体外受精 细菌泛素化的重建及VCP/p97介导的消除

摘要

本方案描述了一种利用哺乳动物细胞裂解液或纯泛素酶复合物泛素化肺炎 链 球菌的方法，随后用纯化的VCP/p97-UFD1-NPLOC4蛋白复合物处理，以评估其抗菌分解活性，从而研究泛素依赖性的免疫效应。

摘要

泛素化是一种多功能的翻译后修饰，在细胞质免疫中起着关键作用。病原细菌入侵宿主细胞时，最初被内体包裹，随后脱离体内逃逸，以避免溶酶体降解。细菌进入细胞质后，宿主E3连接酶迅速标记泛素链，通过多条效应途径（包括自噬和蛋白酶体）标记清除。为了明确单个通路在细菌清除中的贡献， 体外 重建提供了一种受控且明确的方法。本文以肺炎 链球 菌（SPN）为模型细菌病原体，提出了使用哺乳动物细胞裂解液或纯泛素酶复合物进行泛素化的详细方案，随后用纯化的VCP/p97-UFD1-NPLOC4复合物处理，以评估其抗菌活性，独立于其他细胞因素。总体而言，该手术有望揭示免疫联锁泛素连接酶和效应子在无细胞环境中的功能，因为在完整细胞中解剖此类机制可能具有挑战性。

引言

泛素（Ub）是一种体积为8.6 kDa的小型蛋白质，通过在目标底物的C端甘氨酸处共价结合，形成与赖氨酸残基ε-氨基的同肽键，这一过程称为泛素化¹。该现象由一系列有序的步骤控制，涉及E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶^1,2,3。Ub可以作为单体结合，也可以通过其七个赖氨酸残基（线性/M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63^）连接。这些独特的Ub链作为多种细胞功能的分子标记，如蛋白酶体降解、细胞运输、DNA修复和选择性自噬^3。

虽然泛素化的官方作用长期以来与维持细胞稳态相关，例如通过蛋白酶体降解错误折叠的蛋白质，或将特定货物引导至选择性自噬^5,6，但现在已明确，泛素同时也是细胞质免疫系统对抗细菌感染的重要感知机制。细胞内细菌经常侵入宿主细胞，以避免被细胞外免疫反应检测，并在受^{保护的环境中}繁殖^7,8。许多病原体利用分泌系统和毒素不可逆地破坏携带它们的液泡，使其能够逃逸到细胞质中获取营养^9,10。一旦进入细胞质，这些细菌会被特定的E3连接酶装饰成多泛素链，作为分子“死亡标签”，引导它们选择性消除。例如，E3连接酶SMURF1通过直接在结核分枝杆菌表面启动K48连接多泛素化，从而通过蛋白酶^体11进行降解。Parkin在含有细菌的液泡中积累，形成K63连接的泛素链¹²，而ARIH1和LRSAM1分别通过K48和K6链修饰细菌表面，从而抑制细菌生长^13,14。虽然大多数E3连接酶主要靶向宿主蛋白底物，但部分连接酶对微生物组分表现出显著的特异性。RNF213识别并泛素化沙门氏菌（Serovar serovar Typhimurium¹⁵）上的脂多糖（LPS），SCF^FBXO2复合物识别A组链球菌中的细菌糖链作为泛素化¹⁶的底物，促进异食。而SCF^FBXW7复合物则识别肺炎链球菌（SPN）表面蛋白中的degron基序。这些包括β半乳糖苷酶A（BgaA）和肺炎球菌表面蛋白A（PspA），经K48连接多泛素链标记后，通过K48连接的Ub特异性抗体确认，推测它们能吸引蛋白酶体系统，从而实现细菌的有效清除^（17）。

尽管用泛素标记这些细胞质入侵者的过程已被充分理解，但蛋白酶体系统如何去除如此大型微生物实体的后续机制仍存疑。最新研究表明，宿主AAA+ ATP酶VCP/p97（含缬草蛋白）在这一过程中起着关键作用。结合UFD1和NPLOC4等辅因子，VCP可以识别带有多泛素的细菌，并物理地从细菌膜中提取泛素化的蛋白质，从而破坏它们，帮助其从细胞质环境中被清除，而无需依赖蛋白酶体机制¹⁸。

宿主细胞质包含复杂的免疫通路网络，这些通路并行且具备安全性，确保病原体被清除。这种冗余对于强有力的防御至关重要，但也使识别和审查个体^{免疫因子的作用}变得更加复杂。在这方面， 体外 重建系统为在受控条件下分析特定通路提供了有用平台。本文介绍了一个无细胞系统，利用哺乳动物细胞裂解液或E1-E2-E3-Ub酶以及纯化宿主效应复合物，重现SPN泛素化及存活率丧失的过程。在该两步方案中，我们首先促进细菌上多泛素链的结合，随后通过VCP/p97与UFD1和NPLOC4结合评估其消除效果。通过体 外重构该通路，我们绕过了细胞复杂性，专门研究VCP中和病原体的能力。这种精确的设置使得对底物识别、链特异性、效应器作用机态及启动有效反应所需的关键组成部分进行了详细探讨。

方案

1. 细胞培养与裂解液制备

1. 解冻A549细胞，并用完整的DMEM和10%胎牛血清（FBS）在T25瓶中培养。在37°C湿度下、含5%二氧化碳的环境中孵_育。将细胞经过三次通道进行维持，然后将2×10个⁶个细胞转移到T75瓶中。继续培养，直到细胞密度达到8-10 × 10⁶个细胞。
2. 在4°C下，使用含有200 mM HEPES、100 mM MgCl₂、1 M KCl和5%甘油、pH值7.4的反应缓冲液，从T75瓶中刮取细胞。在120× 克 下离心10分钟沉淀后，再悬浮在反应缓冲液中，最终在1.5毫升离心管中得到约0.6毫升的最终体积。
   注意：整个样品必须在冰中处理。
3. 用窄探头（直径2毫米）以40微米振幅进行2秒的开/关脉冲，进行2-2.5分钟的超声波处理细胞悬浮液，保持混合物冰封。将超声波样本以21,000 × 克 离心45分钟，收集所得上清液，加入2-3份50倍蛋白酶抑制剂鸡尾酒。
   注意：当天立即使用裂解液进行泛素化反应，或用液氮速冻保存至-80°C;不过，确保最多3天内使用，才能实现有效的泛素化效果。裂解液浓度范围为2至4 mg/mL，适合泛素化。

2. 细菌培养

1. 在37°C、含5%_CO2的条件下，在由Todd Hewitt高汤粉（3.7克/100毫升）和酵母提取物粉（1.5克/100毫升）组成的THY培养基中，培养细菌——肺炎链球菌（SPN）R6株（血清型II）。
   注意：如果培养基颜色变为深棕色，应避免接种细菌。 肺炎链 球菌被归类为生物安全等级2（BSL-2）病原体;采取预防措施，遵循正确的BSL-2封闭规范，包括使用认证的生物安全柜。
2. 次日，将过夜培养液接种到新鲜THY培养基（1：10），37°C，含5%_CO2 ，培养SPN至600纳米（外径_600纳米）的光学密度达到0.4。准备一份SPN甘油高汤（900微升SPN培养液和600微升甘油（50%），储存在-80°C下。
3. 在泛素化实验当天，将新SPN从-80°C解冻，完全接种到5毫升THY培养基中，让其生长直到OD_{600 nm} 达到0.4。
   注：细菌培养至OD_{600 nm} 为0.4，约相当于每毫升10个⁸ SPN细胞。该相关性通过枚举菌落形成单元（CFU）确定，通过连续稀释培养物以1xPBS降低细菌细胞浓度以获得可计数菌落，以及在比THY更富集的BHI琼脂培养基上点滴测得。

3. 体 外 泛素化分析，来自哺乳动物裂解液

1. 取约10个⁷ 个SPN细胞，并用反应缓冲液（200 mM HEPES、100 mM MgCl₂、1 M KCl和5% glycerol，pH 7.4）彻底清洗三次，将细菌重新悬浮在后续缓冲液中，随后以21,000 × g 离心5分钟，最后在室温下以21,000 × g离心沉淀5分钟。
2. 将SPN沉淀与A549哺乳动物细胞裂解液、纯化泛素（350微米）和1 mM ATP一起重新悬浮，并在27°C下培养1-2小时。
   注意：避免冷冻和解冻哺乳动物细胞裂解液。最好在泛素化检测当天制备裂解液。
3. 培养后，先用含有1M尿素的反应缓冲液洗涤细菌一次，然后仅用反应缓冲液洗涤两次，最后用1%对甲醛（PFA）固定。固定后，用含甘氨酸的PBS（1 mg/mL）培养细胞15分钟，随后进行两次1次PBS洗涤。
   注：使用1米尿素洗涤剂以轻度破坏非共价相互作用，确保仅剩共价泛素细菌。之后，务必用反应缓冲液彻底清洗以去除残留尿素，因为其存在可能干扰 体外 杀菌测定。
   作为阴性对照，准备整个反应混合物，并与细菌一起冰上培养以抑制酶活性。培养后立即冲洗样品，然后用1%的PFA固定以保持反应状态。

4. 体 外 泛素化测定法，来自E1-E2-E3酶复合体

1. 先制备反应混合物，包括泛素（350微米）、UBE1（400-800 nM）、UbE2C（3-5 μM）、Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7复合物（500 nM）和2 mM ATP（200 mM HEPES、100 mM MgCl₂、1 M KCl和5% glycerol，pH 7.4），使总反应体积为100-150 μL。
   注意：所有酶应在-80°C下储存。 为避免多次冻融循环导致活性丧失，应为每个泛素化反应创建小分量并使用新的分量。
2. 将细菌（10⁷ CFU）重新沉浸于含泛素酶的反应混合物中，并在27°C下培养2小时。 随后，用含有1M尿素的反应缓冲液清洗细菌至少3次，然后用1%对甲醛（PFA）固定。固定后，用含甘氨酸的PBS（1 mg/mL）培养细胞15分钟，随后进行两次1次PBS洗涤。
   注意：如果细胞流失过多，可以减少洗涤次数。

5. 泛素化细菌的可视化

1. 用1% PFA固定样品后，在3% BSA中以27°C孵育1小时，然后用1xPBS洗涤两下。
2. 使用一级抗体将泛素细菌以高于免疫荧光测定常用浓度的浓度重新休浮。使用细菌特异性抗体和抗泛素抗体（1：100），稀释于含有1% BSA的PBS中，在27°C下染色1小时。
   注意：为了达到最佳的抗体染色效果，建议使用低蛋白结合离心管以最大限度减少抗体损失，或使用更高浓度的抗体以获得最佳效果。
3. 随后，用1倍PBS洗涤细菌两次，然后用分别与Alexa Fluor 488和555结合的二级抗体重新休眠，在27°C下停留1小时。
4. 用滴铸方式涂抹约10-20微升标记细菌样本，混合5-10微升装裱介质（含无DAPI），然后盖上盖纸，用纸巾吸收多余液体。最后，当天用共聚焦显微镜观察样本。

6. 蛋白质表达与纯化

1. 对于表达野生型VCP/p97，采用标准大肠杆菌转化协议^，将含VCP的pET28a质粒转化为大肠杆菌BL21-DE3菌株。孵化后，在37°C的Luria汤（LB）中夜间形成孵化群落。 次日，将1：50的培养液接种到含有LB的良好通气瓶中，并让其生长直到OD_{600 nm}达到0.7-0.8。向培养液中加入200微米IPTG，并在37°C下以180转/分钟摇晃培养5小时;使用SDS-PAGE确认蛋白质表达。
   注：在整个细菌生长和表达步骤中，使用了卡霉素（50 μg/mL）作为选择压力。
2. 对于表达野生型UFD1，将含UFD1的pET41b质粒转化为大 肠杆 菌BL21-Rosetta菌株，采用标准大 肠杆菌 转化协议²⁰。孵化后，在37°C的Luria汤（LB）中夜间形成孵化群落。 次日，将1：50的培养液接种到含有LB的良好通气瓶中，并让其生长直到OD_{600 nm} 达到0.7-0.8。加入1毫毫米IPTG培养液，在37°C下培养5小时，摇晃180转/分钟;使用SDS-PAGE确认蛋白质表达。
3. 要表达野生型NPLOC4，使用标准大肠杆菌转化法²⁰，将含NPLOC4的pET41b质粒引入大肠杆菌BL21-Rosetta菌株。在37°C的夜间孵育由该菌落在Luria汤中孵化。 第二天，将1：50稀释的培养液转移到充满LB的充气瓶中，并让其生长，直到外眼_600纳米的光学密度达到0.7-0.8。之后，向培养物中加入1毫米IPTG，并在18°C下继续16小时，摇晃速度为180转/分钟;通过进行SDS-PAGE分析验证蛋白质表达。
   注：在大 肠杆菌 BL21-Rosetta菌株的整个细菌生长和表达步骤中，使用了Kanamycin（50 μg/mL）和氯霉素（20 μg/mL）作为选择压力。pET28a-p97和pET41b-NPLOC4的序列见 补充文件1。
4. 蛋白质表达后，将细菌细胞以21,000× 克 离心10分钟，然后将沉淀重新悬浮在含有50 mM三氯、300 mNCl、5 mM β巯基乙醇、1 mM PMSF、5%甘油、pH值8的裂解缓冲液中。
5. 使用窄探针（探针直径6毫米），振幅为50微米，脉冲为20秒，在4°C下对细胞进行超声处理1小时。 用15,000克×沉淀1小时，收集上清液。
   注：全超声波检测持续1小时（30分钟开，30分钟关闭，脉冲20秒），过程持续至浊气细胞悬浮液变透明。需要高速离心，以确保细胞残渣保持沉淀状态，且在将裂解液加载到蛋白质纯化柱上时不会脱落。
6. 将上清液通过0.4微米过滤器，装入填充Ni-NTA珠以进行亲和纯化的柱子，并预先用纯化缓冲液（50 mM Tris-Cl，300 mM NaCl，5 mM β-巯基乙醇，5%甘油，pH值8）进行亲和纯化。
7. 用含有50 mM三氯、300 mM NaCl、5 mM β巯基乙醇、5% 甘油、pH 8 和 30-60 mM 约400 mL的吡唑的洗涤液冲洗富含蛋白质的柱子，然后用含50 mM Tris-Cl、300 mM NaCl、5 mM β巯哿乙醇、5% 甘油、pH 8 和 250 mM 吡唑的洗涤缓冲液洗脱蛋白质。
   注意：咪唑的浓度和洗涤液的体积可能因分析的具体蛋白质而异。为了评估纯度，应进行SDS-PAGE。必须彻底清洗柱子，直到洗脱液与布拉德福德试剂产生负反应。洗脱后的部分显示出显著且浓缩的目标蛋白带，应主要代表样品，其他蛋白质的痕迹仅为极少甚至可能。
8. 收集不同组分，用SDS PAGE分析以确定哪些组分含有纯蛋白，然后利用PD-10柱将缓冲液交换到反应缓冲液（200 mM HEPES、100 mM MgCl₂、1 M KCl和5% glycerol，pH 7.4）。
   注意：使用布拉德福德试剂（Coomassie Brilliant Blue G-250）测量蛋白质浓度。所有蛋白质应速冻于液氮中，并储存在-80°C。

7. 体外 细菌杀灭测定

1. 将6微米VCP/p97与各1微米的NPLOC4和UFD1混合，然后用反应缓冲液填充约90微升。让该反应混合物在冰上孵育2小时。
2. 将1-2 mM的ATP加入包含p97-UFD1-NPLOC4的反应混合物中，然后与泛素化的SPN（10.7细胞）在37°C下结合，持续2小时。
3. 为评估细菌存活性，处理后立即取1微升反应混合物的阿利格，进行连续稀释（1：1、1：10、1：100和1：1000），并将每种稀释液10-2微升点滴在脑心输注（BHI）琼脂板上。在培养2小时后，使用反应中的1微升分液重复此作。
   注意：要发现所有稀释情况，效果更好。
4. 评估0小时和2小时时间点之间的群体形成单元（CFU）。通过将2小时的CFU计数除以0小时的CFU计数，再乘以100来计算细菌存活率（%）。
   注意：为获得更可靠的结果，建议使用热变性VCP/p97、缺乏UFD1-NPLOC4辅因子复合体的VCP/p97，或VCP/p97的ATP酶缺失变体作为阴性对照。

结果

我们的方案详细介绍了利用哺乳动物A549细胞生成富含泛素化过程所需成分的细胞裂解液（见图1A）。这种裂解液，无论是浓缩状态还是被纯化的组分取代，如UBE1（E1泛素活化酶）、UbE2C（E2泛素共轭酶）和Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7复合物（E3泛素连接酶），都与纯化的泛素和ATP混合，促进细菌体 外 泛素化（见图1B）).为评估泛素化后的细菌分解反应，将纯化的VCP/p97及其辅因子UFD1和NPLOC4纳入反应（见图1C）。

通过免疫荧光，我们检测到当暴露于哺乳动物细胞裂解液或含有纯化E1-E2-E3 Ub酶的重组系统时，肺炎链球 菌（ SPN）显著泛素化。在无泛素或泛素化SPN暴露于含泛素酶OTU结构域的泛素醛结合蛋白1（O...

讨论

虽然本文所述的 体外 重建系统为探索细菌泛素化和消除的分子复杂性提供了坚实框架，但仍需考虑若干重要局限性。依赖纯化蛋白的生理超生理浓度，包括泛素化机制（E1、E2、E3连接酶、泛素）和宿主效应复合体（VCP/p97、UFD1、NPLOC4），为病原体泛素化和清除提供了关键机制见解，但可能无法真正反映活细胞内的生理条件。

细胞自主免疫系统由多种效应蛋白和泛素连接酶组成，这些连接酶协同工作，作为清除感染的保险机制。同样，VCP/p97可能无法单独作用，可能会依赖其他因素或额外的降解途径。我们的 体外 重建捕捉了Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7和VCP/p97在细菌泛素化和消除中的有效功能，但单独进行，这些功能要么高估了这些效应子的能力，要么可能不完全反映宿主细胞的生理动力学。

翻译后修饰（PTMs）引入了另一层复杂性，已知会影响众多效应蛋白的稳定性、定位和活性。在现有系统中，蛋白质通常从细菌来源（如 大肠杆菌

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50X蛋白酶抑制剂组合	孕育型	G6521
6倍-他的泛素	UBPBio	E1100
A549细胞系	空军交通管制委员会	ATCC CCL-185
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21202
Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-31572及nbsp;
抗泛素抗体	恩佐	BML-PW8810-0100
抗泛素K48特异性克隆Apu2抗体	西格玛·奥尔德里奇	ZRB2150
澳大利亚运输计划	西格玛·奥尔德里奇	A6419
BHI	HiMedia	M210
DMEM（高血糖）	HiMedia	AL251
FBS	Gibco（美国起源）	38220090
甘油	PureSynth	PSR37325
天哪	西格玛·奥尔德里奇	H4034-100G
KCl	西格玛·奥尔德里奇	P3911
MgCl2	西格玛·奥尔德里奇	TC006
对甲醛	西格玛·奥尔德里奇	E6148
pET28a-p97质粒	我们的实验室		质粒可按要求提供
pET41b-NPLOC4质粒	我们的实验室		质粒可按要求提供
pET41b-UFD1质粒	阿德基因	质粒#117107
Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7	西格玛·奥尔德里奇	23-030
肺炎链球菌 R6 株	空军交通管制委员会	空军交通管制中心BAA-255	风险组-2病原体，将在BSL-2设施处理
托德·休伊特汤粉	HiMedia	M313
UBE1	UBPBio	B1100
UbE2C	UBPBio	C1300
尿素	HiMedia	MB032
酵母提取物粉末及nbsp;	HiMedia	RM027