本文介绍了一种研究lncPVT1如何调控甲状腺癌细胞中HIF-1α稳定性及糖酵解基因表达的实验方案，可用于探索代谢调控机制及潜在的治疗靶点。
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本文介绍了一种研究lncPVT1如何调控甲状腺癌细胞中HIF-1α稳定性及糖酵解基因表达的实验方案，可用于探索代谢调控机制及潜在的治疗靶点。
作为最常见的内分泌系统癌症，甲状腺癌在人群中的流行病学趋势呈加速上升。尽管治疗手段已取得进展，复发和转移仍是临床面临的挑战。长链非编码RNA PVT1（lncPVT1）已被证实是多种癌症中保守的促癌调控因子，但其在甲状腺癌（TC）中的具体功能仍需进一步研究。本研究聚焦于利用TC细胞系TPC-1和K1，在常氧和缺氧条件下探讨lncPVT1对糖酵解的影响。在缺氧条件下，lncPVT1的过表达显著增强了葡萄糖消耗和乳酸生成，证实其具有促进糖酵解的能力。此外，lncPVT1上调了关键糖酵解基因如GLUT1, HK1, HK2和PGK1的表达，并促进了TC细胞的增殖。在机制上，lncPVT1通过抑制缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的降解，增强其稳定性，导致HIF-1α在细胞内积累。积累的HIF-1α随后结合到调控糖酵解相关基因表达的特定调控序列上，从而激活这些基因并增强糖酵解活性。我们的研究结果表明，lncPVT1通过调控HIF-1α的稳定性及糖酵解基因的表达，深化了对甲状腺癌代谢机制的理解，并可能揭示新的治疗靶点。
甲状腺癌（TC）是一种高度常见的内分泌系统恶性肿瘤，其发病率迅速上升1。尽管在治疗策略方面已取得进展，包括手术、放射治疗和甲状腺激素抑制治疗，但仍有相当比例的TC患者面临肿瘤复发和转移的风险，这凸显了深入理解其分子发病机制的必要性2,3。TC的发生与多种已知危险因素相关，包括电离辐射暴露、接触化学致癌物、吸烟以及肥胖；然而，其复杂的潜在机制仍不明确4。鉴于对TC分子机制的认识仍有限，非编码RNA，尤其是长链非编码RNA（lncRNA），因其在癌症中的调控作用而受到越来越多的关注。
越来越多的证据表明，长链非编码RNA（lncRNA）通过选择性剪接、转录调控以及作为微小RNA（miRNA）海绵等多种机制，在肿瘤发生等复杂生物学过程中发挥关键调控作用5,6,7。浆细胞瘤变异易位1（PVT1）位于染色体8q24.21区域，紧邻癌基因C-myc8。其中，lncPVT1是一种定位于8号染色体q24.21区段、位于C-myc癌基因下游的长链非编码RNA，在包括肝癌9和肾细胞癌10在内的多种恶性肿瘤中表现出显著的促癌作用，因而受到广泛关注。然而，lncPVT1在甲状腺癌（TC）中的功能意义仍尚未得到充分研究。
癌细胞会发生代谢重编程，这是肿瘤发生的关键特征之一，表现为糖酵解活性增强而氧化磷酸化减弱，即所谓的瓦伯格效应11。缺氧是实体瘤中常见的微环境特征，深刻影响肿瘤行为，促进糖酵解和侵袭性，并导致不良预后12。缺氧诱导因子1（HIF-1）是调控细胞对低氧水平反应的关键因子，协调多种适应性变化，支持肿瘤的存活与进展13。先前的研究表明，lncPVT1在多种恶性肿瘤中调节糖酵解，包括乳腺癌14、胰腺导管腺癌15和骨肉瘤16。此外，lncPVT1在鼻咽癌中通过稳定HIF-1α来增强细胞增殖17。然而，lncPVT1表达与临床参数之间的相关性在癌症中尚未见报道。此外，lncPVT1在甲状腺癌（TC）中的具体功能、作用机制或独特的临床意义仍不明确。因此，本研究旨在探讨lncPVT1如何影响在常氧和缺氧条件下培养的TC细胞系TPC-1和K1中的葡萄糖代谢。我们检测了lncPVT1过表达对葡萄糖消耗、乳酸生成和细胞增殖的影响。我们进一步解析了lncPVT1调控HIF-1α稳定性的机制及其对糖酵解相关转录程序的后续影响。这项综合研究为lncPVT1在肿瘤发生中的作用提供了新的视角，特别是在代谢重编程和缺氧适应的背景下。
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细胞培养与转染
人甲状腺癌（TC）细胞系 TPC-1 和 K1 在含 4.5 g/L 葡萄糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养，培养基中添加 10% 胎牛血清和 100 µg/mL 青霉素-链霉素。细胞置于 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中培养。进行缺氧处理时，将 1 × 105 个细胞转移至密闭缺氧室，在 37 °C 下以 1% O2、5% CO2 和 94% N2 平衡 24 小时，除非另有说明。使用慢病毒表达系统，按照制造商说明书在 TPC-1 和 K1 细胞中构建了 lncPVT1 的稳定过表达（lncPVT1 OE）及其相应的阴性对照（NC）。
葡萄糖水平的评估
为评估葡萄糖消耗，将甲状腺癌细胞系在常氧条件（21% O2）和低氧条件（1% O2）下培养24小时。根据制造商说明书，使用葡萄糖检测试剂盒测定培养基中的葡萄糖浓度。简言之，取2 µL的条件培养基与新鲜配制的葡萄糖工作试剂混合，在37 °C孵育10分钟。使用酶标仪在530 nm处测定吸光度，以定量葡萄糖水平。
乳酸水平评估
在常氧条件（21% O2、5% CO2、37 °C）和低氧条件（1% O2、5% CO2、37 °C）下，将甲状腺癌细胞系 TPC-1 和 K1（2 × 104 个细胞/孔）培养 24 小时。孵育后，将培养板在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，以沉淀细胞和碎片。随后，从每孔中收集 2 µL 澄清上清液，并与 96 孔板中的 200 µL 乳酸检测试剂混合。反应混合物在 37 °C 孵育 10 分钟，然后加入终止液以终止反应。使用酶标仪在 530 nm 处测定吸光度。通过将吸光度值与已知乳酸标准品生成的标准曲线（通常范围为 0 至 20 nmol）进行比较，确定乳酸浓度。所有测定均设三个重复孔。
细胞增殖实验
将甲状腺癌细胞以每100 µL培养基中接种3 × 103 个细胞的密度接种至96孔板中。随后，细胞在常氧条件（21% O2、5% CO2、37 °C）或低氧条件（1% O2、5% CO2、37 °C）下分别培养0 h、24 h或48 h。在每个时间点，向96孔板的每孔中加入10 µL细胞增殖试剂。将板在37 °C孵育40 min。孵育结束后，使用酶标仪测定450 nm处的光密度（OD450）以定量细胞增殖水平。所有测量均至少进行三次技术重复。
qRT-PCR 分析
在常氧条件（21% O2、5% CO2、37 °C）和低氧条件（1% O2、5% CO2、37 °C）下，使用硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取试剂，按照制造商说明书从 1 × 106 个甲状腺癌细胞中提取总RNA。通过分光光度法测定260/280 nm处的吸光度比值，评估RNA的纯度和浓度。对于互补DNA（cDNA）合成，取500 ng总RNA，在20 µL反应体系中进行逆转录，反应体系包含逆转录酶、随机六聚体引物、dNTPs、RNase抑制剂和反应缓冲液。逆转录反应在25 °C下进行10分钟，随后在42 °C下进行50分钟，并在70 °C加热15分钟以终止反应。
采用基于SYBR Green的检测系统进行定量PCR，总反应体系为20 µL，包含cDNA模板（原始cDNA合成产物1:5至1:20稀释）、SYBR Green PCR主混合液、上下游引物（各0.2 µM）以及无核酸酶水。PCR扩增在热循环仪上进行，循环条件如下：95 °C预变性3 min；随后进行40个循环，每循环包括95 °C变性15 s、60 °C退火30 s、72 °C延伸30 s；最后进行熔解曲线分析以验证扩增的特异性。
根据已发表的序列18设计了GLUT1、HK1、HK2、PGK1和GAPDH的引物序列（表1），并由商业公司合成。目标基因的表达水平以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法19进行归一化计算。
蛋白质印迹
处理后，甲状腺癌细胞用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，随后加入含有蛋白酶抑制剂混合物的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液进行裂解。细胞裂解物在冰上孵育30分钟，期间间歇性混匀，然后在4 °C条件下以12,000 × g 离心15分钟，以去除不溶性碎片。采用双辛可宁酸（BCA）法测定上清液中的蛋白浓度，并根据试剂盒说明书操作。取等量蛋白（每样本30 µg）与5×上样缓冲液混合，于95 °C煮沸5分钟，随后上样至10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。在120 V电压下电泳约90分钟，然后在4 °C条件下以100 V电压使用湿转系统将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，转膜时间为90分钟。用含0.1% Tween-20的Tris缓冲盐水（TBST）配制的5%脱脂牛奶在室温下封闭膜1小时，以防止非特异性结合。随后，将膜在4 °C下与一抗稀释液中的相应一抗孵育过夜：抗HIF-1α抗体（1:3,000）和抗β-actin抗体（1:8,000）。用TBST洗涤3次，每次10分钟，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，按1:5,000比例稀释于封闭液中，在室温下孵育1小时。再经三次TBST洗涤后，使用增强型化学发光（ECL）检测系统显影蛋白条带，并通过凝胶成像系统采集图像。
双荧光素酶检测
为研究lncPVT1对糖酵解相关基因的转录调控作用，将TPC-1细胞以每孔1 × 105 个细胞的密度接种于24孔板中，加入含4.5 g/L葡萄糖、10%胎牛血清和100 µg/mL青霉素-链霉素的DMEM培养基，过夜培养。按照生产商说明书，使用脂质体转染试剂（终浓度为每孔2 µL），将500 ng缺氧反应元件（HRE）驱动的萤火虫荧光素酶报告质粒与50 ng海肾荧光素酶对照质粒共转染至细胞中。为验证转染效率，设置平行转染组，转染表达GFP的质粒，并在转染后24小时通过荧光显微镜观察GFP表达情况。在常氧（21% O2）或低氧（1% O2）条件下培养24小时后，使用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性为内参对萤火虫荧光素酶活性进行标准化，所得比值用于各样本间的比较分析。
数据分析
所有数据均以均值 ± 标准差表示。统计学评估在统计分析软件中进行。组间比较采用独立样本 t 检验，统计学显著性根据 p 值小于 0.05 的阈值确定。
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由lncPVT1介导的TC细胞系糖酵解增强
我们最初利用慢病毒表达系统在 TPC-1 和 K1 细胞中建立了 lncPVT1 过表达（OE）和阴性对照（NC）。通过 qRT-PCR 确认了 lncPVT1 的成功过表达（图 1A-B）。为评估其对糖酵解的影响，将细胞在常氧和缺氧条件下培养 24 小时。研究结果表明，缺氧显著增强了 TPC-1 和 K1 细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成（图 1C-F）。值得注意的是，在缺氧条件下，lncPVT1 的过表达进一步增强了这些糖酵解反应。
lncPVT1 促进 T...
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作为最常见的内分泌系统恶性肿瘤，甲状腺癌（TC）在复发和转移方面面临重大挑战22。甲状腺癌发生机制的图景尚未完全阐明，尤其是在长链非编码RNA（lncRNA）介导的致癌性代谢重编程及基本细胞行为调控方面仍不明确23。在本研究中，我们聚焦于致癌性长链非编码RNA lncPVT1，探讨其对TC细胞糖酵解过程及HIF-1α稳定性的影响。
瓦博格效应（Warburg效应）是恶性肿瘤中一种基本的代谢特征，尤其在缺氧条件下更为显著，其典型特征是糖酵解增强而氧化磷酸化减弱24。缺氧现象在快速生长的实体瘤中普遍存在，对肿瘤的侵袭性及不良预后具有关键调控作用25,26,27,28。我们的研究结果表明，无论...
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作者声明不存在任何经济或非经济利益冲突。
研究经费由福建省科技计划项目（2022J01784）提供。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BCA 蛋白检测试剂盒 | meilunbio | MA0082-2 | WB 蛋白定量检测 |
| 生物安全柜 | Lishen | HFsafe-1200LC | 细胞传代与扩增 |
| 离心机 | Baiyang | B320A | 细胞离心 |
| 化学发光成像系统 | BIO-RAD(USA) | ChemiDoc Touch | WB 显影 |
| CO2 培养箱 | Thermo(USA) | 311 | 细胞培养 |
| ECL 化学发光检测试剂盒 | meilunbio | MA0186-1 | WB 显影 |
| 流式细胞仪 | BD | FACSCalibur | 流式细胞术凋亡检测 |
| 荧光倒置显微镜 | NIKON(Japan) | Ts2-FL | 细胞观察 |
| 荧光定量 PCR 仪器 | ABI(USA) | 7300 | PCR 实验 |
| GAPDH | proteintech | 60004-1-Ig | WB 内参抗体 |
| 葡萄糖检测试剂盒 | Jiancheng | A154-1-1 | 生化检测 |
| HIF1A | BOSTER | A00013 | WB 抗体 |
| HRP 标记的 Affinipure 羊抗小鼠 IgG(H+L) | proteintech | SA00001-1 | 免疫组织化学（IHC）实验 |
| HRP 标记的 Affinipure 羊抗兔 IgG(H+L) | proteintech | SA00001-2 | 免疫组织化学（IHC）实验 |
| K1 细胞系 | 中国科学院细胞库（中国上海） | NA | 人乳头状甲状腺癌细胞系 |
| 乳酸检测试剂盒 | Jiancheng | A019-2-1 | 生化检测 |
| 酶标仪 | Thermo(USA) | K3 | ELISA 检测 |
| PAGE 凝胶超快制备试剂盒（15%） | meilunbio | MA0384 | WB 电泳 |
| PCR 仪 | BIO-RAD(USA) | PTC100 | PCR 实验 |
| 预染彩虹蛋白 Marker | meilunbio | MA0342 | WB 电泳 |
| 蛋白垂直电泳系统 | BIO-RAD(USA) | POWER PAC 200 | WB 电泳 |
| SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（5X） | Beyotime | P0015L | WB 电泳 |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | sigma | 151-21-3 | WB 电泳 |
| TPC-1 细胞系 | 中国科学院细胞库（中国上海） | NA | 人甲状腺癌细胞系 |
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