利用机械细胞拉伸生物反应器生成三维胶原嵌合A549/MRC-5肺泡类器官

摘要

本方案概述了在细胞外基质水凝胶支架上由A549肺泡上皮细胞和MRC-5肺成纤维细胞生成类器官，随后将其包埋于三维胶原凝胶中，并利用细胞拉伸生物反应器施加机械应变，以研究肺泡机械生物学。

摘要

尽管呼吸动力学和机械应变在肺泡生物学中起着关键作用，但它们对呼吸系统疾病发病机制的贡献常常被忽视。为弥补这一空白，我们开发了一种类器官模型，利用细胞拉伸生物反应器对肺泡上皮-成纤维细胞类器官施加可控的机械应变。该平台可模拟肺泡组织的空间结构和多细胞复杂性，从而研究细胞间通讯和机械转导如何影响健康与疾病状态下组织的结构与功能。在本实验方案中，我们描述了使用A549肺泡上皮细胞系和MRC-5肺成纤维细胞系在基底膜细胞外基质水凝胶中生成并培养上皮-成纤维细胞类器官的方法。随后，类器官通过非酶法分离，并嵌入生物反应器专用培养板中的三维胶原凝胶中。我们详细说明了施加等双轴应变的操作流程，以模拟呼吸加重期间出现的病理性呼吸模式。最后，我们提供了一套标准的表征工作流程，包括针对细胞特异性标志物的免疫染色以及用于分析免疫介质释放的免疫检测方法。上述分析手段共同支持对类器官结构与功能的评估。本方案提供了一个用户友好、可重复且可灵活调整的平台，用于在机械应力条件下研究肺泡生物学，其参数易于修改，可满足多样化的实验目标，推动对肺部疾病机制的研究进展。

引言

肺泡是呼吸系统的终末囊状结构，是气体交换的主要部位。肺泡主要由Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞组成，这些细胞负责气体交换、免疫功能以及结构完整性的维持；此外，肺泡壁内还含有成纤维细胞，负责维持细胞外基质的稳态¹。在呼吸过程中，这些及其他常驻细胞持续受到周期性牵张和剪切应力的作用²。此类机械刺激可被转化为生化信号，进而影响细胞的结构、分化和细胞间通讯³。

在慢性阻塞性肺疾病（COPD）等肺部疾病中可观察到病理性机械应变。COPD 是一种进行性疾病，其特征是肺实质破坏、慢性炎症以及小气道狭窄⁴。在此疾病中，肺泡壁的破坏、弹性蛋白的丧失、导致纤维化的细胞外基质（ECM）重塑以及慢性炎症共同损害了肺组织抵抗结构损伤的能力^5,6。这导致呼吸过程中肺泡发生异质性和异常变形，且在疾病急性加重期进一步加剧^7,8。

尽管已有多种体外（in vitro）方法被用于研究肺泡生物学，但每种方法均存在显著局限性。二维共培养系统有助于研究细胞间相互作用，但无法模拟组织结构或细胞外基质的动态变化，从而降低了其生理相关性。静态三维培养能较好地维持结构组织和基质相互作用，但未引入体内（in vivo）存在的动态力学刺激。微流控和器官芯片平台可模拟液体流动和机械应变，具有较高的生理保真度，但通常技术复杂、通量低且成本高昂⁹。相比之下，本文所介绍的三维机械拉伸类器官模型，在一个可重复、可扩展的平台上，结合了结构复杂性、细胞异质性以及可控的机械刺激——这一特性在现有模型中常被忽视，实现了生理相关性与实验可及性之间的良好平衡^10,11。

为了理解导致慢性阻塞性肺疾病（COPD）等疾病的复杂机制并发现治疗靶点，研究人员已建立了疾病模型。尽管机械应变具有重要意义，但在研究中常常被忽视 体外 用于研究慢性阻塞性肺疾病（COPD）等肺部疾病机制与发病过程的肺泡模型。为弥补现有模型的不足，本文介绍一种在基底膜基质中培养肺泡上皮-成纤维细胞类器官，并将其回收后嵌入三维胶原凝胶中，利用细胞拉伸生物反应器施加周期性机械应变，进而评估关键结构与功能指标的方法。此类三维机械性类器官模型能更真实地模拟人类肺泡微环境中的细胞间相互作用，从而实现对上皮-间质串扰的深入研究¹².

该生物反应器可施加具有可配置参数的等双轴应变，实现最高达30%的拉伸程度和最高5 Hz的频率，以模拟生理和病理条件。在本研究中，我们构建了嵌入于I型胶原水凝胶中的类器官模型，并施加18%应变、0.4 Hz频率持续24小时，以模拟病理状态下的呼吸过程。我们建立了一套标准化的表征工作流程，包括针对细胞特异性标志物的免疫染色以及定量检测机械应变后免疫介质释放的免疫分析方法。本研究的目标是提供一个生理相关性强、操作简便且可灵活调整的平台，用于研究肺泡生物学在机械应力作用下的变化。

方案

所有步骤均需采用无菌技术，使用无菌材料和试剂，并在生物安全柜中进行，以减少人员接触生物危害物质以及培养物被污染的风险。所用试剂和设备详见材料表。

1. 细胞 ​细胞株的培养与建立

1. 在类器官形成之前，使用添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），将A549和MRC-5细胞培养于标准组织培养处理的塑料培养瓶（T75 cm²）中，使其融合度达到约70%–80%，该培养基以下简称"完全DMEM"。
2. 对于A549和MRC-5细胞，均以2 × 10⁴ 个细胞/cm²的密度接种，总体积为10 mL完全DMEM。在37 °C、5% CO₂的湿润环境中培养，直至细胞融合度达到约70%–80%。
3. 每48小时更换一次培养基，以确保最佳生长条件。
4. 当细胞融合度达到70%–80%时，通过吸除培养瓶中的全部培养液进行传代，用预温的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次，然后加入4 mL胰蛋白酶-EDTA溶液。
5. 在37 °C孵育5分钟，并用明场显微镜观察培养瓶，确认细胞完全脱落。加入4 mL完全DMEM中和反应。
6. 采用合适的方法计数细胞，例如台盼蓝排斥法计数。
7. 将细胞悬液在200 × g条件下离心5分钟。
8. 吸除上清液，保留锥形管底部的细胞沉淀。通过轻柔吹打，用适量体积的完全DMEM重悬细胞沉淀。
9. 如需冻存，用含10% DMSO的完全培养基重悬，使细胞浓度为1 × 10⁶ 个细胞/mL；如用于类器官形成，则用完全DMEM重悬至1 × 10⁶ 个细胞/mL。

2. 建立并表征三维肺泡上皮-成纤维细胞类器官模型的成熟过程

注意：基底膜基质应在冰上过夜解冻，并在操作过程中始终保持在冰上。较高的温度可能导致基质凝固。

1. 配制体积比为2:3的基底膜基质与高级DMEM的混合液。将300 µL该溶液加入24孔板的每个孔中，确保每个孔底部均匀覆盖。将培养板置于37 °C、湿润的培养箱中孵育1小时，使基质凝固。
2. 在完全DMEM中配制5%的基底膜基质溶液，作为类器官的培养基。每孔用1,140 µL完全DMEM稀释60 µL基底膜基质，制备1.2 mL该溶液。
3. 在基底膜基质混合液凝固期间，将300,000个A549细胞与30,000个MRC-5细胞混合于200 µL上述步骤2.2中制备的5%基底膜基质溶液中。
4. 待2:3的基底膜基质混合物 凝固后，用移液器将200 µL A549/MRC-5混合液滴加至凝胶化的基质表面，然后将24孔板放回37 °C、5% CO₂培养箱中继续孵育21天，以促进肺泡类器官的生长与分化。
5. 在接下来的48小时内，使用光学显微镜观察培养物。在此期间，细胞应开始聚集形成类器官结构。
6. 每48小时更换一次5%基底膜基质/DMEM溶液，加入200 µL新鲜的5%培养基。为避免扰动嵌入水凝胶中的类器官，吸液前可轻轻倾斜培养板，使旧培养基沿孔壁聚集后再进行吸取。
7. 在成熟过程的第3、9和21天，使用10倍物镜对类器官进行成像，每孔采集四个具有代表性的图像或视野。第3、9和21天早期类器官形态的代表性图像见图1。
8. 对每个视野，计数直径大于50 µm的所有类器官。根据已知的视野面积，结合每视野平均计数，推算每孔类器官的平均总数（假设24孔板每孔表面积为1.9 cm²）。
   注：此类分析可使用图像分析软件（如Fiji¹³）完成。
9. 还可测量类器官的平均直径和面积，以获得关于类器官在培养中生长特性的定量信息。

3. 收获三维肺泡上皮-成纤维细胞类器官

注意：所有类器官收获步骤均需在冰上进行。

1. 经过21天的成熟培养后，吸除上清液，并用约1–2 mL冰冷的PBS轻轻洗涤。
2. 加入1–2 mL冷的类器官收获溶液，将培养板置于2–8 °C孵育30–90分钟，并进行适度振荡。
   注意： 当观察到类器官在孔底部漂浮时，停止孵育。
3. 使用明场显微镜监测解离过程。当孔底部的基底膜基质不再可见且类器官处于悬浮状态时，视为解离完成。可使用细胞刮棒轻轻刮除附着的类器官-基底膜基质凝胶，以加速该过程。
4. 将所有孔中的内容物收集至一个预冷的50 mL锥形管中。
5. 在2–8 °C下以500 × g 离心5分钟。吸除上清液，用1–2 mL冰冷的PBS洗涤类器官沉淀，再次离心以获得沉淀，然后吸除PBS。

4. 建立三维胶原包埋的肺泡-成纤维细胞类器官及施加机械应变

注意：使用带有与细胞拉伸生物反应器兼容的泡沫锚的圆形泡沫培养板。本方案中使用的培养板的生长面积约为 6.6 cm²。

1. 制备浓度为 2 mg/mL 的 I 型胶原工作液。该溶液应包含 1× PBS、11.4 mM NaOH 和 2 mg/mL I 型胶原，终体积用无菌水调节。每孔圆形泡沫 6 孔板需准备 2 mL 上述 I 型胶原溶液。
2. 向培养板边缘的泡沫锚点加入1 mL 2 mg/mL I型胶原蛋白溶液，确保完全浸润。
   注意：泡沫锚必须充分浸透I型胶原溶液，以确保适当的黏附。浸透不完全可能导致在施加机械应变时胶原凝胶脱落，从而导致有效应变低于预期目标。
3. 将类器官沉淀重悬于6 mL浓度为2 mg/mL的大鼠尾尾胶原中，用移液器吸取1 mL悬液加入6孔圆形泡沫板中央，确保含类器官的胶原混合物与先前添加至圆形泡沫锚点的无类器官胶原充分混合。
   注意：将类器官悬液加入各孔时，应避免产生气泡。
4. 在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 1 小时，使 I 型胶原聚合。₂)_. 凝胶聚合后应呈现浑浊状态。
5. 在3D胶原蛋白包埋的A549/MRC5类器官上加入2 mL完全DMEM，将培养板放回培养箱中孵育24 h。
6. 更换培养基为DMEM + 1% FBS，于机械应变处理前孵育过夜。

5. 细胞拉伸生物反应器的设置及机械应变的施加

1. 将加载站插入底板的每个孔中。这些加载站包含六个直径为25 mm的加载柱，可使Tissue Train培养板的柔性膜围绕其变形，从而使三维培养物受到等双轴应变。
2. 在加载柱顶部涂抹一层薄薄的硅脂。
3. 将红色垫圈安装到每个6孔板的底部。
4. 将准备好的培养板插入底板上，使其位于加载柱上方。
5. 将该装置移入37 °C、含5% CO₂的加湿培养箱中，并将快速接头连接到底板。重复步骤5.1 至5.6，但省略连接步骤，以建立无应变对照组。
   注：可选地，可使用管路密封塞，阻止真空压力作用于单个BioFlex孔的底部，从而在同一块板上生成无应变的对照培养。
6. 用Plexiglas板覆盖，并施加约5-10磅的重量，以确保密封紧密。
7. 打开空气压缩机，并开启空气压缩机的出气阀。
8. 启动真空压力泵，并打开与真空罐出气口相连的压力储罐阀门。确保真空压力约为90 kPa。
9. 打开位于生物反应器控制器附近的空气压缩机进气阀。调节压力，使排气口压力不超过15 PSI。
10. 启动设备内置软件，设置所需的周期性机械应变参数。本研究中采用的方案为18%应变幅度、0.4 Hz频率，持续24小时。配置时，新建一个方案，将最小伸长率设为0%，最大伸长率设为18%，然后启动程序。
11. 观察培养板和膜片，确保在整个应变过程中可见运动。膜片应围绕加载柱发生形变。
12. 定期检查水分收集阱中的湿气，并观察计算机屏幕上的运行时间、进度以及应变方案的形态是否正常。
13. 应变程序完成后，断开底板组件，并将施加了应变的培养物放回培养箱继续孵育 24小时，之后进行下游表征分析。
14. 按启动顺序的逆序关闭并拆卸系统：依次关闭或关闭空气压缩机进气阀、压力储罐阀门、真空压力泵、空气压缩机出气阀，最后关闭空气压缩机。
15. 在机械应变刺激后孵育24小时，收集上清液。储存于-80 °C，待用时取出。

6. 类器官的形态学表征 通过 免疫荧光

1. 用 PBS 轻轻加入 1 mL，室温孵育 5 分钟，将类器官-胶原凝胶模型洗涤三次。
2. 小心吸除 PBS，并重复洗涤过程，共三次。
3. 加入 2 mL 4% 多聚甲醛，在 4 °C 下孵育 1 小时，固定模型。
4. 按照上述方法，用 PBS 将模型洗涤三次。
5. 使用手术刀小心切割柔性孔中附着胶原凝胶的圆形泡沫锚，并将其转移至培养皿中。
6. 加入含 0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液共 2 mL，室温孵育 5 分钟，对类器官进行通透处理。
7. 用 PBS 将模型洗涤三次。
8. 加入含 5% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 溶液共 3 mL，室温孵育 1 小时，以阻断非特异性结合。移除封闭液后，进行下一步操作。
9. 加入染色混合液，在 4 °C 下过夜孵育。染色混合液包含：抗人闭锁小带蛋白-1（zonula occludens-1, ZO-1）与 Alexa Fluor 594 偶联抗体（1:100 稀释）、用于检测 F-肌动蛋白的与 Alexa Fluor 488 偶联的鬼笔环肽（1:1000 稀释），以及细胞核染料 DAPI（1:4000 稀释）。稀释液为 1 mL 含 1% BSA 的 PBS。在 4 °C 孵育前，用胶带封住培养板边缘。
10. 次日吸除染色混合液，并用 PBS 将模型洗涤三次。
11. 使用共聚焦显微镜成像，以 40 倍物镜对代表性类器官进行 5 µm 层厚的 Z 轴扫描成像。
12. 使用 Fiji 图像分析软件分析荧光强度。将平均荧光强度与类器官面积进行归一化处理，以确保在不同环境条件下结果的准确比较。

通过ELISA和乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测对类器官进行功能表征

1. 将上清液在冰上解冻，并使用市售的ELISA试剂盒，按照生产商的说明书检测白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-8（IL-8）的分泌水平。
2. 使用市售的LDH吸光度检测试剂盒，检测乳酸脱氢酶（LDH）的释放情况，作为细胞毒性的标志。
3. 使用重组LDH蛋白，以0.5 µg至0.5 ng的半对数浓度梯度绘制标准曲线，并根据该标准曲线插值计算各样品中的LDH浓度。

8. 可选步骤：用于 RNA 或蛋白质分析的样品分离

1. 进行免疫荧光染色时，不使用4%多聚甲醛，而应加入含有β-巯基乙醇的RLT缓冲液，每1 mL RLT缓冲液中加入10 µL β-巯基乙醇。
2. 每个模型使用300 µL，反复吹打混匀，以彻底脱离并裂解细胞。
3. 将裂解液转移至无RNase的微量离心管中，置于干冰上快速冷冻，随后转移至-80 °C长期保存。
   注意：也可使用RIPA缓冲液进行蛋白提取，其配制方法如下：50 mM Tris-HCl（pH 7.4–7.5）、150 mM NaCl、1% NP-40 或 Triton X-100、0.5% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS，溶于去离子水中。预配制的RIPA缓冲液也可商业购买。
4. 每个模型加入200 µL，冰上摇动5分钟，然后收集裂解液。
5. 在4 °C下以15,000 × g 离心10分钟，沉淀细胞碎片，上清液转移至-80 °C长期保存。

结果

利用细胞系建立了肺泡上皮-成纤维细胞类器官，并培养超过21天。在此期间观察了形态学变化，并在第3、9和21天评估了类器官数量、面积和直径，以监测其生长和发育情况。与第3天相比，每个孔中类器官的平均数量在第9天和第21天显著减少（图2A）。相反，类器官的平均面积和直径在第9天和第21天显著增加，表明类器官持续生长并扩张（图2B、C）¹⁰。

图3A、B 分别展示了静态（无应变）和应变条件下肺泡上皮-成纤维细胞类器官模型的代表性共聚焦图像，经免疫荧光染色显示F-actin（细胞骨架的主要成分）、ZO-1（定位于上皮细胞紧密连接处的支架蛋白）以及细胞核¹⁰。在应变条件下，肺成纤维细胞形成了F-actin阳性的胞质突起，破坏了类器官典型的球形形态。相应地...

讨论

三维（3D）肺泡上皮-成纤维细胞类器官是一种在机械应变条件下模拟肺部结构与功能的高度生理相关性平台。与二维或甚至三维共培养系统相比，类器官能够保留肺组织的关键特征 体内 肺微环境，包括空间结构、上皮-间质串扰以及细胞外基质（ECM）相互作用¹⁴机械应变在哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）和呼吸机相关性肺损伤等疾病的气道重塑过程中起着核心作用，其中反复的支气管收缩或周期性过度扩张使上皮细胞和间质细胞暴露于异常的张应力之下¹⁵在我们之前的研究中¹⁰对肺泡上皮-成纤维细胞类器官施加 18% 的等双轴应变（0.4 Hz，持续 24 小时），可诱导产生力学依赖性损伤特征，包括上皮紧密连接完整性丧失（ZO-1 表达减少）、细胞骨架重塑（F-actin 重排）、炎症细胞因子（IL-6、IL-8）上调，以及乳酸脱氢酶（LDH）释放增加，提示细胞死亡。这些由应变诱导的反应模拟了哮喘早期的致病过程，在该过程中，即使不存在外源性过敏原或免疫细胞，机械应力也足以引发上皮损伤、炎症介质释放及成纤维细胞活...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Eppendorf	0030 125.215
15 mL 一次性离心管	Fisher Scientific	14-959-53A
16% 多聚甲醛	赛默飞世尔科技	28908
2-巯基乙醇	Millipore Sigma	M3148
50 mL 一次性离心管	Fisher Scientific	14-432-22
6孔（柔性膜）Tissue Train 圆形泡沫板	Flexcell International	TTCF-5001
A549 细胞	美国典型培养物保藏中心（ATCC）	CCL-171
空气压缩机	California Air Tools	10020DSPCAD
牛血清白蛋白	Millipore Sigma	A9418
Buffer RLT	Qiagen	79216
一氧化碳2 培养箱	PHCBI	MCO-170AICUVL-PA
Cultrex 类器官收获溶液	Bio-Techne	3700-100-01
CyQUANT LDH 细胞毒性检测试剂盒	赛默飞世尔科技	C20300
DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)	赛默飞世尔科技	D1306
二甲基亚砜	Sigma Aldrich	D2650-100ML
杜尔贝科’s 改良伊格尔’DMEM培养基	赛默飞世尔科技	11965092
EVOS XL Core 显微镜	赛默飞世尔科技	AMEX1200
胎牛血清（FBS）	赛默飞世尔科技	A5209501
Fiji 图像分析软件	美国国立卫生研究院
Flexcell FX-6000 张力与组织训练系统（包含 Flexlink FX-6000 张力控制器、压力储液罐、底板、丙烯酸观察窗、直径 25 mm 的圆柱形加载站、水阱、FlexSoft FX-6000 V1.0 软件及各种管路）	Flexcell International	FX6000T
人白细胞介素-6 DuoSet ELISA	Bio-Techne	DY206
人白细胞介素-8 DuoSet ELISA	Bio-Techne	DY208
Leica DMi8 共聚焦显微镜	Leica Microsystems	11889122
Matrigel 基底膜基质	康宁	356237
MRC-5细胞	ATCC	CCL-185
Parafilm	Millipore Sigma	P7793
青霉素/链霉素（Pen/Strep）	赛默飞世尔科技	15140122
鬼笔环肽标记探针，Alexa Fluor 488	赛默飞世尔科技	A12379
磷酸盐缓冲液（PBS）	赛默飞世尔科技	14190-144
大鼠尾胶原 I	Sigma-Aldrich	C3867
重组人乳酸脱氢酶蛋白（有活性）	Abcam	Ab93699
RIPA 裂解缓冲液	赛默飞世尔科技	89901
无RNase的微量离心管	赛默飞世尔科技	AM12400
T75 cm²2 培养瓶	格雷纳	658175
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-5ML
ZO-1 单克隆抗体（ZO1-1A12），Alexa Fluor 594	赛默飞世尔科技	339194