硫辛酸在真菌性角膜炎中激活Nrf2/HO-1细胞保护通路，降低炎症性细胞因子水平并减轻角膜损伤。这种宿主导向疗法相较于传统抗真菌药物具有更优的安全性特征，同时通过增强内源性抗氧化通路，为氧化应激驱动的眼部疾病的治疗提供了机制性见解。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
硫辛酸在真菌性角膜炎中激活Nrf2/HO-1细胞保护通路，降低炎症性细胞因子水平并减轻角膜损伤。这种宿主导向疗法相较于传统抗真菌药物具有更优的安全性特征，同时通过增强内源性抗氧化通路，为氧化应激驱动的眼部疾病的治疗提供了机制性见解。
硫辛酸（LA）是一种具有优异眼表安全性的二硫醇类抗氧化剂，本研究探讨了其在抑制驱动真菌性角膜炎的氧化-炎症微环境中的作用。人角膜上皮细胞在浓度高达60 µM的LA处理下仍保持良好的细胞活力，且未出现存活率下降，并在随后的实验中表现出对氧化应激和炎症反应的显著调节能力。 Aspergillus fumigatus 挑战条件下，LA诱导核因子红系2相关因子2（Nrf2）核转位增加三倍，并使其下游效应分子血红素加氧酶-1（HO-1）上升五倍。使用ML385对Nrf2进行药理学沉默，或使用锡原卟啉IX阻断HO-1的催化活性，均可消除这些分子事件，并恢复白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α的表达，证实了Nrf2/HO-1通路的严格依赖性。在小鼠角膜炎模型中的平行实验进一步验证了上述结果 体外 观察结果：局部应用LA使角膜混浊程度和炎症评分降低了47%，同时使角膜中Nrf2和HO-1的表达水平升高，并使细胞因子转录本减少一半；联合使用SnPPIX则消除了上述益处。综上所述，这些数据揭示了一个清晰的机制层级：在临床可达到的浓度下，LA可增加Nrf2蛋白水平并促进其核转位，增强HO-1活性，从而抑制病原体诱导的细胞因子紊乱。这些发现表明，LA是一种具有高度可转化性的宿主导向辅助治疗手段，能够与抗真菌化疗协同作用，并提示以Nrf2为核心的调控策略在治疗威胁视力的角膜炎症方面具有更广泛的治疗前景。
真菌性角膜炎（FK）现已被视为一种普遍的眼科急症，每年导致超过100万例经培养证实的病例，在热带和亚热带地区造成不成比例的角膜盲1,2。在美国，其发病率估计接近每10万人中有6-8例，在农业经济体中甚至更高，凸显出这一日益严重的全球性威胁，尤其在植物性外伤或佩戴隐形眼镜后，主要影响劳动年龄人群3,4。丝状真菌，尤其是Fusarium和Aspergillus属的物种，是主要的致病因素，它们在温暖潮湿的气候中繁殖，并利用眼部微小损伤引发感染5。
尽管已有半个世纪的临床应用，5%那他霉素仍是唯一专门获批用于真菌性角膜炎（FK）的局部用药；然而，其多烯类化学性质导致角膜穿透性差、需频繁给药，且并非在所有地区均可获得6,7。令人担忧的是，来自南亚的连续监测研究显示，那他霉素和三唑类药物的最低抑菌浓度呈逐步上升趋势，其中镰刀菌（Fusarium）分离株对那他霉素的耐药性每年增长≥6%，伏立康唑也呈现类似上升趋势
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
所有动物实验程序均经机构动物护理和使用委员会批准（方案编号：IACUC-2024-FK-007），并遵循视光学与视觉研究协会关于动物在眼科和视觉研究中使用的声明。选用8至10周龄、体重20至25克的雄性C57BL/6小鼠，在温度22 ± 2 °C、相对湿度50%–60%、12小时光照/12小时黑暗循环的受控环境条件下，饲养于独立通风笼具中。这些无特定病原体动物购自Charles River Laboratories（见材料表）。所有小鼠在实验操作前均经过1周的适应期，以适应新环境，并可自由摄取标准啮齿类动物饲料和饮水。
警告：Aspergillus fumigatus 是一种需要生物安全二级防护的病原体。所有真菌培养物必须在经过认证的生物安全柜中操作，并使用适当个人防护装备，包括手套、实验服和眼部防护装置。二甲基亚砜（DMSO）具有可燃性，且可穿透皮肤；应在通风良好的区域操作，避免直接接触。氯胺酮和赛拉嗪为管制药品，须根据机构规定进行安全储存并做好相关记录。
实验准备
根据实验流程准备所有所需试剂、药物和材料（参见材料表和补充图1中的示意图）。外消旋体（±）-α-硫辛酸（LA）储备液通过将外消旋α-硫辛酸（1,2-二硫环戊烷-3-戊酸）溶于DMSO中配制成6....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
实验流程表明，硫辛酸治疗可有效调节Nrf2/HO-1信号通路，从而抑制真菌性角膜炎模型中的炎症反应。
硫辛酸及通路特异性抑制剂的细胞毒性评估
初步的剂量-反应研究用于确定本研究中各化合物的最佳使用浓度。硫辛酸（LA）在人角膜内皮细胞（HCECs）中表现出良好的生物相容性，在24小时暴露后，浓度高达60 µM时仍能维持细胞活力，因此将60 µM确定为后续机制研究中的最佳LA浓度（图1A）。相比之下，Nrf2抑制剂ML385的安全性范围较窄，初步剂量-反应实验确定其最佳浓度为5 µM。HO-1抑制剂SnPPIX在所测试的化合物中表现出最窄的治疗窗，2.5 µM和5 µM的SnPPIX均显著降低细胞活力，与对照组相比差异明显，因此确定1 µM SnPPIX为机制研究的最佳浓度（图1C）。
LA 激活真菌感染的角膜上皮细胞中的 Nrf2/HO-1 信号通路
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本研究结果证实，硫辛酸（LA）是一种有效的 Nrf2/HO-1 信号轴激活剂，可通过抑制促炎性细胞因子的表达并维持角膜结构完整性，从而缓解真菌性角膜炎（FK）。与近期研究显示二硫杂环戊烷类化合物在氧化应激相关疾病中可强烈激活 Nrf2 的结果一致15，LA 使 HO-1 转录水平升高五倍，并使 IL-1β 和 TNF-α 的分泌减少一半，效果优于多种已报道用于眼部炎症的植物源性激活剂2,23。近期关于紫苏醛16、没食子酸17、羟基酪醇15 和依布硒啉19 的研究也表明其在 FK 模型中具有类似的 Nrf2/HO-1 激活作用，但 LA 凭借其明确的临床安全性、已有的眼科制剂形式以及更优的药学特性，在转化应用方面更具优势。严格的药理学层级关系表明，LA 可上调 Nrf2 蛋白水平，促进其.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者声明本研究不存在任何利益冲突。本研究的设计、实施和结果解读未受到任何外部资金支持或商业关系的影响。
本研究由济南市第二人民医院眼科内部资金资助。作者衷心感谢实验室工作人员在细胞培养维护和动物模型操作方面提供的技术支持。特别感谢机构动物护理和使用委员会对实验方案的审查和批准。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗 HO-1 | Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA | #8803 | |
| 抗-β-肌动蛋白 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A5441 | |
| 抗层粘连蛋白 B1 | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab16048 | |
| 抗 Nrf2 | Abcm, Cambridge, MA, USA | ab62352 | |
| Aspergillus fumigatus | ATCC 204305 | N/A | |
| Bradford 定量试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | 5000006 | |
| C57BL/6 小鼠 | Charles River Laboratories | N/A | |
| 细胞计数试剂盒-8（CCK-8） | Dojindo Laboratories, Kumamoto, 日本 | 343-07623 | |
| DMEM/F-12 培养基 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| ECL 显色试剂 | Thermo Fisher Scientific | 32106 | |
| 胎牛血清 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| GAPDH 正向引物 | 定制合成 | Custom | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 高容量 cDNA 反转录试剂盒 | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| HO-1 正向引物 | 定制合成 | Custom | |
| HO-1 反向引物 | 定制合成 | Custom | |
| HRP 标记抗小鼠 IgG | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab205718 | |
| HRP 标记抗兔 IgG | Abcam, Cambridge, MA, USA | ab205719 | |
| 人角膜上皮细胞（HCECs） | ATCC, Manassas, VA, USA | CRL-11135 | |
| IL-1β ELISA 试剂盒 | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | DY201 | |
| 硫辛酸（LA） | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1395 | |
| ML385（Nrf2 抑制剂） | MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA | HY-100523 | |
| NanoDrop 2000 分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| NE-PER 核与胞质提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| Nrf2 正向引物 | 定制合成 | Custom | |
| Nrf2 反向引物 | 定制合成 | Custom | |
| 含 0.05% Tween-80 的 PBS | 自行配制 | Custom | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| PowerUp SYBR Green 主混合液 | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific | A25741 | |
| QuantStudio 5 实时荧光定量 PCR 系统 | Thermo Fisher Scientific | A28140 | |
| RIPA 裂解缓冲液 | 自行配制 | Custom | |
| RNeasy Mini 试剂盒 | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| 沙氏葡萄糖琼脂 | 自行配制 | Custom | |
| 裂隙灯生物显微镜 | 自备设备 | N/A | |
| SnPPIX（HO-1 抑制剂） | Frontier Scientific, Logan, UT, USA | F6140 | |
| Synergy HTX 多功能微孔板读板仪 | BioTek Instruments, Winooski, VT, USA | SYNHXTTR | |
| TBS-T（含 0.1% Tween-20） | 自行配制 | Custom | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 69980 | |
| TNF-α ELISA 试剂盒 | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | DY210 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。