1α在细胞内积累。积累的HIF-1α随后结合到调控糖酵解相关基因表达的特定调控序列上，从而激活这些基因并增强糖酵解活性。我们的研究结果表明，lncPVT1通过调控HIF-1α的稳定性及糖酵解基因的表达，深化了对甲状腺癌代谢机制的理解，并可能揭示新的治疗靶点。
甲状腺癌（TC）是一种高度常见的内分泌系统恶性肿瘤，其发病率迅速上升1。尽管在治疗策略方面已取得进展，包括手术、放射治疗和甲状腺激素抑制治疗，但仍有相当比例的TC患者面临肿瘤复发和转移的风险，这凸显了深入理解其分子发病机制的必要性2,3。TC的发生与多种已知危险因素相关，包括电离辐射暴露、接触化学致癌物、吸烟以及肥胖；然而，其复杂的潜在机制仍不明确4。鉴于对TC分子机制的认识仍有限，非编码RNA，尤其是长链非编码RNA（lncRNA），因其在癌症中的调控作用而受到越来越多的关注。
越来越多的证据表明，长链非编码RNA（lncRNA）通过选择性剪接、转录调控以及作为微小RNA（miRNA）海绵等多种机制，在肿瘤发生等复杂生物学过程中发挥关键调控作用5,6,7。浆细胞瘤变异易位1（PVT1）位于染色体8q24.21区域，紧邻癌基因C-myc8。其中，lncPVT1是一种定位于8号染色体q24.21区段、位于C-myc癌基因下游的长链非编码....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
细胞培养与转染
人甲状腺癌（TC）细胞系 TPC-1 和 K1 在含 4.5 g/L 葡萄糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养，培养基中添加 10% 胎牛血清和 100 µg/mL 青霉素-链霉素。细胞置于 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中培养。进行缺氧处理时，将 1 × 105 个细胞转移至密闭缺氧室，在 37 °C 下以 1% O2、5% CO2 和 94% N2 平衡 24 小时，除非另有说明。使用慢病毒表达系统，按照制造商说明书在 TPC-1 和 K1 细胞中构建了 lncPVT1 的稳定过表达（lncPVT1 OE）及其相应的阴性对照（NC）。
葡萄糖水平的评估
为评估葡萄糖消耗，将甲状腺癌细胞系在常氧条件（21% O2）和低氧条件（1% O2）下培养24小时。根据制造商说明书，使用葡萄糖检测试剂盒测定培养基中的葡萄糖浓度。简言之，取2 µL的条件培养基与新鲜配制的葡萄糖工作试剂混合，在37 °C孵育10分钟。使用酶标仪在530 nm处测定吸光度，以定量葡萄糖水平。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
由lncPVT1介导的TC细胞系糖酵解增强
我们最初利用慢病毒表达系统在 TPC-1 和 K1 细胞中建立了 lncPVT1 过表达（OE）和阴性对照（NC）。通过 qRT-PCR 确认了 lncPVT1 的成功过表达（图 1A-B）。为评估其对糖酵解的影响，将细胞在常氧和缺氧条件下培养 24 小时。研究结果表明，缺氧显著增强了 TPC-1 和 K1 细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成（图 1C-F）。值得注意的是，在缺氧条件下，lncPVT1 的过表达进一步增强了这些糖酵解反应。
lncPVT1 促进 T.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作为最常见的内分泌系统恶性肿瘤，甲状腺癌（TC）在复发和转移方面面临重大挑战22。甲状腺癌发生机制的图景尚未完全阐明，尤其是在长链非编码RNA（lncRNA）介导的致癌性代谢重编程及基本细胞行为调控方面仍不明确23。在本研究中，我们聚焦于致癌性长链非编码RNA lncPVT1，探讨其对TC细胞糖酵解过程及HIF-1α稳定性的影响。
瓦博格效应（Warburg效应）是恶性肿瘤中一种基本的代谢特征，尤其在缺氧条件下更为显著，其典型特征是糖酵解增强而氧化磷酸化减弱24。缺氧现象在快速生长的实体瘤中普遍存在，对肿瘤的侵袭性及不良预后具有关键调控作用25,26,27,28。我们的研究结果表明，无论.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者声明不存在任何经济或非经济利益冲突。
研究经费由福建省科技计划项目（2022J01784）提供。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BCA 蛋白检测试剂盒 | meilunbio | MA0082-2 | WB 蛋白定量检测 |
| 生物安全柜 | Lishen | HFsafe-1200LC | 细胞传代与扩增 |
| 离心机 | Baiyang | B320A | 细胞离心 |
| 化学发光成像系统 | BIO-RAD(USA) | ChemiDoc Touch | WB 显影 |
| CO2 培养箱 | Thermo(USA) | 311 | 细胞培养 |
| ECL 化学发光检测试剂盒 | meilunbio | MA0186-1 | WB 显影 |
| 流式细胞仪 | BD | FACSCalibur | 流式细胞术凋亡检测 |
| 荧光倒置显微镜 | NIKON(Japan) | Ts2-FL | 细胞观察 |
| 荧光定量 PCR 仪器 | ABI(USA) | 7300 | PCR 实验 |
| GAPDH | proteintech | 60004-1-Ig | WB 内参抗体 |
| 葡萄糖检测试剂盒 | Jiancheng | A154-1-1 | 生化检测 |
| HIF1A | BOSTER | A00013 | WB 抗体 |
| HRP 标记的 Affinipure 羊抗小鼠 IgG(H+L) | proteintech | SA00001-1 | 免疫组织化学（IHC）实验 |
| HRP 标记的 Affinipure 羊抗兔 IgG(H+L) | proteintech | SA00001-2 | 免疫组织化学（IHC）实验 |
| K1 细胞系 | 中国科学院细胞库（中国上海） | NA | 人乳头状甲状腺癌细胞系 |
| 乳酸检测试剂盒 | Jiancheng | A019-2-1 | 生化检测 |
| 酶标仪 | Thermo(USA) | K3 | ELISA 检测 |
| PAGE 凝胶超快制备试剂盒（15%） | meilunbio | MA0384 | WB 电泳 |
| PCR 仪 | BIO-RAD(USA) | PTC100 | PCR 实验 |
| 预染彩虹蛋白 Marker | meilunbio | MA0342 | WB 电泳 |
| 蛋白垂直电泳系统 | BIO-RAD(USA) | POWER PAC 200 | WB 电泳 |
| SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（5X） | Beyotime | P0015L | WB 电泳 |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | sigma | 151-21-3 | WB 电泳 |
| TPC-1 细胞系 | 中国科学院细胞库（中国上海） | NA | 人甲状腺癌细胞系 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。