本研究建立了一个为期12周的慢性缺氧小鼠模型，以探讨电针刺法对心脑的保护作用。研究结果表明，在常用于改善认知功能的穴位进行电针刺激，不仅能增强认知功能，还能缓解心脏功能障碍，并减轻心肌组织的病理损伤。
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本研究建立了一个为期12周的慢性缺氧小鼠模型，以探讨电针刺法对心脑的保护作用。研究结果表明，在常用于改善认知功能的穴位进行电针刺激，不仅能增强认知功能，还能缓解心脏功能障碍，并减轻心肌组织的病理损伤。
本研究建立了一个为期12周的慢性缺氧小鼠模型，以探讨电针刺激对心脑的保护作用。目前针对缺氧相关疾病的治疗方法，如高压氧治疗和某些药物，常因可及性差或作用靶点单一而受到限制。为弥补这一不足，我们提出假设：在传统上用于改善认知功能的穴位进行电针刺激，可在慢性缺氧条件下同时改善认知功能和心脏功能。将30只雄性C57BL/6J小鼠随机分为三组：对照组（Con）、慢性缺氧模型组（CH）以及慢性缺氧联合电针治疗组（CH+EA）。CH组和CH+EA组每日暴露于低氧环境（10.0% ± 0.5% O₂）中8小时，持续12周；CH+EA组在最后2周 additionally 每日接受位于GV20、GV24及双侧ST36穴位的电针刺激。行为学测试、超声心动图评估及组织病理学分析结果显示，电针不仅显著缓解了类焦虑行为并改善了空间记忆能力，还提高了多项心脏功能参数，同时减轻了海马神经元损伤和心肌重塑。这些发现表明，电针具有心脑保护作用，符合中医"整体观念"的理论，从而为缺氧相关的心脑共病提供了一种新的非药物干预策略。
缺氧是多种疾病状态下的常见病理挑战，包括高海拔环境、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、心脑血管疾病，以及航空航天和潜水作业等特殊场景，可能引发多器官功能损害。作为体内耗氧量最高的器官，脑和心脏对缺氧损伤尤为敏感。研究表明，COPD患者认知功能障碍的患病率介于32%至88%之间1,2，而心脏功能障碍的发生率可高达70%3。研究证实，慢性缺氧可导致脑线粒体功能障碍，进而引发氧化应激、钙超载和神经炎症，最终造成海马和大脑皮层的神经元损伤，并损害学习与记忆功能4,5,6。与此同时，缺氧会激活交感神经系统和肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS），引起血管收缩、血压升高、心脏后负荷增加，并促进心肌肥厚和纤维化，最终导致心力衰竭7,8,9。这种并发的心脑损伤显著增加了临床治疗的难度，因此开发有效且易于实施的治疗策略成为亟待满足的重要临床需求。
目前针对缺氧引起的认知功能障碍和心脏功能障碍的治疗策略主要包括高压氧治疗、脑代谢增强剂（如吡拉西坦、奥拉西坦）、神经营养因子治疗10,11以及β受体阻滞剂（如美托洛尔）12。然而，这些方法存在显著局限性：高压氧治疗需要专用设备，可及性差；药物干预常伴随不良反应，且通常仅针对单一病理通路；而神经营养因子治疗则面临血脑屏障穿透性和稳定性方面的挑战。因此，寻找高效且易于实施的、可同时治疗心脑功能损伤的策略已成为当前重要的研究方向。
针灸作为中医（TCM）的基本组成部分，强调一种整体治疗观，符合多靶点调控的需求。在神经系统和心血管系统疾病的治疗中，针灸展现出独特的治疗潜力。电针是针灸的现代发展形式，结合了传统针刺与电刺激，能够更精确地调节神经电生理活动13,14。电针可有效改善脑缺血-再灌注损伤，减少心肌酶（GPBB、H-FABP）的释放，具有显著的心脏保护作用15,16。总之，作为传统针灸的现代创新，电针实现了多机制、多靶点的调控，在神经系统和心血管疾病治疗中展现出明确的应用价值和临床潜力，成为连接中医与现代医学的重要桥梁。
然而，目前关于电针治疗缺氧性认知功能障碍和心脏损伤的研究大多局限于单一器官/系统的效应，未能探讨其在心脑同步治疗中的潜在作用。基于中医的"整体观念"以及长期慢性缺氧所致心肺脑功能障碍共病的临床现实，本研究旨在探讨电针在"心脑同步治疗"中的作用，阐明其在同步改善缺氧诱导的神经元损伤、心肌肥厚/纤维化及相关功能障碍方面的效应，并为心肺脑相关疾病提供一种整体性、靶向性的非药物治疗方案。
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将30只7-8周龄、体重18-22 g的雄性C57BL/6J小鼠（见材料表）饲养于河北以岭药研院新药评价中心的SPF级动物设施中。环境温度维持在20-26 °C，相对湿度为40%-70%，光照周期为12 h明/12 h暗。小鼠可自由摄取标准实验室啮齿类动物饲料和清洁饮水。经过1周的适应性饲养后，将小鼠随机分为三组（n = 10）：正常对照组（Con）、慢性低氧模型组（CH）和慢性低氧联合电针治疗组（CH+EA）。所有实验程序均经河北以岭药研院动物研究伦理委员会批准（批准号：TTN-2025001），并严格遵循实验动物护理与使用指南进行。
慢性低氧小鼠模型的建立（图1）
慢性低氧小鼠模型的建立基于先前描述的方法并进行了修改17。使用自动化气体控制与输送系统来生成并维持低氧环境。该系统通过程序精确调控电磁阀，将纯氧与氮气按特定比例混合，并将混合气体输送至定制的不锈钢低氧舱内。此装置可对气体输送的时间和浓度进行精确控制。舱内氧气浓度通过数字式氧气分析仪持续监测，并通过反馈机制相应调节气体流速，使氧气浓度维持在10.0% ± 0.5%。CH组和CH+EA组小鼠共同饲养于低氧舱中，每日暴露于低氧条件下8小时（上午9:00至下午5:00），之后恢复至常氧环境直至当日结束。该方案持续重复12周。在整个低氧暴露期间，动物均可自由摄食和饮水。在初始氮气注入以降低氧气浓度的过程中格外谨慎，逐步进行以避免因氧气水平迅速下降导致动物急性死亡。Con组小鼠饲养于相邻舱内常氧条件下，其余饲养条件与实验组完全相同。
麻醉（图2）
为了在电针干预期间确保动物的稳定性，并尽量减少生理应激对实验结果的干扰，本研究采用吸入式异氟烷进行麻醉17。所有实验组小鼠在操作过程中均接受麻醉，以确保操作条件的一致性。在实施麻醉前，准备小型动物麻醉机（见材料表）以及设定为37 °C的恒温加热垫，以防止动物在操作过程中出现低体温。麻醉诱导在密闭诱导舱内进行，使用2%–2.5%异氟烷（见材料表），持续约1分钟。当观察到小鼠自发运动消失且肌张力显著降低后，将其转移至加热垫上。随后，将特制的微型面罩轻柔地覆盖在小鼠鼻部，以0.5%–1.2%异氟烷维持麻醉状态。麻醉深度的有效性通过角膜反射消失以及足底刺激后无明显缩足反射来判断。该麻醉方案可使小鼠维持稳定的麻醉状态超过30分钟，足以完成后续所有操作。
电针治疗
从慢性缺氧暴露的第11周开始，对CH+EA组小鼠实施电针干预。选取的穴位为头部的百会（GV20）和神庭（GV24），以及双侧足三里（ST36）。GV20位于颅顶正中线，大致在两耳尖连线的中点处18。GV24位于前额正中线，约在双眼内眦连线中点上方1-2 mm处19。ST36位于后肢，膝关节的下方外侧，在腓骨小头下缘下方约2 mm的凹陷处20,21。待小鼠达到稳定的麻醉状态后，操作者右手持一次性无菌不锈钢针灸针（规格：0.18 × 7 mm；见材料表）。对于头部穴位（GV24和GV20），左手轻轻提起头皮，针以15-30°角沿皮下向后刺入，深度约2 mm。对于下肢的ST36穴位，针垂直刺入，深度约为3-4 mm。随后将电针仪的输出电极（见材料表）连接至针柄：一组导线连接GV20与左侧ST36，另一组连接GV24与右侧ST36，通过两组导线同时进行电针刺激。电针参数设置如下：连续波，频率2 Hz22,23。电流强度从0.1 mA开始逐渐增加，直至观察到局部肢体出现轻微节律性抽动（通常维持在约2 mA）。每日进行一次电针治疗，每次30分钟，连续6天后休息1天，共持续2周。与此同时，Con组和CH组小鼠在相同时间内接受相同条件的麻醉和固定处理，但不进行针刺或电针仪的激活。
旷场实验
开放场实验（OFT）用于评估小鼠在新环境中自发的运动活动、探索行为以及类似焦虑的反应24。OFT装置为一个白色立方体空间（50 cm × 50 cm × 30 cm），其底部在分析时被虚拟划分为25个方格（每个10 cm × 10 cm），用于行为学分析。在正式实验前，所有小鼠均在测试房间内适应1小时，以尽量减少环境变化所引起的压力对行为结果的影响。测试期间，将每只小鼠轻柔地放置于装置的中央位置。经过2分钟的适应期后，正式记录其行为10分钟。整个实验过程使用视频追踪系统（见材料表）进行录像，以自动追踪其运动轨迹。分析的参数包括总移动距离、在中心区域停留的时间、在中心区域的运动速度以及进入中心区域的次数。所有小鼠均从相同的中心位置开始探索，每只小鼠仅测试一次。为避免嗅觉干扰，每次小鼠测试结束后均用75%乙醇对装置进行彻底清洁。
莫里斯水迷宫（MWM）
Morris水迷宫（MWM）实验是一种评估记忆功能的标准方法，主要用于评价小鼠的空间学习和记忆能力25。实验装置由一个直径120 cm、深30 cm的圆形水池组成，水池在概念上被均分为四个象限（I、II、III、IV）。为减少外界干扰，水池周围悬挂遮光帘，并在水池上方墙壁上固定不同的视觉线索，这些线索在整个实验过程中保持不变。水池中注满温度维持在22–24 °C的水，水面高度保持在平台表面以上约1 cm。向水中加入浓度为20%的无毒二氧化钛粉末，使水呈不透明状态，从而增强小鼠与背景之间的对比度，以实现更精确的视频追踪。实验持续6个连续天数，包括为期5天的空间获取训练阶段和1天的空间探测试验。在训练阶段，一个直径为10 cm的圆形平台被放置在III象限，作为目标位置。第1天，平台置于水面以上略高处（约1 cm），以使小鼠熟悉逃生目标。从第2天至第5天，平台被淹没于水面以下约1 cm处，用于评估空间学习能力。每天，每只小鼠按照预定顺序，依次从四个象限的池壁处面朝池壁放入水中。实验人员在放置动物后立即离开房间，以避免成为无意的空间线索。记录每只小鼠找到隐藏平台所需的时间（逃避潜伏期）。若小鼠在90秒的时间限制内未能找到平台，则由实验人员轻轻引导其至平台，并让其在平台上停留30秒以强化空间学习记忆，其逃避潜伏期记为90秒；若小鼠在90秒内找到平台，则允许其在平台上停留10秒。每次训练结束后，用毛巾将小鼠擦干并送回原饲养笼。起始象限的顺序系统性轮换，每只小鼠每次试验之间的间隔时间约为20分钟。视频追踪系统（见材料表）自动记录游泳距离、速度和逃避潜伏期等参数。第6天进行探测试验以评估空间记忆能力。将平台从目标象限（III象限）移除，每只小鼠从原目标位置对侧的象限（I象限）释放，自由游泳90秒。记录小鼠在目标象限（原平台所在位置）停留的时间、穿越原平台精确位置的次数以及游泳轨迹。探测试验结束后，立即彻底擦干小鼠，并在其居住笼下放置热源以防止低体温，随后将其送回原饲养笼。在整个实验过程中，迷宫周围所有视觉线索的位置均保持不变，以确保实验条件的一致性。
超声心动图
小鼠超声心动图是一种无创、实时的成像技术，对于评估心脏结构和功能至关重要，已广泛应用于心血管疾病模型研究。检查在全身麻醉下进行，并按照先前描述的方案在整个过程中维持麻醉状态。将小鼠仰卧位置于恒温控制平台，平台温度维持在37 °C。四肢轻轻固定后，均匀涂抹脱毛膏于胸腹部区域。1–2分钟后彻底清除所有毛发和残留的脱毛膏，以确保最佳的超声透射质量。为实现实时生理监测，通过导电凝胶将电极片连接至四肢，持续记录心电图和呼吸频率。为获取标准超声切面，调整小鼠体位，使其头部略高于尾部，确保心脏长轴与平台平行。操作中需特别注意避免探头对胸壁施加过大压力，以免改变心脏几何形态并影响测量准确性。在剃毛区域涂抹足量无气泡的超声耦合剂（厚度2–5 mm）。使用高频线阵探头（30–50 MHz），探头方向标记始终朝向小鼠头部。探头初始位置与小鼠身体长轴平行，随后逆时针旋转约30°–45°。通过精细调整，获得清晰的左心室心尖旁长轴切面。当超声图像清晰显示左心室腔、主动脉瓣和二尖瓣，且心尖与主动脉流出道呈水平对齐时，开始动态图像采集。所有图像均由经验丰富的操作者在一致的参数设置下采集，以确保数据的可比性。检查结束后，按照标准程序清洁超声探头，并擦去小鼠体表残留的耦合剂。随后将小鼠转移至温暖的笼中，密切监测直至其完全从麻醉中恢复并恢复正常活动能力。
石蜡切片的制备
行为学测试完成后，通过腹腔注射戊巴比妥钠（20 mg/kg）对小鼠进行麻醉。随后经心脏灌注生理盐水，再灌注10%多聚甲醛进行全身固定（见材料表）。脑组织被小心取出后，置于10%多聚甲醛中，在室温下固定72小时。需要注意的是，由于心脏灌注会改变心肌微结构，本研究中用于组织学分析的心脏样本特异性地取自未接受灌注操作的小鼠，其余处理条件均保持一致。固定完成后，组织在流动水中冲洗6小时。随后使用自动组织处理机（见材料表）进行梯度脱水，依次浸入60%、70%和90%乙醇中各1小时，再浸入95%和100%乙醇中各2小时。脱水后的样品经二甲苯透明处理2小时，然后在60°C下用石蜡浸润3小时。最后，使用包埋机将组织包埋于石蜡中，并确保标准解剖学方向。待包埋块完全凝固后，用旋转式切片机切出厚度为4 µm的连续切片，贴附于聚-L-赖氨酸包被的玻璃载片上，自然晾干后保存，以备后续染色与分析。
苏木精-伊红染色
采用苏木精-伊红（HE）染色法对脑组织和心脏组织进行组织学检查，以评估缺氧性损伤及电针干预的治疗效果。将4 µm厚的组织切片依次浸入二甲苯I和二甲苯II中各10分钟以脱蜡，随后通过梯度乙醇溶液（100%、95%和80%，每级2分钟）进行水化，最后用蒸馏水冲洗。染色时，切片浸入苏木精染液中染色3–8分钟，直至细胞核清晰着色，然后用流水冲洗以促使其蓝化，再用伊红复染1–3分钟，使细胞质呈现适当的粉红色。最后，染色后的切片经无水乙醇脱水、二甲苯透明处理，并用中性树胶封片。
尼氏染色
为了评估海马区神经元的存活状态，采用尼氏染色法观察神经元内尼氏体的分布及细胞形态。在对脑组织石蜡切片进行脱蜡和复水后，将切片浸入预热的甲苯胺蓝染色液中，于56 °C恒温孵育箱中孵育1 h。染色完成后，用蒸馏水轻轻冲洗切片，随后转移至尼氏分化液中分化数秒至2 min。在显微镜下密切观察分化过程，直至背景接近无色为止。随后，将已分化的切片经无水乙醇系列快速脱水，二甲苯透明，最后用中性树脂封片，以实现长期保存和观察。
马松三色染色
马松三色染色法是一种经典的结缔组织染色技术，主要用于区分心肌组织中的胶原纤维与肌纤维。在对心肌石蜡切片进行脱蜡和复水处理后，按照马松三色染色试剂盒提供的说明书进行染色操作（参见材料表）。染色步骤如下：首先，将切片浸入新配制的韦格特铁苏木精工作液中染色4分钟，以标记细胞核，期间轻轻振荡以确保染色均匀；随后，用流水冲洗切片，再用1%酸性乙醇分化5–10秒，接着用蓝化液处理4分钟，以获得清晰的蓝紫色细胞核染色效果。之后，切片用猩红-酸性品红溶液染色5分钟，再用0.2%磷钼酸溶液分化1分钟。经弱酸工作液短暂冲洗1分钟后，切片用0.2%碱性品蓝溶液（pH 6.8）复染2分钟，以突出显示胶原纤维。染色完成后，切片经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，最后用中性树胶封片。所有封片后的切片均使用全自动切片扫描系统（参见材料表）进行数字化采集，以便后续分析。
统计分析
结果以均值 ± 标准误表示。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 LSD 事后检验或 t 检验对数据进行分析。双向方差分析（Two-way ANOVA）用于分析开放旷场实验（OFT）和莫里斯水迷宫（MWM）的数据。显著性水平设定为 p < 0.05。统计分析和图表由 GraphPad Prism 9.0 软件生成。
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电针可改善小鼠由慢性持续性缺氧诱导的焦虑样行为和认知功能障碍。
通过开放旷场实验（OFT）首次评估了经历慢性缺氧（CH）的小鼠的焦虑样行为（图3A）。轨迹图显示了不同的行为模式：对照组小鼠在新环境中表现出强烈的探索倾向，活动轨迹遍布整个实验区域，主要集中在角落区域（左图）；相比之下，CH模型小鼠的探索行为显著减少，主要停留在角落区域，基本回避中央区域（中图）；在接受电针（EA）治疗后，缺氧小鼠的探索行为有所改善，中央区域的活动明显恢复（右图）。定量分析证实，与对照组相比，CH小鼠的总移动距离、在中央区域停留的时间以及进入中央区域的次数均显著降低（均P < 0.001），共同表明缺氧诱导了焦虑样行为。重要的是，EA治疗显著改善了CH引起的行为缺陷（P < 0.001，P < 0.01，图3B-D）。
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本研究证实，长期慢性缺氧可诱导小鼠出现类似焦虑的行为及空间记忆障碍，这一结果与既往研究发现一致26,27。同时，我们发现长期慢性缺氧还可导致心脏功能障碍及心肌结构损伤。然而，目前尚缺乏能够同时改善缺氧所致认知功能障碍和心脏损伤的治疗策略。为此，我们评估了电针干预在改善长期慢性缺氧引起认知功能障碍和心脏功能下降方面的潜在作用。本研究首次证实，在常用于改善认知功能的一组穴位（GV20、GV24、ST36）进行电针刺激，不仅可改善认知功能，还能显著增强心脏功能和心肌结构，实现对缺氧所致认知功能障碍与心脏功能下降的同步改善。因此，本研究从行为学和组织学角度为"心脑同护"提供了客观证据。该发现不仅验证了中医"整体观念"在缺氧相关病变中的科学基础，也为临床共病性心脑疾病提供了一种潜在的非药物治疗策略。
中医的整体观念认为，人体是以脏腑为中心、经络联系的有机整体。诊治疾病时，必须兼顾局部症状以及人体与内外环境之间的协调平衡
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作者无任何利益冲突需要披露。
本工作得到中国黑龙江省自然科学基金（PL2025H264）、燕赵金台（A20240022）以及国家中医药管理局（项目编号：人事教育司〔2021〕272号文）支持项目资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10% 多聚甲醛溶液 | Bioroyee (Beijing) Biotechnology Co., Ltd | RL3234 | |
| ANY-maze | Science | SA201 | 视频追踪系统 |
| C75BL/6J 小鼠 | BEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTD | No.110322220103041767 | 性别：雄性， 体重：18–22 g |
| 一次性针灸针 | Huatuo | 246076 | 一次性无菌针灸针（0.25 mm ´ 13 mm） |
| 电针仪 | Great Wall | KWD-808 I | |
| HistoCore MULTICUT - 半自动旋转式切片机 | 德国，Leica | RM2245 | 石蜡切片机 |
| Hwato 针灸 针 | 苏州医疗用品厂 | 2655519 | |
| 异氟烷 | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-22 | |
| Masson’s 三色染色试剂盒 | solarbio | G1340 | Masson 染色试剂盒 |
| Morris 水迷宫 | Sansbio | SA201 | Morris 水迷宫装置 |
| NanoZoomer 数字病理系统 | Hamamatsu Photonics K. K | C9600-01 | |
| NDP.View 2 | 日本，Sakura | 切片扫描软件 | |
| 小动物麻醉机 | RWD | YL-LE-A106 | |
| Tissue Tech Prisma Plus | 日本，Sakura | 20B2X00014000034 | 全自动染色设备，专为石蜡包埋组织切片、冰冻切片及载玻片细胞标本等染色设计。 |
| Tissue-Tek TEC 6 包埋模块 | 日本，Sakura | M01-021E-02 | 石蜡包埋机 |
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