本方案描述了一种利用哺乳动物细胞裂解液或纯化的泛素酶复合物对Streptococcus pneumoniae进行泛素化的方法，随后用纯化的VCP/p97-UFD1-NPLOC4蛋白复合物处理，以评估其溶菌活性，从而实现对泛素依赖性免疫效应因子的研究。
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摘要
摘要
泛素化是一种多功能的翻译后修饰，在细胞质免疫中发挥关键作用。当病原菌侵入宿主细胞后，最初被包裹在内体中，随后突破内体限制逃逸至细胞质，以避免溶酶体降解。一旦进入细胞质，细菌会迅速被宿主E3连接酶催化的泛素链标记，从而通过包括自噬和蛋白酶体在内的多种效应通路被清除。为了明确各通路在细菌清除中的具体贡献， 体外 重组提供了一种可控且明确的方法。此处，利用 肺炎链球菌 以细菌病原体SPN为模型，本文提供了一项详细方案，利用哺乳动物细胞裂解液或纯化的泛素酶复合物对其进行泛素化修饰，随后使用纯化的VCP/p97-UFD1-NPLOC4复合物处理，以评估其在不受其他细胞因子干扰情况下的溶菌活性。总体而言，该方法有望在无细胞体系中揭示免疫相关泛素连接酶及其效应分子的功能，而此类机制在完整细胞中往往难以解析。
引言
泛素（Ub）是一种小分子蛋白质，分子量为8.6 kDa，可通过其C末端的甘氨酸共价连接至靶蛋白，与赖氨酸残基的ε-氨基形成异肽键，该过程称为泛素化1。这一过程由一系列有序的步骤调控，涉及E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶1,2,3。泛素可通过其7个赖氨酸残基（线性/M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63）以单体形式或不同长度的链状结构连接至底物4。这些独特的泛素链可作为多种细胞功能的分子标记，如蛋白酶体降解、细胞内运输、DNA修复以及选择性自噬3。
尽管泛素化的经典功能长期以来被认为与维持细胞稳态有关，例如通过蛋白酶体降解错误折叠的蛋白质或将特定货物靶向选择性自噬5,6现在已明确，泛素在细胞质免疫系统对抗细菌感染中也发挥着关键的感知机制作用。细胞内细菌常侵入宿主细胞，以逃避细胞外免疫反应的识别，并在受保护的环境中进行繁殖。7,8许多病原体利用分泌系统和毒素对容纳它们的液泡造成不可逆损伤，从而逃逸至胞质溶胶中以获取营养物质9,10进入细胞质后，这些细菌会被特定的E3连接酶修饰上多聚泛素链，作为一种分子标记 "死亡标签"，从而引导它们走向选择性清除。例如，E3 连接酶 SMURF1 参与 结核分枝杆菌 通过在其表面直接引发K48连接的多聚泛素化，从而导致其经由蛋白酶体降解11Parkin 在含有细菌的空泡中聚集，并形成 K63 连接的泛素链12而ARIH1和LRSAM1分别在细菌表面添加K48和K6链，从而抑制细菌生长13,14尽管大多数E3连接酶主要靶向宿主蛋白底物，但某些连接酶对微生物组分表现出显著特异性。RNF213可识别并泛素化存在于脂多糖（LPS）上的 肠炎沙门氏菌 血清型鼠伤寒沙门氏菌15，以及SCFFBXO2 复合物识别存在于细菌中的糖类 A群链球菌 作为泛素化反应的底物16，促进异源自噬。SCFFBXW7 复合物则识别表面蛋白中的降解子基序 肺炎链球菌 (SPN)。这些蛋白包括β-半乳糖苷酶A（BgaA）和肺炎链球菌表面蛋白A（PspA），在被K48连接的多聚泛素链标记后，可通过K48连接的泛素特异性抗体确认，推测可招募蛋白酶体系统，从而实现有效的细菌清除17.
尽管细胞质内病原体被泛素标记的过程已较为明确，但蛋白酶体系统随后如何清除这些大型微生物实体的机制仍不甚清楚。近期研究表明，宿主的AAA+ ATP酶VCP/p97（含缬酪肽蛋白）在该过程中发挥关键作用。VCP在UFD1和NPLOC4等辅助因子的协同下，能够识别被多聚泛素标记的细菌，并从细菌膜上物理性提取泛素化蛋白，从而破坏细菌结构，促进其从细胞质环境中被清除，且此过程不依赖于蛋白酶体机制18。
宿主细胞质中含有一个复杂的免疫通路网络，这些通路并行发挥作用，并以冗余保障的方式确保病原体被清除。这种冗余机制对于建立强有力的防御至关重要，但也使得鉴定和研究单个免疫因子的功能变得复杂。19在这方面， 体外 重建系统为在受控条件下分析特定通路提供了有用的平台。本文介绍了一种无细胞系统，该系统利用哺乳动物细胞裂解物或E1-E2-E3-Ub酶联合纯化的宿主效应复合物，重现SPN的泛素化过程及其活力丧失。本两步法实验流程中，我们首先促进多聚泛素链在细菌上的共价连接，随后评估VCP/p97在UFD1和NPLOC4协同作用下对泛素化细菌的清除能力。通过重建该通路 体外我们绕过细胞的复杂性，专门研究VCP中和病原体的能力。这一精确的实验设计有助于深入探究底物识别、链特异性、效应分子的作用模式，以及启动有效免疫反应所必需的关键组分。
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方案
1. 细胞培养与裂解液制备
- 解冻 A549 细胞，使用含 10% 胎牛血清（FBS）的完全 DMEM 培养基于 T25 培养瓶中进行培养。置于 37 °C、5% CO₂ 的湿润环境中孵育2. 传代培养细胞三次以进行维持，然后转移 2 × 106 将细胞接种至T75培养瓶中，继续培养至细胞密度达到8-10 × 10⁶个细胞。6 细胞
- 使用含有 200 mM HEPES、100 mM MgCl 的反应缓冲液，在 4 °C 下从 T75 培养瓶中刮取细胞2，1 M KCl，以及5%甘油，pH 7.4。将刮取的细胞在120 × g 离心10分钟以沉淀细胞，然后在1.5 mL离心管中用反应缓冲液重悬，使终体积约为0.6 mL。
注意：整个样品必须在冰上处理。 - 使用窄探头（探头直径2 mm），在冰上以40 μm振幅、2 s开/2 s关的脉冲模式对细胞悬液进行超声处理，持续2–2.5 min。将超声处理后的样品在21,000 × g 孵育45分钟，收集上清液，并加入2-3倍体积的50倍蛋白酶抑制剂混合液。
注意：裂解物应于制备当天立即用于泛素化反应，或使用液氮速冻后于 -80 °C 保存；但须确保在最多3天内使用，以保证有效的泛素化。适用于泛素化反应的裂解物浓度范围为 2 至 4 mg/mL。
2. 细菌培养
- 在含有5% CO2的THY培养基中，于37 °C过夜培养细菌肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，SPN）R6菌株（血清型II），THY培养基由Todd Hewitt肉汤粉末（3.7 g/100 mL）和酵母提取物粉末（1.5 g/100 mL）配制而成。
注意：若培养基颜色变为深棕色，则避免接种细菌。Streptococcus pneumoniae 属于生物安全二级（BSL-2）病原体；操作时应采取预防措施，并遵循正确的BSL-2防护规程，包括使用经认证的生物安全柜。 - 次日，将过夜培养物按1:10比例接种至新鲜THY培养基中，在37 °C、5% CO2条件下培养SPN，直至600 nm处的光密度（OD600 nm）达到0.4。制备SPN甘油冻存液（900 µL SPN培养物与600 µL 50%甘油混合），并于-80 °C保存。
- 进行泛素化实验当天，从-80 °C取出新的SPN冻存菌种，将其完全接种至5 mL THY培养基中，继续培养至OD600 nm达到0.4。
注意：细菌培养物生长至OD600 nm为0.4时，相当于每毫升约含有108个SPN细胞。该换算关系通过菌落形成单位（CFUs）计数确定，具体方法为：将培养物用1×PBS进行系列稀释，降低细菌浓度以获得可计数的菌落，随后点样于BHI琼脂平板上培养；BHI培养基比THY培养基营养更丰富。
3. 体外 哺乳动物裂解液中的泛素化检测
- 取大约 107 SPN 细胞用反应缓冲液（200 mM HEPES，100 mM MgCl₂）充分洗涤，至少洗涤三次2，1 M KCl 和 5% 甘油（pH 7.4）中，通过将细菌重悬于以下缓冲液，随后在 21,000 × g 5 分钟，最后在 21,000 × g 室温下孵育5分钟。
- 将SPN沉淀物与A549哺乳动物细胞裂解液、纯化的泛素（350 µM）和1 mM ATP重悬，于27 °C孵育1-2小时。
注意：避免反复冻融哺乳动物细胞裂解液。建议在进行泛素化检测的当天制备细胞裂解液。 - 孵育后，用含1 M尿素的反应缓冲液洗涤细菌一次，再用不含尿素的反应缓冲液洗涤两次，随后用1%多聚甲醛（PFA）固定。固定后，将细胞在含甘氨酸（1 mg/mL）的PBS中孵育15分钟，然后用1×PBS洗涤两次。
注意：使用1 M尿素洗涤可轻微破坏非共价相互作用，确保仅有共价连接泛素化的细菌保留下来。此后，必须用反应缓冲液充分洗涤以去除残留尿素，因为尿素的存在可能干扰后续反应 体外 杀伤实验
作为阴性对照，配制完整的反应混合物，并将其与细菌在冰上孵育以抑制酶活性。孵育结束后立即冲洗样品，然后使用1% PFA固定以维持反应状态。
4. 体外 E1-E2-E3酶复合物的泛素化检测
- 首先配制反应混合物，其中包含泛素（350 µM）、UBE1（400–800 nM）、UbE2C（3–5 µM）、Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 复合物（500 nM）以及 2 mM ATP，溶于反应缓冲液（200 mM HEPES、100 mM MgCl2、1 M KCl 和 5% 甘油，pH 7.4），总体积为 100–150 µL。
注意：所有酶类应保存在 -80 °C。为避免反复冻融导致活性损失，建议分装成小份，每次泛素化反应使用新的分装样品。 - 将细菌（107 CFU）重悬于上述含泛素酶的反应混合物中，在 27 °C 下孵育 2 小时。随后用含有 1 M 尿素的反应缓冲液至少洗涤 3 次，接着用 1% 多聚甲醛（PFA）固定。固定后，将细胞与含甘氨酸（1 mg/mL）的 PBS 孵育 15 分钟，再进行两次 PBS 洗涤。
注意：若细胞损失过多，可减少洗涤次数。
5. 泛素化细菌的可视化
- 用1% PFA固定样品后，在27 °C下用3% BSA孵育1小时，然后用1× PBS洗涤两次。
- 使用高于免疫荧光检测常规浓度的一抗重悬泛素化细菌。在含有1% BSA的PBS中稀释细菌特异性抗体和抗泛素抗体（1:100），于27 °C下染色1小时。
注意：为获得最佳抗体染色效果，建议使用低蛋白吸附离心管以减少抗体损失，或使用更高浓度的抗体以获得最佳结果。 - 随后用1× PBS洗涤细菌两次，再分别加入偶联Alexa Fluor 488和555的相应二抗，在27 °C下重悬并孵育1小时。
- 取约10–20 µL标记后的细菌样品进行滴加，加入5–10 µL含或不含DAPI的封片剂，盖上盖玻片，并用滤纸吸去多余液体。最后于当天在共聚焦显微镜下观察样品。
6. 蛋白质表达与纯化
- 为了表达野生型 VCP/p97，通过标准的 E. coli 转化方案20，将含有 VCP 的 pET28a 质粒转化至 E. coli BL21-DE3 菌株中。转化后形成的菌落于 37 °C 的 Luria 肉汤（LB）中过夜培养。次日，按 1:50 的比例接种培养物至装有 LB 的通气良好的烧瓶中，使其生长至 OD600 nm 达到 0.7–0.8。向培养物中加入 200 µM IPTG，在 37 °C、180 rpm 振荡条件下继续培养 5 小时；通过 SDS-PAGE 确认蛋白表达。
注意：在整个细菌生长与表达步骤中，使用卡那霉素（50 µg/mL）作为筛选压力。 - 为了表达野生型 UFD1，通过标准的 E. coli 转化方案20，将含有 UFD1 的 pET41b 质粒转化至 E. coli BL21-Rosetta 菌株中。转化后形成的菌落于 37 °C 的 Luria 肉汤（LB）中过夜培养。次日，按 1:50 的比例接种培养物至装有 LB 的通气良好的烧瓶中，使其生长至 OD600 nm 达到 0.7–0.8。向培养物中加入 1 mM IPTG，在 37 °C、180 rpm 振荡条件下继续培养 5 小时；通过 SDS-PAGE 确认蛋白表达。
- 为了表达野生型 NPLOC4，使用标准的 E. coli 转化方法20，将含有 NPLOC4 的 pET41b 质粒导入 E. coli BL21-Rosetta 菌株中。转化后产生的菌落在 Luria 肉汤（LB）中于 37 °C 过夜培养。次日，将培养物按 1:50 稀释后转移至装有 LB 的通气良好的烧瓶中，使其生长至 600 nm 处的光密度（OD600 nm）达到 0.7–0.8。随后，向培养物中加入 1 mM IPTG，在 18 °C、180 rpm 振荡条件下继续培养 16 小时；通过 SDS-PAGE 分析验证蛋白表达。
注意：在 E. coli BL21-Rosetta 菌株中进行的整个细菌生长与表达步骤中，使用卡那霉素（50 µg/mL）和氯霉素（20 µg/mL）作为筛选压力。补充文件 1 提供了 pET28a-p97 和 pET41b-NPLOC4 的序列。 - 蛋白表达完成后，于 21,000 × g 离心 10 分钟收集菌体，将沉淀重悬于裂解缓冲液中，裂解缓冲液组成为：50 mM Tris-Cl、300 mM NaCl、5 mM β-巯基乙醇、1 mM PMSF、5% 甘油，pH 8.0。
- 使用窄探头（探头直径 6 mm）在 4 °C 条件下以 50 μm 振幅、20 秒开/20 秒关的脉冲模式超声处理细胞 1 小时。以 15,000 × g 离心 1 小时沉淀细胞碎片，收集上清液。
注意：总超声时间 1 小时（开启 30 分钟，关闭 30 分钟，以 20 秒脉冲进行），持续处理直至浑浊的细胞悬液变为透明。高速离心是必要的，以确保细胞碎片完全沉淀，避免在将裂解液上样至蛋白纯化柱时发生再悬浮。 - 将上清液通过 0.4 µm 滤膜过滤后，上样至预先用纯化缓冲液（50 mM Tris-Cl、300 mM NaCl、5 mM β-巯基乙醇、5% 甘油，pH 8.0）平衡好的 Ni-NTA 亲和层析柱中进行纯化。
- 使用洗涤缓冲液（含 50 mM Tris-Cl、300 mM NaCl、5 mM β-巯基乙醇、5% 甘油，pH 8.0 和 30–60 mM 咪唑）约 400 mL 冲洗富含蛋白的层析柱，随后用洗脱缓冲液（含 50 mM Tris-Cl、300 mM NaCl、5 mM β-巯基乙醇、5% 甘油，pH 8.0 和 250 mM 咪唑）洗脱蛋白。
注意：咪唑浓度和洗涤体积可能因具体分析的蛋白而异。应通过 SDS-PAGE 评估纯度。必须充分洗涤层析柱，直至流出液对 Bradford 试剂呈阴性反应。洗脱组分中应出现明显且集中的目标蛋白条带，该条带应为主要成分，其他蛋白仅存微量或无。 - 收集不同组分，通过 SDS-PAGE 分析以确定哪些组分含有纯化的蛋白，随后使用 PD-10 柱将蛋白置换至反应缓冲液（200 mM HEPES、100 mM MgCl2、1 M KCl 和 5% 甘油，pH 7.4）中。
注意：使用 Bradford 试剂（考马斯亮蓝 G-250）测定蛋白浓度。所有蛋白应使用液氮速冻后于 -80 °C 保存。
7. 体外 细菌杀伤实验
- 将6 µM的VCP/p97与各1 µM的NPLOC4和UFD1混合，然后用反应缓冲液补至总体积约90 µL。将该反应混合物置于冰上孵育2 h。
- 向含有p97-UFD1-NPLOC4的反应混合物中加入1–2 mM ATP，再与泛素化的SPN（107个细胞）在37 °C下共同孵育2 h。
- 为评估细菌活力，在处理后立即取1 µL反应混合物，进行系列稀释（1:1、1:10、1:100和1:1000），并将每种稀释液各取10–2 µL点样于脑心浸液（BHI）琼脂平板上。在反应混合物于 2 h孵育后，同样取1 µL进行该操作。
注意：为获得更佳结果，请点样所有稀释梯度。 - 检测 0 h与2 h时间点之间的菌落形成单位（CFU）。通过将2 h的CFU数除以0 h的CFU数，再乘以100，计算细菌活力（%）。
注意：为获得更可靠的结果，可使用热变性的VCP/p97、缺失UFD1-NPLOC4辅因子复合物的VCP/p97，或ATP酶缺陷型VCP/p97作为阴性对照进行比较。
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结果
本方案详细描述了利用哺乳动物A549细胞制备富含泛素化过程起始所需组分的细胞裂解液的方法。图1A）。该裂解液无论处于浓缩状态，还是替换为纯化的组分（如UBE1（E1泛素激活酶）、UbE2C（E2泛素结合酶）以及Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7复合物（E3泛素连接酶）），均与纯化的泛素和ATP混合，以促进 体外 细菌的泛素化图1B）。为了评估泛素化后的溶菌反应，反应体系中需加入纯化的VCP/p97及其辅助因子UFD1和NPLOC4（图1C).
通过免疫荧光技术，我们检测到肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，SPN）在暴露于哺乳动物细胞裂解液或含有纯化E1-E2-E3泛素酶的重建体系时，发生了显著的泛素化。当体...
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讨论
尽管 体外 此处详述的重建系统为研究细菌泛素化及清除的分子机制提供了可靠的框架，但需考虑若干重要局限性。该系统依赖于超生理浓度的纯化蛋白，包括泛素化机制相关组分（E1、E2、E3连接酶、泛素）和宿主效应复合物（VCP/p97、UFD1、NPLOC4），虽可提供病原体泛素化与清除的关键机制见解，但可能无法真实反映活细胞内的生理条件。
细胞自主免疫系统包含多种效应蛋白和泛素连接酶，它们并行发挥作用，作为一种备用机制以清除感染。类似地，VCP/p97 可能并非独立发挥作用，而是可能依赖于其他因子或额外的降解通路。我们的 体外 重组分别在细菌的泛素化和降解过程中捕获了Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7和VCP/p97的有效功能，但这些体系为孤立系统，可能高估了这些效应分子的能力，或无法准确反映宿主细胞中的真实生理动力学。
翻译后层修饰（PTMs）引入了进一步的复杂性，已知这些修饰会影响多种效应蛋白的稳定性、定位和活性。在现有系统中，蛋白质通常从大肠杆菌（E. coli）等细菌...
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
我们感谢印度理工学院孟买分校的生物安全二级设施和共聚焦显微镜设施。Sourav Ghosh（17/06/2018(i) EU-V）、Sumit Rakshit（221610197857）和Udit Kumar Das（24D0061）分别获得了印度科学与工业研究委员会（CSIR）、印度大学拨款委员会（UGC）、印度政府以及印度理工学院孟买分校的奖学金资助。Anirban Banerjee 获得了印度政府科学与工程研究委员会（Grant Number SPR/2019/000808）和 Ignite Life Science 基金会（Grant Number IGNITE/FG-OC/2021/004）的研究经费支持。资助机构未参与本研究的设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50倍蛋白酶抑制剂混合液 | Promega | G6521 | |
| 6x-His-Ubiquitin | UBPBio | E1100 | |
| A549细胞系 | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | |
| Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-31572 | |
| 抗泛素抗体 | Enzo | BML-PW8810-0100 | |
| 抗泛素K48特异性抗体，克隆Apu2 | Sigma Aldrich | ZRB2150 | |
| ATP | Sigma Aldrich | A6419 | |
| BHI | HiMedia | M210 | |
| DMEM（高糖） | HiMedia | AL251 | |
| FBS | Gibco (美国来源) | 38220090 | |
| 甘油 | PureSynth | PSR37325 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-100G | |
| KCl | Sigma Aldrich | P3911 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | TC006 | |
| 多聚甲醛 | Sigma Aldrich | E6148 | |
| pET28a-p97质粒 | 本实验室 | 质粒可应要求提供 | |
| pET41b-NPLOC4质粒 | 本实验室 | 质粒可应要求提供 | |
| pET41b-UFD1质粒 | Addgene | 质粒编号 #117107 | |
| Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 | Sigma Aldrich | 23-030 | |
| 肺炎链球菌R6菌株 | ATCC | ATCC BAA-255 | 生物安全等级2类病原体，需在BSL-2实验室中操作 |
| Todd Hewitt肉汤粉末 | HiMedia | M313 | |
| UBE1 | UBPBio | B1100 | |
| UbE2C | UBPBio | C1300 | |
| 尿素 | HiMedia | MB032 | |
| 酵母提取物粉末 | HiMedia | RM027 |
参考文献
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