脊髓损伤后认知功能障碍的电针治疗

摘要

本研究建立了一种标准化的电针治疗程序，旨在治疗脊髓损伤后的认知功能障碍。此外，详细描述了进行Y迷宫和新物体识别实验的方案，以评估电针对改善认知缺陷的疗效。

摘要

脊髓损伤（SCI）是一种致残性极强且破坏性严重的中枢神经系统（CNS）疾病，不仅会导致肢体运动和感觉功能障碍，还会破坏海马和皮层的结构与功能，引发认知功能障碍，严重影响患者的生活质量。因此，探索有效的治疗手段和评估方法至关重要。电针（EA）是一种将传统针灸与现代电疗技术相结合的新型疗法，具有安全性高、不良反应少的优点，已广泛应用于脊髓损伤的治疗。根据中医理论，督脉连接脑与脊髓，因此对督脉上的穴位进行电针刺激可有效恢复脑和脊髓的功能。在本实验方案中，我们采用Allen法构建脊髓损伤模型，介绍了一种用于治疗SCI大鼠认知功能障碍的电针干预方法，并详细描述了Y迷宫和新物体识别（NOR）实验的操作流程，以评估电针对改善大鼠认知缺陷的疗效。本研究不仅为脊髓损伤后认知障碍的治疗提供了可参考的干预方案，也为该病症治疗策略的验证及后续研究探索提供了初步的实验依据。

引言

脊髓损伤（SCI）是一种常见的中枢神经系统（CNS）疾病，通常由外力导致脊髓或其周围结构受损引起。该病症可造成损伤平面以下的感觉、运动及自主神经功能障碍¹。更为严重的是，SCI 还可能引发焦虑、抑郁和认知功能障碍等继发性并发症^2,3，这些并发症会严重影响患者的康复进程，并显著降低其生活质量。多项流行病学研究发现，SCI 患者患阿尔茨海默病（AD）的风险明显高于普通人群^4,5,6。另有研究证实，SCI 患者认知功能障碍的发生率可能高达 60%^5,7。SCI 不仅会导致运动皮层萎缩，还会降低与认知功能相关脑区的神经活动⁸。SCI 后海马、丘脑和皮层区域的炎症反应增强被认为是导致认知功能障碍的重要因素^9,10,11。改善 SCI 相关的并发症（如认知功能障碍）对于提升患者康复效果并促进其重返社会至关重要。

针灸是传统中医（TCM）的重要组成部分，以其显著的临床疗效而闻名。电针（EA）是一种创新疗法，将传统针灸与现代电刺激技术相结合¹²。它通过在特定穴位施加低压电流来刺激神经和肌肉，对慢性疼痛及神经系统损伤后的功能恢复具有治疗作用^13,14,15。大量研究表明，电针可促进脊髓损伤（SCI）后的神经功能恢复，并减轻神经病理性疼痛、神经源性膀胱和痉挛等并发症^16,17,18,19。根据中医理论，督脉与脑和脊髓相连，影响其功能²⁰。我们发现，在督脉的大椎（GV14）和命门（GV4）穴位施加电针可减轻神经炎症，抑制胶质瘢痕形成，从而促进脊髓损伤后的运动功能恢复²¹。此外，我们的研究还证实，在督脉的百会（GV20）和印堂（GV29）穴位进行电针刺激可增强阿尔茨海默病（AD）模型小鼠的认知能力^22,23。然而，电针对脊髓损伤后认知障碍的潜在治疗作用仍缺乏充分研究。

本研究描述了电针治疗脊髓损伤大鼠认知功能障碍的操作方法，包括穴位选择、针刺角度、治疗时长等细节。此外，我们采用Y迷宫和新物体识别实验，结合病理学评估，以评价电针治疗认知功能障碍的效果。本研究旨在为该病症的临床治疗提供参考依据。

方案

所有实验操作均严格遵守美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》，并经北京中医药大学动物伦理委员会批准（批准编号：BUCM-2024042505-2065）。

1. 动物准备

1. 选择体重为220.0 g ± 20.0 g的成年雄性Sprague Dawley（SD）大鼠用于实验。
2. 将动物饲养于北京中医药大学实验动物中心，环境温度控制在（24 ± 2）°C，12小时明暗循环，自由摄取无菌饮水和标准颗粒饲料。 随意摄取.
3. 实验前将所有动物在环境中适应7天。
4. 将24只SD大鼠随机分为三组（每组n = 8）：假手术组（Sham组）、脊髓损伤模型组（Model组）和电针组（EA组）。实验设计的时间轴示意图如下所示 图1.

2. 脊髓损伤模型的建立

注意：大鼠在手术前禁食禁水 8 小时，手术器械经高温蒸汽灭菌。脊髓损伤（SCI）模型采用 Allen 法的改良方法建立²⁴。

1. 将大鼠放入麻醉诱导箱中，使用含4%异氟烷（1 L/min）的氧气进行诱导麻醉，直至大鼠完全麻醉。
2. 将大鼠从诱导箱中取出，将其鼻部和口部置于麻醉面罩下。调整异氟烷浓度至1.5%–2%以维持麻醉状态。
   注意：在大鼠麻醉过程中，必须密切监测其状态。若大鼠出现呼吸浅快或体温下降，应降低异氟烷浓度，以避免麻醉过深。
3. 剃除大鼠背部毛发，充分暴露手术区域。用碘伏和酒精对手术区域进行消毒。
4. 定位第十胸椎（T10），在T10处做一长约2.5 cm的正中纵向切口。
5. 使用手术刀分离背部肌肉，暴露棘突及胸椎旁肌肉。用止血钳去除T10的棘突和椎板，暴露约10 mm长的脊髓节段。
6. 使用改良的Allen装置对暴露的硬脊膜进行精确打击（200千达因），以建立中度挫伤模型。
   注意：脊髓损伤（SCI）模型成功的标志为损伤部位硬脊膜充血、水肿以及出现尾部痉挛性摆动。假手术组大鼠接受相同的手术操作，包括椎板切除，但不损伤脊髓。
7. 用明胶海绵覆盖硬脊膜，并逐层缝合伤口。
8. 将大鼠置于设定为37 °C的恒温加热垫上，持续监测直至其恢复意识。
9. 术后每日肌肉注射青霉素钠一次，连续三天，以预防感染。此外，每日进行2–3次膀胱按摩，以促进排尿。

3. 电针治疗

1. 在成功建立脊髓损伤（SCI）模型后24小时进行电针（EA）干预。
2. 准备一次性无菌针灸针（直径：0.30 mm；长度：25 mm）。
3. 根据中医理论及临床经验，选取百会（GV20）、大椎（GV14）和命门（GV4）穴位进行电针治疗。
4. 准备黑色丝袜，引导大鼠钻入黑色丝袜中，用绳子将大鼠固定在木板上。
   注意：绑绳应松紧适度，避免因绑缚过紧导致大鼠窒息，或因过松导致其逃脱。
5. 定位GV20穴位：位于顶骨中心，即额部中线与两耳尖连线中点的交点处；定位GV14穴位：位于第七颈椎（C7）与第一胸椎（T1）之间，背部正中线上；定位GV4穴位：位于第二腰椎（L2）棘突下方的凹陷处，背部正中线上（图2）。
6. 使用医用碘伏和75%医用酒精对穴位进行消毒。
7. 在GV20穴位处以15°角斜向下进针，深度为2–3 mm；在GV14和GV4穴位处以45°角进针，深度为5–7 mm（图3A）。
8. 将针连接至电针治疗仪，设置频率为2 Hz，强度为1 mA，波形选择连续波（图3B、C）。
   注意：该电针干预每日进行一次，持续28天，每次治疗持续20分钟。假手术组和模型组大鼠不接受电针治疗，但每日以相同方式固定20分钟。

4. 运动功能评估（图4）

注意：在第1天^st, 7^th, 14^th, 21^st，以及 28^th 术后各天，采用Basso、Beattie和Bresnahan（BBB）评分对各组大鼠的运动功能进行评估。

1. 将大鼠置于开放且安静的环境中，使其能够自由活动。
2. 观察大鼠后肢的运动情况，并根据既定的评分标准进行评分²⁵。
   注意：两名研究人员在不知晓大鼠分组情况的条件下独立进行评分，每只大鼠的最终评分为两人评分的平均值。

5. 进行Y型迷宫实验（图5）

注意：在EA干预后的第一天（第29天）^th 实验当天，进行了Y迷宫实验，包括自发交替测试和新臂探索测试。Y迷宫实验步骤如图所示 图 5A.

1. 将实验动物笼具置于实验环境中，测试前适应30分钟。
2. 用酒精清洁Y形迷宫装置，并随机将Y迷宫的三个臂分别设定为起始臂、新异臂和另一臂。
3. 在自发交替测试阶段，用挡板封闭新异臂。
4. 将大鼠轻轻放置于起始臂末端，允许其在两个开放臂内自由探索10分钟。记录大鼠进入起始臂和另一臂的次数、行走距离及停留时间。
5. 每只大鼠完成测试后，清除箱体内的排泄物。使用75%医用酒精清洁箱体内部，并用洁净纱布擦干，以避免前一只受试动物遗留的气味干扰。整个实验过程中保持室内环境安静。
6. 移除挡板，在自发交替实验结束后4小时进行新异臂探索实验。
7. 将大鼠轻轻放置于起始臂末端，允许其在三个臂内自由探索5分钟。
8. 记录5分钟内大鼠进入各臂的顺序、进入次数、行走距离及停留时间。

6. 进行新物体识别（NOR）实验（图6）

注意：在电针干预后的第二天（第30天）^th 实验当天，进行了新物体识别（NOR）实验。NOR实验流程如图所示 图6A.

1. 准备一个实验装置，包括一个尺寸为 70 cm × 60 cm × 30 cm 的箱子、蓝色立方体物体和红色圆柱体物体。
2. 将大鼠放入实验箱中，使其自由探索周围环境 10 分钟。
3. 上述实验完成后间隔 1 小时，在实验箱的两个对角角落对称放置两个相同的立方体物体，物体距离箱壁约 10 cm。
4. 将大鼠重新放入实验箱中，使其头部朝向远离物体块的方向，允许其自由探索周围环境 10 分钟，以熟悉物体块。
5. 每只大鼠完成实验后，用酒精彻底擦拭实验箱，以尽量减少残留气味对后续大鼠行为的影响。待箱子干燥后，再放入下一只大鼠。
6. 上述实验完成后间隔 4 小时，将右侧的立方体物体替换为一个圆柱体物体。
7. 再次将大鼠放入实验箱中，使其头部朝向远离物体块的一侧墙壁，允许其在箱内自由探索 5 分钟。
8. 记录大鼠探索圆柱体和立方体物体所用的时间，以及总移动距离和总时间。使用以下公式计算偏好指数：（新物体探索时间 - 旧物体探索时间）/（新物体探索时间 + 旧物体探索时间）× 100%。

7. 进行蔗糖偏好测试

注意：采用单笼饲养以防止动物间因争夺水源而产生社会竞争，从而干扰饮水行为。

1. 准备一个装有1%蔗糖溶液的瓶子和一个装有自来水的瓶子。
2. 将蔗糖溶液瓶和自来水瓶放入笼内，并确保每12小时更换一次它们的位置。
3. 让大鼠适应蔗糖水和自来水48小时。随后，在不进行禁食的情况下，剥夺大鼠饮水24小时。
4. 将一瓶蔗糖水和一瓶自来水重新放入笼内。2小时后更换两瓶的位置，记录4小时内每种液体的消耗量。使用以下公式计算蔗糖偏好百分比：（蔗糖溶液摄入量 / (蔗糖溶液摄入量 + 水摄入量)）× 100%。

8. 海马体的HE染色

1. 行为学实验结束后，使用3%戊巴比妥钠（2.0 mL/kg）对大鼠进行麻醉。用多聚甲醛进行心脏灌注，取出脑组织并包埋于石蜡中，制备厚度为5 µm的切片。
   注意：多聚甲醛具有刺激性，必须在通风良好的环境中操作。
2. 依次用二甲苯(I)和二甲苯(II)对切片脱蜡，每次10分钟。将切片浸入梯度乙醇中脱水，每个梯度持续3分钟。最后将切片浸入蒸馏水中2分钟。
3. 用苏木精溶液对切片染色10分钟，用水冲洗去除多余染液，冲洗1–3分钟。迅速将切片浸入盐酸乙醇中5–10秒，再次用水冲洗切片。
4. 将切片转移至弱碱性水溶液中返蓝，用水冲洗1–3分钟。随后将切片浸入85%乙醇中3–5分钟。
5. 用伊红溶液对切片染色3–5分钟，染色后水洗并用梯度乙醇脱水。将切片置于二甲苯中5–10分钟。最后用中性树胶封片。
6. 在光学显微镜下以400×放大倍数观察染色后的切片。

9. ELISA 分析

1. 行为学实验结束后，通过腹腔注射戊巴比妥钠（200 mg/kg）处死大鼠，取海马组织。
2. 称量海马组织，并将其转移至预冷的匀浆管中。
3. 在冰上使用组织匀浆器对组织进行匀浆处理。
4. 将匀浆液在 4 °C 条件下以 5000 × g 离心 10 分钟，收集上清液并测定总蛋白浓度。
5. 使用 ELISA 试剂盒测定海马组织中 IL-1β 和 IL-6 的浓度。

10. 统计分析

1. 使用适当的统计分析软件进行统计分析。数据以均值 ± 标准差表示。
2. 对 BBB 评分数据中各组间的差异，采用重复测量的双因素方差分析（ANOVA）及最小显著差异（LSD）检验。
3. 当数据呈正态分布或方差齐性时，采用单因素方差分析（ANOVA）结合 LSD 法比较其他试验中各组间的变异性；否则，采用非参数检验。
4. 若数据符合正态分布，进行 Pearson 相关性分析；否则，进行 Spearman 相关性分析。
5. 当 P < 0.05 时，认为差异具有统计学意义。

结果

EA 改善脊髓损伤大鼠的运动功能
第1天^st 脊髓损伤（SCI）手术后一天，模型组的BBB评分记录为0，表明SCI模型成功建立。在整个1^st, 7^th, 14^th, 21^st，以及28^th 术后第几天，模型组的BBB评分显著低于假手术组（P < 0.01）。值得注意的是，在第7天^th, 14^th，以及28^th 术后数天，电针组的BBB评分显著高于模型组（P < 0.01; 图4).

电针增强脊髓损伤大鼠的认知功能
Y迷宫实验结果（图5A）显示，与假手术组相比，模型组大鼠在新臂中的探索时间比例和探索频率比例均显著降低（P &...

讨论

脊髓损伤（SCI）是一种应激性事件，会对患者的生理和心理造成严重创伤，不仅导致运动和感觉功能障碍，还会引发认知功能障碍³。据报道⁴，脊髓损伤后认知功能下降的风险是健康个体的13倍。与未经历脊髓损伤的同龄人相比，中老年脊髓损伤患者更易罹患阿尔茨海默病（AD）⁶。受伤后，脊髓损伤患者必须适应新的生活方式并重新融入社会。然而，认知功能障碍可能阻碍这一过程，对康复产生负面影响。因此，探索有效的治疗方法以促进脊髓损伤患者的康复至关重要。电针（EA）是中医（TCM）中一种独特的疗法，通过在特定穴位施加电刺激，可增强器官功能，从而有效缓解神经精神类疾病相关症状^26,27。本研究旨在介绍一种用于治疗脊髓损伤大鼠认知功能障碍的电针干预方法，并通过行为学评估手段验证电针疗法的有效性。

中医强调整体观念，将人体视为一个有机整体。经络是气血运行的通...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 生理盐水	北京索莱宝科技有限公司	IN9000, P1022-10
4% 多聚甲醛	碧云天	P0099
75% 医用酒精、碘伏	北京欧贝生物科技有限公司	OB40126-1, HX0098A	用于消毒
针灸针	中研泰和有限公司	ZY500
小动物麻醉机	上海玉研仪器有限公司	ABM
动物行为分析系统	北京中实迪创科技有限公司	ZS-XWT-II
离心机	Eppendorf, 德国	5811FR080384
电针仪	汕头市医用仪器厂有限公司	6805-D	用于 电针治疗
ELISA 试剂盒	江莱生物科技有限公司	JL18365, JL20896	用于检测 IL-1、IL-6 水平
明胶海绵	江西祥恩医疗科技发展有限公司	24092901
苏木精溶液、伊红溶液	Sigma-Aldrich	03971	用于 HE 染色
Infinite Horizon 撞击器	Lexington, KY, 美国	IH-0400	用于构建脊髓损伤模型
异氟烷	深圳瑞沃德生命科学有限公司	R510-22-10
显微镜	OLYMPUS
青霉素钠	Coolaber	CP8271-5g
苯巴比妥钠	Sigma-Aldrich	P3761
SD 大鼠	斯贝福（北京）生物技术有限公司	SCXK2019-0010
SPSS	IBM	Version 26.0	统计学软件
蔗糖	北京索莱宝科技有限公司	S8271
二甲苯	上海阿拉丁生化科技股份有限公司	X112050