淀粉样蛋白与交叉β结构

摘要

许多蛋白质可形成淀粉样纤维，这些纤维具有共同的"交叉β-折叠"结构。本文介绍了如何制备用于X射线纤维衍射的淀粉样纤维样品，以及如何分析所得衍射图谱。

摘要

淀粉样纤维由错误折叠且自组装的蛋白质构成，具有明确且重复的结构。它们因在蛋白质错误折叠疾病（包括阿尔茨海默病和2型糖尿病）中的重要作用而广为人知，其中不溶性的淀粉样纤维会沉积在组织中。此外，研究发现它们在许多生物体中也具有重要的功能作用，可提供强度、支架支持和保护作用。最早的淀粉样结构模型基于从排列整齐的淀粉样纤维束中收集的X射线纤维衍射数据。这催生了早期通用的交叉β结构模型，随后被来自高度取向和半结晶样品的更精细衍射分析所取代，从而揭示了多肽如何组织成重复结构的详细信息。本文重点描述确定这些纤维基本结构的方法，并概述了来自不同致病性、功能性及合成来源的淀粉样纤维的共同特征。我们介绍了样品制备、数据采集以及后续数据分析的方法，以构建可与实验数据进行比对的结构模型。

引言

淀粉样纤维最初在一组被称为淀粉样变性病（Amyloidoses）的疾病中被发现，这类疾病中蛋白质纤维在组织的细胞外空间积聚¹。每种疾病都由特定的前体蛋白引起，该蛋白发生构象改变，形成高度有序且稳定的蛋白质纤维^2,3。近年来对淀粉样纤维的定义已扩展至包括在细胞内环境中积聚的纤维。更近的研究还发现了一些功能性系统，这些系统利用淀粉样结构来提供稳定性、黏附性，甚至信息存储功能。尽管能够自组装形成淀粉样纤维的蛋白质结构多种多样，但它们均具有共同的交叉β结构（cross-β structure）⁴。这种交叉β结构最初由Astbury在鸡蛋清蛋白中描述⁵，随后Geddes进一步解释了交叉β型丝素蛋白的结构特征⁶。在这种蛋白质结构中，纤维由垂直于纤维轴排列的β-链组成，这些β-链进一步组装成β-折叠片层，并通过侧链相互结合，形成后来被称为“立体拉链”（steric zippers）的结构⁷。这种结构通过沿纤维方向平行排列的氢键以及侧链之间的疏水作用、静电作用和极性相互作用，形成高度稳定的有序结构⁸。

方案

1. X射线纤维衍射用纤维样品的制备

1. 在选定的淀粉样蛋白肽形成纤维的最优条件下，将目标蛋白或肽溶解，并使用透射电子显微镜或原子力显微镜评估纤维的形成情况。有关样品制备和成像操作的详细步骤可参见其他文献¹³。确保所形成的纤维长、直且无分支，如图1所示。例如，图1中的纤维是通过透射电子显微镜（TEM）成像的。将含有纤维的液滴置于电子显微镜载网上，然后用醋酸铀酰进行负染¹⁴。
   注意：希望纤维在载网上覆盖均匀、分布一致。
2. 进行排列，以形成纤维轴理想情况下完全平行的一束纤维（图2A）。
   1. 使用加热板将蜡烛蜡加热至液态。使用玻璃切割工具（如钻石笔），将1 mm直径的硼硅酸盐玻璃毛细管切成约2–3 cm长，并短暂浸入液态蜡中。通过毛细作用将蜡吸入毛细管内（约1–2 mm长度）。确保蜡的表面平整，以便纤维悬液能够均匀地停留其上。
   2. 使用橡皮泥将已封蜡的毛细管水平固定于培养皿中，使两端含蜡部分之间保持0.5 mm至2 mm的间隙（图2A）。
   3. 使用移液器小心地在两个毛细管含蜡端之间悬挂10 µL溶液液....

结果

CcbMet 示例²⁴：图 1 显示了电子显微镜图像，表明在适合制备X射线纤维样品的载网上存在高密度的淀粉样纤维。图 2 描述了从纤维样品中可获得的不同纹理形态：纤维束（图 2A）、圆盘状（图 2B）、垫状/膜状（图 2C），并标示了X射线束的方向。图 3A 展示了来自拉伸框定向纤维（纹理如 图 2A 所示）的衍射图样，呈现出典型的交叉-β（cross-ß）衍射图样，其中在 4.76 Å 处观察到子午线反射，以及一组来自链长、片层间距和原纤维尺寸的赤道反射。图 3B

讨论

X射线纤维衍射可用于评估样品是否形成淀粉样结构，并进一步揭示前体蛋白或肽在纤维内的分子排列方式。本文介绍了纤维样品的制备方法、X射线纤维衍射数据的采集及分析流程。关键的是，所获得数据的质量取决于单根纤维内部的有序程度，因此初始样品制备至关重要；此外，纤维是合成来源还是从组织中提取也会影响数据质量。探索淀粉样纤维组装的最佳缓冲体系可能十分必要，因为过量盐分可能掩盖衍射图样。使用盐缓冲液（如磷酸盐缓冲液）制备的纤维可通过洗涤去除多余盐分，从而改善纤维质量和排列程度，获得更高质量的数据。通过优化取向方法也可提升数据质量，例如从第2节所述方法中选择合适方案，或减缓样品干燥过程以延长纤维排列时间。纤维之间的取向越一致，衍射图样越清晰，从数据中可获取的信息也就越多。

在数据分析过程中，可能需要对可能的晶胞进行深入探索，以确定最适合样品的晶胞。考虑肽或蛋白质的尺寸将为进一步判断提供指导。原子力显微镜（AFM）或透射电子显微镜（TEM）的形貌信息有助于为待测试晶胞的选择提供额外细节。随后需要进行模型构建，以检验将模型置于晶胞中是否能够产生与实验衍射图谱相匹配的衍射图样。在衍射模拟过程中，若选择了错.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.7 mm 直径 X 射线 石英玻璃毛细管	GLAS, W. Muller, D-13503, Berlin, Germany	Q-07-001-80
1.5 mm 玻璃毛细管，硼硅酸盐	Harvard Apparatus Ltd, (Edenbridge, Kent, UK)	BS4 30-0074	示例，其他厂商亦有供应
蛋白质晶体学 X 射线衍射仪	多种		多个制造商