硫辛酸在真菌性角膜炎中激活Nrf2/HO-1细胞保护通路，降低炎症性细胞因子水平并减轻角膜损伤。这种宿主导向疗法相较于传统抗真菌药物具有更优的安全性特征，同时通过增强内源性抗氧化通路，为氧化应激驱动的眼部疾病的治疗提供了机制性见解。
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硫辛酸在真菌性角膜炎中激活Nrf2/HO-1细胞保护通路，降低炎症性细胞因子水平并减轻角膜损伤。这种宿主导向疗法相较于传统抗真菌药物具有更优的安全性特征，同时通过增强内源性抗氧化通路，为氧化应激驱动的眼部疾病的治疗提供了机制性见解。
硫辛酸（LA）是一种具有优异眼表安全性的二硫醇类抗氧化剂，本研究探讨了其在抑制驱动真菌性角膜炎的氧化-炎症微环境中的作用。人角膜上皮细胞在浓度高达60 µM的LA处理下仍保持良好的细胞活力，且未出现存活率下降，并在随后的实验中表现出对氧化应激和炎症反应的显著调节能力。 Aspergillus fumigatus 挑战条件下，LA诱导核因子红系2相关因子2（Nrf2）核转位增加三倍，并使其下游效应分子血红素加氧酶-1（HO-1）上升五倍。使用ML385对Nrf2进行药理学沉默，或使用锡原卟啉IX阻断HO-1的催化活性，均可消除这些分子事件，并恢复白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α的表达，证实了Nrf2/HO-1通路的严格依赖性。在小鼠角膜炎模型中的平行实验进一步验证了上述结果 体外 观察结果：局部应用LA使角膜混浊程度和炎症评分降低了47%，同时使角膜中Nrf2和HO-1的表达水平升高，并使细胞因子转录本减少一半；联合使用SnPPIX则消除了上述益处。综上所述，这些数据揭示了一个清晰的机制层级：在临床可达到的浓度下，LA可增加Nrf2蛋白水平并促进其核转位，增强HO-1活性，从而抑制病原体诱导的细胞因子紊乱。这些发现表明，LA是一种具有高度可转化性的宿主导向辅助治疗手段，能够与抗真菌化疗协同作用，并提示以Nrf2为核心的调控策略在治疗威胁视力的角膜炎症方面具有更广泛的治疗前景。
真菌性角膜炎（FK）现已被视为一种普遍的眼科急症，每年导致超过100万例经培养证实的病例，在热带和亚热带地区造成不成比例的角膜盲1,2。在美国，其发病率估计接近每10万人中有6-8例，在农业经济体中甚至更高，凸显出这一日益严重的全球性威胁，尤其在植物性外伤或佩戴隐形眼镜后，主要影响劳动年龄人群3,4。丝状真菌，尤其是Fusarium和Aspergillus属的物种，是主要的致病因素，它们在温暖潮湿的气候中繁殖，并利用眼部微小损伤引发感染5。
尽管已有半个世纪的临床应用，5%那他霉素仍是唯一专门获批用于真菌性角膜炎（FK）的局部用药；然而，其多烯类化学性质导致角膜穿透性差、需频繁给药，且并非在所有地区均可获得6,7。令人担忧的是，来自南亚的连续监测研究显示，那他霉素和三唑类药物的最低抑菌浓度呈逐步上升趋势，其中镰刀菌（Fusarium）分离株对那他霉素的耐药性每年增长≥6%，伏立康唑也呈现类似上升趋势8。这些数据与临床治疗失败的报道相吻合，并进一步支持预测：由于现有药物治疗的不足，FK治疗药物市场将从2023年的9亿美元增长至2033年的14.8亿美元。临时性的外科干预措施，如结膜瓣覆盖或穿透性角膜移植术，虽可在难治性溃疡中挽救眼部结构，但耗费资源且对视力恢复有限9。总体而言，这些局限性凸显了开发以宿主为导向或具有多靶点作用策略的迫切需求，以超越单纯的抑真菌作用。
目前认为，氧化应激及其引发的炎症级联反应是真菌致病性和角膜瘢痕形成的关键决定因素。真菌入侵时，角膜上皮细胞和局部免疫细胞（包括结膜肥大细胞、角膜缘树突状细胞和基质角质细胞）通过模式识别受体（如 Dectin-1 和 Toll 样受体）启动固有免疫应答10。中性粒细胞来源的活性氧（ROS）作为抗菌氧化爆发反应的一部分在感染的基质中积聚，而浸润的巨噬细胞和 T 淋巴细胞则通过细胞因子扩增作用维持慢性炎症11。矛盾的是，丝状真菌会上调自身的抗氧化通路（例如 Yap1 调控的超氧化物歧化酶），以在这一不利环境中存活。过量的 ROS 进而激活 NF-κB 依赖的 IL-1β、TNF-α 及其他促炎介质的转录，导致组织破坏和角膜混浊12。在内源性细胞保护机制的核心是核因子红系2相关因子2（Nrf2），其向细胞核的转位可协调多种角膜细胞类型（包括上皮细胞、角质细胞和内皮细胞）中血红素加氧酶-1（HO-1）及一系列解毒酶的表达13,14。衰老、糖尿病和慢性炎症会下调该通路，使眼组织易于受到氧化损伤，而通过遗传或药理手段增强 Nrf2 功能则可加速上皮伤口闭合，并抑制多种角膜损伤中的细胞因子激增15。
概念验证研究已开始利用FK中的这一通路。天然小分子化合物如紫苏醛16、没食子酸17、羟基酪醇18以及有机硒化合物依布硒19可通过增强Nrf2-HO-1信号通路并直接损害真菌活力，实现双重抗真菌和抗炎作用。共递送抗真菌药物与抗氧化剂的纳米医学平台进一步展示了将病原体清除与宿主防御增强相结合的治疗前景20,21。然而，这些候选药物中的许多仍面临与制剂复杂性或尚未证实的眼部安全性相关的转化障碍。
硫辛酸（LA）是一种广泛存在的二硫醇类抗氧化剂，具有明确的全身安全性记录和卓越的药效学多样性。根据肝脏和神经组织的研究10,12，硫辛酸被认为可直接修饰Kelch样ECH相关蛋白-1（Keap1）上的半胱氨酸残基（特别是Cys151、Cys273和Cys288），破坏其与Nrf2的相互作用，从而阻止Nrf2的泛素化和蛋白酶体降解，导致Nrf2蛋白水平升高、核转位增强以及HO-1转录上调。然而，Keap1与硫辛酸在角膜上皮细胞中直接相互作用尚需进一步研究证实。硫辛酸在肝脏、神经及眼部氧化损伤模型中均显示出细胞保护作用13,15。其两亲性特性有助于组织渗透，且不产生多烯类化合物所见的膜毒性，目前已有用于局部和全身治疗的临床制剂。然而，硫辛酸调节角膜炎症微环境并由此改善真菌性角膜炎（FK）的能力尚未得到系统深入的研究。
因此，本研究探讨了α-硫辛酸（LA）是否可通过激活Nrf2/HO-1通路同时抑制促炎性细胞因子，从而缓解由A. fumigatus引起的真菌性角膜炎。通过使用人角膜上皮细胞和已验证的小鼠真菌性角膜炎（FK）模型，我们明确了剂量-效应关系，利用特异性抑制剂解析了其作用机制，并将治疗效果与未感染对照组及感染后溶剂处理组进行了比较。据我们所知，这是首次系统性研究，通过全面的剂量-效应特征分析、使用Nrf2和HO-1特异性药理抑制剂进行机制解析，以及在细胞和动物模型中的验证，确立α-硫辛酸在真菌性角膜炎中的治疗功效。本研究独特地整合了分子、细胞和转化水平的检测指标，为Nrf2/HO-1通路在介导LA抗炎作用中的必要性提供了确凿证据。通过整合分子、细胞和体内多层面的检测结果，我们旨在对LA作为一种具有高度可转化性的宿主导向疗法进行全面评估，以同时应对真菌性角膜炎治疗中病原体清除与炎症控制的双重需求。
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所有动物实验程序均经机构动物护理和使用委员会批准（方案编号：IACUC-2024-FK-007），并遵循视光学与视觉研究协会关于动物在眼科和视觉研究中使用的声明。选用8至10周龄、体重20至25克的雄性C57BL/6小鼠，在温度22 ± 2 °C、相对湿度50%–60%、12小时光照/12小时黑暗循环的受控环境条件下，饲养于独立通风笼具中。这些无特定病原体动物购自Charles River Laboratories（见材料表）。所有小鼠在实验操作前均经过1周的适应期，以适应新环境，并可自由摄取标准啮齿类动物饲料和饮水。
警告：Aspergillus fumigatus 是一种需要生物安全二级防护的病原体。所有真菌培养物必须在经过认证的生物安全柜中操作，并使用适当个人防护装备，包括手套、实验服和眼部防护装置。二甲基亚砜（DMSO）具有可燃性，且可穿透皮肤；应在通风良好的区域操作，避免直接接触。氯胺酮和赛拉嗪为管制药品，须根据机构规定进行安全储存并做好相关记录。
实验准备
根据实验流程准备所有所需试剂、药物和材料（参见材料表和补充图1中的示意图）。外消旋体（±）-α-硫辛酸（LA）储备液通过将外消旋α-硫辛酸（1,2-二硫环戊烷-3-戊酸）溶于DMSO中配制成60 mM浓度，并分装为单次使用量，于-80 °C保存，以防止氧化降解。Nrf2抑制剂ML385和HO-1抑制剂SnPPIX同样进行配制并分装为单次使用量，以避免冻融循环。所有细胞培养基和添加剂均在无菌条件下配制，并在使用前预热至37 °C。
所有被真菌培养物污染的材料，包括琼脂平板、培养管和一次性塑料制品，在丢弃至生物危害废物容器前，均需在121 °C下高压灭菌30分钟。含有机溶剂的化学废物应单独收集，并通过机构的环境健康与安全规程进行处理。动物组织和尸体通过经批准的生物医学废物处理服务进行焚烧。
真菌培养与感染制备
Aspergillus fumigatus 在37 °C下于沙保葡萄糖琼脂培养基中培养5-7天，直至观察到成熟的分生孢子形成。通过加入含0.05%吐温-80的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）淹没成熟培养物以收集分生孢子，并将分生孢子悬液经无菌纱布过滤，去除菌丝碎片。使用血细胞计数板测定分生孢子浓度，并根据已发表的真菌性角膜炎模型将其调整至既定浓度。对于 体外 实验，1 × 106 每毫升分生孢子数（感染复数为10:1）的选择依据是既往研究，这些研究表明该浓度可在维持角膜上皮细胞足够存活率以进行后续分析的同时，有效诱导强烈的炎症反应16,17。对于 体内 研究，1 x 107 选择以分生孢子/mL作为接种量，是因为该接种浓度可在感染后第5天产生一致且中等严重程度的角膜炎，并具有可重复的疾病评分，从而在不过度增加病死率的前提下，提供足够的动态范围以评估治疗效果。16,19.
动物处理与角膜感染
在全身麻醉（腹腔注射氯胺酮 100 mg/kg 和赛拉嗪 10 mg/kg）下，使用无菌 25G 针头在角膜中央制造三条 1 mm 的线性划痕，随后局部滴加 5 µL A. fumigatus 分生孢子悬液，以诱导真菌性角膜炎。小鼠被随机分配至各治疗组（每组 n=8）：对照组（未感染）、感染对照组、感染+LA 治疗组（局部使用 60 µmol/L LA，每日 4 次）以及感染+LA+SnPPIX 治疗组（LA 每日局部使用，联合每日腹腔注射 5 mg/kg SnPPIX）。在感染后第 5 天进行临床评估并采集组织样本。
动物操作注意事项：所有涉及麻醉动物的操作均应在无菌条件下进行。在麻醉期间需持续监测动物的呼吸抑制情况。受污染的垫料、手术废弃物及感染组织应按照机构生物危害废物管理规程，经高压灭菌后焚烧处理。
细胞培养与处理
人角膜上皮细胞（HCECs）购自ATCC，使用添加10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和1% L-谷氨酰胺的DMEM/F-12培养基，在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中培养。细胞每3–4天传代一次，当融合度达到80%–90%时进行传代，实验所用细胞代次控制在第3至第8代之间以保证实验一致性。实验处理前，将细胞以每孔5 × 10⁴个的密度接种于合适的培养板中，静置培养24小时使其贴壁。所有实验处理均在此基础上进行 体外 机制实验中，细胞首先暴露于 Aspergillus fumigatus 以10:1的感染复数（MOI）接种分生孢子，感染4小时以建立感染模型，随后加入单独或联合的LA（60 µM）、ML385（5 µM）或SnPPIX（1 µM），继续培养24小时后收集样本。该序贯实验设计可评估LA对已建立真菌感染的治疗作用，而非预防性干预效果。
细胞活力评估（CCK-8分析）
使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）评估细胞活力。将细胞以每孔5 × 104个的密度接种于96孔板中，处理前于37 °C孵育24小时。药物处理后，向每孔加入10 µL CCK-8溶液，于37 °C孵育2小时。使用多功能酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。每个实验条件设八个复孔，且实验独立重复三次。对照溶剂（DMSO）浓度保持在0.1%以下，以避免细胞毒性效应。
RNA 提取与定量实时 PCR
使用 RNeasy Mini Kit，根据制造商的说明书从培养的细胞和角膜组织中提取总 RNA。组织样本在 RLT 缓冲液中使用组织匀浆器在 50 Hz 条件下匀浆 2 分钟。采用分光光度计评估 RNA 的质量和浓度，选取 260/280 比值为 1.8–2.0 的样本用于后续分析。使用 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit 进行第一链 cDNA 合成，每反应使用 1 µg 总 RNA。定量 PCR 使用基于 SYBR Green 的 qPCR 预混液，在实时 PCR 系统上进行，反应条件为 95 °C 预变性 2 分钟，随后进行 40 个循环（95 °C 变性 15 秒，60 °C 退火延伸 1 分钟）。通过熔解曲线分析验证扩增产物的特异性。所有引物在使用前均经过扩增效率（90%–110%）和特异性验证。相对 mRNA 表达量采用 2(-ΔΔCT) 法计算，并以 GAPDH 作为内参基因。
蛋白质提取与蛋白质印迹分析
进行总蛋白提取时，使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液裂解细胞和组织。核蛋白与胞质蛋白组分的制备采用NE-PER核蛋白与胞质蛋白提取试剂盒，操作按照制造商提供的说明书进行。蛋白浓度通过Bradford法测定。等量蛋白（30–50 µg）经SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜上。用含0.1% Tween-20的Tris缓冲盐水（TBS）配制的5%脱脂牛奶封闭1小时后，将膜在4 °C下与一抗孵育过夜，随后在室温下与相应的HRP标记二抗孵育1小时。使用增强型化学发光试剂显影，曝光时间根据信号强度调整为30–180秒。采用ImageJ软件对蛋白条带进行定量分析，总蛋白以内参β-actin校正，核蛋白以内参lamin B1校正。
临床评估与组织学分析
角膜病变严重程度采用基于小鼠真菌性角膜炎既定方案的标准化临床评分系统进行评估22。该评分系统对三个参数按0-4分进行评分：角膜混浊度（0 = 透明，4 = 完全不透明）、表面不规则性（0 = 光滑，4 = 严重溃疡伴穿孔）和炎症反应（0 = 无浸润，4 = 密集浸润伴前房积脓），总分范围为0至12分。所有临床评估均由两名独立观察者完成，观察者对治疗分组信息设盲，且观察者间一致性超过90%。角膜照片采用配备数码相机的裂隙灯生物显微镜拍摄。用于组织学分析的眼球经摘除后，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，并切成5 µm厚切片。切片经苏木精-伊红染色以评估一般形态结构。
酶联免疫吸附测定（ELISA）
根据制造商说明书，使用商用ELISA试剂盒定量检测细胞培养上清液和角膜组织匀浆中分泌的IL-1β和TNF-α水平。细胞培养上清液在处理24小时后收集，角膜组织则在含有蛋白酶抑制剂的PBS中进行匀浆。样品于4 °C以12,000 × g 离心10分钟，取上清液用于ELISA分析。所有样品均设复孔检测，细胞因子浓度通过标准曲线计算得出。
统计分析
所有实验均进行了适当的生物学重复（n ≥6） 体外 研究，动物实验n=8）并独立重复至少3次。数据以均值±均值标准误（SEM）表示。使用GraphPad Prism 9.0版本进行数据分析。具体而言，采用正态性检验函数（Shapiro-Wilk）评估数据分布，对于包含两组以上组别的实验采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey多重比较检验，两组之间的比较则采用非配对Student t检验。图表以分组柱状图呈现，个体数据点以散点图形式叠加显示，误差线代表均值标准误。
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实验流程表明，硫辛酸治疗可有效调节Nrf2/HO-1信号通路，从而抑制真菌性角膜炎模型中的炎症反应。
硫辛酸及通路特异性抑制剂的细胞毒性评估
初步的剂量-反应研究用于确定本研究中各化合物的最佳使用浓度。硫辛酸（LA）在人角膜内皮细胞（HCECs）中表现出良好的生物相容性，在24小时暴露后，浓度高达60 µM时仍能维持细胞活力，因此将60 µM确定为后续机制研究中的最佳LA浓度（图1A）。相比之下，Nrf2抑制剂ML385的安全性范围较窄，初步剂量-反应实验确定其最佳浓度为5 µM。HO-1抑制剂SnPPIX在所测试的化合物中表现出最窄的治疗窗，2.5 µM和5 µM的SnPPIX均显著降低细胞活力，与对照组相比差异明显，因此确定1 µM SnPPIX为机制研究的最佳浓度（图1C）。
LA 激活真菌感染的角膜上皮细胞中的 Nrf2/HO-1 信号通路
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本研究结果证实，硫辛酸（LA）是一种有效的 Nrf2/HO-1 信号轴激活剂，可通过抑制促炎性细胞因子的表达并维持角膜结构完整性，从而缓解真菌性角膜炎（FK）。与近期研究显示二硫杂环戊烷类化合物在氧化应激相关疾病中可强烈激活 Nrf2 的结果一致15，LA 使 HO-1 转录水平升高五倍，并使 IL-1β 和 TNF-α 的分泌减少一半，效果优于多种已报道用于眼部炎症的植物源性激活剂2,23。近期关于紫苏醛16、没食子酸17、羟基酪醇15 和依布硒啉19 的研究也表明其在 FK 模型中具有类似的 Nrf2/HO-1 激活作用，但 LA 凭借其明确的临床安全性、已有的眼科制剂形式以及更优的药学特性，在转化应用方面更具优势。严格的药理学层级关系表明，LA 可上调 Nrf2 蛋白水平，促进其...
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作者声明本研究不存在任何利益冲突。本研究的设计、实施和结果解读未受到任何外部资金支持或商业关系的影响。
本研究由济南市第二人民医院眼科内部资金资助。作者衷心感谢实验室工作人员在细胞培养维护和动物模型操作方面提供的技术支持。特别感谢机构动物护理和使用委员会对实验方案的审查和批准。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗 HO-1 | Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA | #8803 | |
| 抗-β-肌动蛋白 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A5441 | |
| 抗层粘连蛋白 B1 | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab16048 | |
| 抗 Nrf2 | Abcm, Cambridge, MA, USA | ab62352 | |
| Aspergillus fumigatus | ATCC 204305 | N/A | |
| Bradford 定量试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | 5000006 | |
| C57BL/6 小鼠 | Charles River Laboratories | N/A | |
| 细胞计数试剂盒-8（CCK-8） | Dojindo Laboratories, Kumamoto, 日本 | 343-07623 | |
| DMEM/F-12 培养基 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| ECL 显色试剂 | Thermo Fisher Scientific | 32106 | |
| 胎牛血清 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| GAPDH 正向引物 | 定制合成 | Custom | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 高容量 cDNA 反转录试剂盒 | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| HO-1 正向引物 | 定制合成 | Custom | |
| HO-1 反向引物 | 定制合成 | Custom | |
| HRP 标记抗小鼠 IgG | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab205718 | |
| HRP 标记抗兔 IgG | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab205719 | |
| 人角膜上皮细胞（HCECs） | ATCC, Manassas, VA, USA | CRL-11135 | |
| IL-1β ELISA 试剂盒 | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | DY201 | |
| 硫辛酸（LA） | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1395 | |
| ML385（Nrf2 抑制剂） | MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA | HY-100523 | |
| NanoDrop 2000 分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| NE-PER 核与胞质提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| Nrf2 正向引物 | 定制合成 | Custom | |
| Nrf2 反向引物 | 定制合成 | Custom | |
| 含 0.05% Tween-80 的 PBS | 自行配制 | Custom | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| PowerUp SYBR Green 主混合液 | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific | A25741 | |
| QuantStudio 5 实时荧光定量 PCR 系统 | Thermo Fisher Scientific | A28140 | |
| RIPA 裂解缓冲液 | 自行配制 | Custom | |
| RNeasy Mini 试剂盒 | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| 沙氏葡萄糖琼脂 | 自行配制 | Custom | |
| 裂隙灯生物显微镜 | 自备设备 | N/A | |
| SnPPIX（HO-1 抑制剂） | Frontier Scientific, Logan, UT, USA | F6140 | |
| Synergy HTX 多功能微孔板读板仪 | BioTek Instruments, Winooski, VT, USA | SYNHXTTR | |
| TBS-T（含 0.1% Tween-20） | 自行配制 | Custom | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 69980 | |
| TNF-α ELISA 试剂盒 | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | DY210 |
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