许多蛋白质可形成淀粉样纤维，这些纤维具有共同的"交叉β-折叠"结构。本文介绍了如何制备用于X射线纤维衍射的淀粉样纤维样品，以及如何分析所得衍射图谱。
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本文内容
摘要
摘要
淀粉样纤维由错误折叠且自组装的蛋白质构成，具有明确且重复的结构。它们因在蛋白质错误折叠疾病（包括阿尔茨海默病和2型糖尿病）中的重要作用而广为人知，其中不溶性的淀粉样纤维会沉积在组织中。此外，研究发现它们在许多生物体中也具有重要的功能作用，可提供强度、支架支持和保护作用。最早的淀粉样结构模型基于从排列整齐的淀粉样纤维束中收集的X射线纤维衍射数据。这催生了早期通用的交叉β结构模型，随后被来自高度取向和半结晶样品的更精细衍射分析所取代，从而揭示了多肽如何组织成重复结构的详细信息。本文重点描述确定这些纤维基本结构的方法，并概述了来自不同致病性、功能性及合成来源的淀粉样纤维的共同特征。我们介绍了样品制备、数据采集以及后续数据分析的方法，以构建可与实验数据进行比对的结构模型。
引言
淀粉样纤维最初在一组被称为淀粉样变性病（Amyloidoses）的疾病中被发现，这类疾病中蛋白质纤维在组织的细胞外空间积聚1。每种疾病都由特定的前体蛋白引起，该蛋白发生构象改变，形成高度有序且稳定的蛋白质纤维2,3。近年来对淀粉样纤维的定义已扩展至包括在细胞内环境中积聚的纤维。更近的研究还发现了一些功能性系统，这些系统利用淀粉样结构来提供稳定性、黏附性，甚至信息存储功能。尽管能够自组装形成淀粉样纤维的蛋白质结构多种多样，但它们均具有共同的交叉β结构（cross-β structure）4。这种交叉β结构最初由Astbury在鸡蛋清蛋白中描述5，随后Geddes进一步解释了交叉β型丝素蛋白的结构特征6。在这种蛋白质结构中，纤维由垂直于纤维轴排列的β-链组成，这些β-链进一步组装成β-折叠片层，并通过侧链相互结合，形成后来被称为“立体拉链”（steric zippers）的结构7。这种结构通过沿纤维方向平行排列的氢键以及侧链之间的疏水作用、静电作用和极性相互作用，形成高度稳定的有序结构8。
早期的结构研究采用X射线纤维衍射技术来解析淀粉样纤维的结构，其中将纤维排列并定向成束，形成可置于衍射仪X射线束中的淀粉样纤维束9,10。研究人员基于从人类疾病组织中提取或体外（in vitro）生长的多种淀粉样纤维所得的衍射图谱，构建了一个通用的淀粉样纤维结构模型4,，为后续的结构描述提供了基础11。近年来，固态核磁共振（ssNMR）、微晶X射线晶体学以及冷冻电子显微镜（CryoEM）技术的进步，已能够提供交叉-β结构的原子级细节信息11。然而，X射线纤维衍射方法仍然具有重要意义且实用，可提供有关蛋白质重复排列组织的信息。此外，在某些情况下，还可获得与长程有序相关的信息。从根本上说，X射线纤维衍射常用于确认由不同蛋白质形成的淀粉样纤维的存在，而交叉-β衍射图谱是将纤维状组装体归类为淀粉样物质的主要标准之一12。
本文描述了制备淀粉样纤维并对其进行取向以收集X射线纤维衍射数据的方法。此外，我们还详细介绍了如何进一步分析衍射数据，以构建模型结构，预测其衍射图谱，并与从ex-vivo来源的纤维获得的衍射数据进行比较。
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方案
1. X射线纤维衍射用纤维样品的制备
- 在选定的淀粉样蛋白肽形成纤维的最优条件下，将目标蛋白或肽溶解，并使用透射电子显微镜或原子力显微镜评估纤维的形成情况。有关样品制备和成像操作的详细步骤可参见其他文献13。确保所形成的纤维长、直且无分支，如图1所示。例如，图1中的纤维是通过透射电子显微镜（TEM）成像的。将含有纤维的液滴置于电子显微镜载网上，然后用醋酸铀酰进行负染14。
注意：希望纤维在载网上覆盖均匀、分布一致。 - 进行排列，以形成纤维轴理想情况下完全平行的一束纤维（图2A）。
- 使用加热板将蜡烛蜡加热至液态。使用玻璃切割工具（如钻石笔），将1 mm直径的硼硅酸盐玻璃毛细管切成约2–3 cm长，并短暂浸入液态蜡中。通过毛细作用将蜡吸入毛细管内（约1–2 mm长度）。确保蜡的表面平整，以便纤维悬液能够均匀地停留其上。
- 使用橡皮泥将已封蜡的毛细管水平固定于培养皿中，使两端含蜡部分之间保持0.5 mm至2 mm的间隙（图2A）。
- 使用移液器小心地在两个毛细管含蜡端之间悬挂10 µL溶液液滴。确保溶液与两端的蜡接触，但不延伸至玻璃表面。
- 用盖子覆盖培养皿以防止灰尘污染。让样品过夜蒸发，从而实现纤维的排列（见图2A）。
注意：样品完全干燥可能需要数天时间，具体取决于环境温度、湿度以及样品的黏度。 - 密封培养皿；可将样品置于冰箱中低温孵育，或在密闭盒中通过控制湿度孵育，以减缓干燥速度，这可能有助于获得更好的样品排列。
- 在玻璃毛细管中排列淀粉样纤维（图2B）。
- 将一个1 mL注射器（末端连接一小段橡胶管）固定在直径为0.7 mm的硅化玻璃毛细管的宽口端，吸取2–3 cm长的纤维悬液。
- 用熔化的蜡密封毛细管一端，另一端保持开放以允许蒸发。将毛细管垂直放置，干燥数天至数周，直至在毛细管内形成干燥的圆盘状样品（图2B）。
- 将纤维排列成"膜"或薄膜形式（图2C）。
- 将高浓度（例如，>10 mg/mL）的纤维样品置于载玻片、Parafilm膜或聚四氟乙烯片上，覆盖后于空气中干燥至少24小时。样品应干燥形成一层薄而平整的膜。使用手术刀小心将其剥离，然后用胶水或橡皮泥将其固定在玻璃毛细管上。
- 该膜中纤维呈随机排列（见图2C）。小心地将样品安装在测角头上，使X射线束穿过样品边缘，并与膜平面平行（图2C）。
注意：X射线穿过膜表面时，由于纤维随机排列，将产生衍射环（见图2C）。
- 检查样品。
- 在光学显微镜下使用交叉偏振器观察样品，以评估其排列程度。若观察到双折射现象，则表明纤维束排列良好。
- 使用橡皮泥将毛细管中的纤维样品固定在测角头上。在将样品置于X射线束中时，需考虑其为纤维束、膜或圆盘的形态。
- 注意，对于纤维束，样品旋转轴应围绕纤维轴方向（图2A）；而对于圆盘状样品，纤维通常沿毛细管直径方向排列（图2B）；膜状样品则具有两个明确方向（分别平行于和垂直于膜平面）（图2C）。
- 使用实验室X射线设备（用于蛋白质晶体学的CuKα辐射）或同步辐射光源采集衍射图谱（如图3A所示）。曝光时间取决于X射线束强度；应根据所用衍射源的推荐采集时间进行调整。
2. 数据分析
- 使用 CLEARER 进行数据分析15.
注意：X射线纤维衍射图谱分析程序可由通讯作者免费提供给学术用户。其他衍射分析方法也可获得16,17 (www.esrf.fr/computing/expg/subgroups/data_analysis/FIT2D)18. 括号内的斜体字表示菜单命令。- 将衍射图样转换为 .tiff 文件，并将该文件上传至 CLEARER图4).
- 输入衍射参数设置（衍射图样：衍射参数设置），包括TIFF图像中的像素尺寸、X射线源以及样品到探测器的距离。
- 确保衍射图样方向正确，使子午线呈垂直方向（图像处理：旋转）。使用 居中模块（衍射图样：中心图像 居中图像。定义两个主轴（子午线和赤道）：此模块将比较图案沿这两个轴的强度。完成居中后，保存图像，并确保在后续步骤中使用该图像。
- 指定一个合适的角度（沿两个主轴[子午线和赤道]设置），并输出一张显示衍射信号位置与强度关系的图，使用 径向平均模块 (衍射图样：径向平均) (图 4A).
- 使用自动测量并输出衍射信号位置 峰值查找模块 (衍射图样：径向平均：峰位识别) (图4B）。通过调整峰搜索宽度，确保准确检测到所有衍射信号，同时避免检测到噪声。
- 检查信号输出的位置 峰检测 通过使用 缩放 & 测量模块 (衍射图样：缩放 & 测量）。验证所有信号位置均已列出，并正确分配至相应坐标轴。
- 探索晶胞尺寸（b 和 c) 以生成使用观测到的衍射信号 晶胞优化模块 (衍射图样：晶胞优化) (图5A）。检查赤道上出现的强信号，以生成初始猜测值并输入到晶胞输入表中，并指定最小值和最大值[hkl] CLEARER 搜索潜在细胞时所覆盖的索引范围（一个维度为子午方向，默认值为 4.76 Å）。
- 计算可能的晶胞尺寸，并将预测的衍射信号位置与观测到的衍射点进行比较。根据预测信号与实验信号之间吻合程度对晶胞进行评分，显示得分最高的前二十个匹配结果。结合肽前体长度以及来自电子显微镜、原子力显微镜（AFM）或固体核磁共振（ssNMR）的其他信息，辅助选择最符合实验数据和样品特征的晶胞。
3. 使用 CLEARER 进行结构建模及模型验证
- 构建分子模型（PDB 格式）。
注意：使用如 Pymol（DeLano）19 或 Insight II（Accelerys）等蛋白质建模程序，生成前体肽在 β-链构象及 β-折叠排列中的 PDB 坐标。本节描述了一种用于正交晶胞（所有夹角均为 90°）的简单流程。非正交排列也是可能的，但需要更专业的衍射知识，可在 CLEARER 中进一步探索更复杂的晶胞。- 构建肽链在 β-折叠排列中的三维结构，使其适配已确定的晶胞（或多个晶胞）。确保该模型包含晶胞内所有对称相关的对象。
- 将 PDB 模型载入 结构链生成模块（Diffraction Simulation: Structures: Structure Chain Generator），以检查所构建结构的坐标。确保纤维轴和入射束轴被正确指定。输入已确定的晶胞尺寸。检查所选晶胞尺寸是否存在原子碰撞（图 5B）。
- 将 PDB 模型坐标上传至 纤维衍射模拟模块（Diffraction Simulation: Fiber Diffraction Simulation）。
- 输入纤维轴方向、入射束取向、步骤 3.1.2 中选定的晶胞尺寸、X 射线源和探测器设置，然后点击 模拟。对于正交晶胞的模拟，纤维轴由笛卡尔坐标轴定义，该轴与模型中纤维轴的取向相关。
- 确保入射束轴垂直于纤维轴，即位于另外两个可能轴之一上。将模拟设置保存为 .html 文件（文件：另存为）。这些文件可后续上传并编辑，以迭代探索最优模型结构。
- 将生成的模拟图谱以原始格式保存，以便后续分析使用；也可保存为 .tiff 格式（此格式会丢失部分对比度信息）（模拟：将可视图像另存为 TIFF）。然后将这些图谱与实验图谱进行比较。
- 将模拟衍射图谱与实验图谱进行比较，用于展示。
- 使用步骤 2.1.5–2.1.6 测量模拟衍射信号，并与从实验图谱中测得的信号进行比较（图 6）。将结果记录在表格中。
- 使用名为 图层 的模块（Diffraction Pattern: Layers）叠加模拟图谱与实验图谱，以比较信号位置（图 6C）。
- 通过将模拟图谱的一个象限与实验图谱并列排列（如 图 6B 所示），比较实验图谱与模拟图谱之间的信号位置和相对强度8,20,21。
- 评估所提出的晶胞和模型的有效性，然后迭代修改模型和晶胞，以提高模拟图谱与实验衍射图谱之间的相似性。
- 按照步骤 3.1 中所述流程，广泛比较不同模型和晶胞的结果，以测试多种替代方案。确保结合来自其他技术（如透射电子显微镜 TEM、原子力显微镜 AFM 和核磁共振 NMR）的信息，以约束建模过程，从而获得最符合数据的结构模型8,21,22,23。
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结果
CcbMet 示例24：图 1 显示了电子显微镜图像，表明在适合制备X射线纤维样品的载网上存在高密度的淀粉样纤维。图 2 描述了从纤维样品中可获得的不同纹理形态：纤维束（图 2A）、圆盘状（图 2B）、垫状/膜状（图 2C），并标示了X射线束的方向。图 3A 展示了来自拉伸框定向纤维（纹理如 图 2A 所示）的衍射图样，呈现出典型的交叉-β（cross-ß）衍射图样，其中在 4.76 Å 处观察到子午线反射，以及一组来自链长、片层间距和原纤维尺寸的赤道反射。图 3B
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讨论
X射线纤维衍射可用于评估样品是否形成淀粉样结构，并进一步揭示前体蛋白或肽在纤维内的分子排列方式。本文介绍了纤维样品的制备方法、X射线纤维衍射数据的采集及分析流程。关键的是，所获得数据的质量取决于单根纤维内部的有序程度，因此初始样品制备至关重要；此外，纤维是合成来源还是从组织中提取也会影响数据质量。探索淀粉样纤维组装的最佳缓冲体系可能十分必要，因为过量盐分可能掩盖衍射图样。使用盐缓冲液（如磷酸盐缓冲液）制备的纤维可通过洗涤去除多余盐分，从而改善纤维质量和排列程度，获得更高质量的数据。通过优化取向方法也可提升数据质量，例如从第2节所述方法中选择合适方案，或减缓样品干燥过程以延长纤维排列时间。纤维之间的取向越一致，衍射图样越清晰，从数据中可获取的信息也就越多。
在数据分析过程中，可能需要对可能的晶胞进行深入探索，以确定最适合样品的晶胞。考虑肽或蛋白质的尺寸将为进一步判断提供指导。原子力显微镜（AFM）或透射电子显微镜（TEM）的形貌信息有助于为待测试晶胞的选择提供额外细节。随后需要进行模型构建，以检验将模型置于晶胞中是否能够产生与实验衍射图谱相匹配的衍射图样。在衍射模拟过程中，若选择了错...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
作者谨此感谢 Pawel Sikorski 博士和 Edward Atkins 教授在 CLEARER 项目开发及模式分析方面提供的帮助。该项目由 O Sumner Makin 博士编写。本研究工作获得了阿尔茨海默病研究信托基金和英国生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC）的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.7 mm 直径 X 射线 石英玻璃毛细管 | GLAS, W. Muller, D-13503, Berlin, Germany | Q-07-001-80 | |
| 1.5 mm 玻璃毛细管，硼硅酸盐 | Harvard Apparatus Ltd, (Edenbridge, Kent, UK) | BS4 30-0074 | 示例，其他厂商亦有供应 |
| 蛋白质晶体学 X 射线衍射仪 | 多种 | 多个制造商 |
参考文献
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