微加工具有微尺度刚度梯度的基底以引导骨髓基质细胞迁移

摘要

本方案详细介绍了通过软光刻技术制备双层聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底的方法。该方法利用刚性底层中几何结构调控的微结构与柔软平坦的顶层相结合，产生微尺度的有效刚度梯度，从而在无拓扑干扰的情况下实现细胞力学生物学研究。

摘要

了解细胞如何响应机械信号对于阐明组织发育和疾病进展中的机制至关重要。然而，现有的体外（in vitro）细胞培养基底通常难以在细胞尺度上复制生理性的刚度梯度，同时还无法消除干扰性的形貌线索。在本研究中，我们提出了一种解耦刚度模型，利用双层聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底实现。该基底由一层柔软、平坦的上层薄膜组成，该薄膜悬置于具有脊-沟微结构的刚性底层之上。上层能够有效传递底层结构的刚度变化，同时在细胞接触表面保持一致的形貌和化学性质。通过改变等间距交替排列的脊和沟的宽度，实现刚度的调控。扫描电子显微镜证实了表面形态的平整性和接触形貌的一致性。原子力显微镜显示，刚度变化依赖于微结构：对于20 μm的图案，脊区域的弹性模量约为950 kPa，沟区域为850 kPa；对于50 μm的图案，相应数值分别为约1070 kPa和950 kPa。小鼠原代骨髓细胞在该基底上黏附良好并充分铺展，在50 µm图案中表现出向较硬脊区域迁移并优先进行细胞核定位的趋势（61.49%，p < 0.05），从而证实细胞能够有效感知机械梯度。综上所述，本实验方案提供了一种可重复构建具有微尺度刚度梯度的细胞培养基底的方法，在最小化化学或形貌干扰的前提下，支持对细胞力传导机制的研究。

引言

细胞能够感知并响应其外部微环境中的机械刺激^1,2,3，这些刺激对于调控多种细胞过程至关重要，包括黏附、迁移、增殖和分化⁴。In vivo条件下，组织微环境的力学特性表现出显著的空间异质性，基质刚度的变化既存在于生理环境中（例如骨与肌肉交界处），也存在于病理条件下（例如肿瘤内部）^5,6,7。全面研究这些力学因素对于理解调控细胞行为的机制至关重要，而这些机制在组织发育、疾病进展以及再生与修复过程中发挥着关键作用^8,9。

模拟这种复杂的力学微环境 体外水凝胶或弹性体通过调节交联程度或组分比例，被广泛用于制备具有不同刚度的基底^{3,10,11,12,13}然而，这些方法通常导致刚度的离散变化，无法再现准确模拟生理条件的连续性微尺度刚度梯度^{13,14,15,16,17}近期研究已探索了诸如光交联（例如，使用光掩模调控紫外线照射）等技术¹⁸微流控多通道混合^19,20以及扩散驱动的方式²¹ 以构建刚度梯度。遗憾的是，这些方法在技术上可能较为复杂，并会引入额外的变量，例如网格尺寸²²，肿胀^23,24和地形²⁵引入干扰因素使细胞对刚度响应的解读变得复杂。一种双层PDMS系统已被采用，该系统利用微柱阵列或棋盘状图案作为支撑结构，以构建具有刚度梯度的细胞培养基底。^26,27这些方法依赖于化学均一膜下方的离散支撑结构，以实现各向同性的刚度调控，为研究细胞黏附和铺展提供了有价值的平台。然而，天然的细胞微环境 体内 其力学性能通常表现出强烈的各向异性^28,29这种方向性机械信号被认为会深刻影响基本的生物学事件。因此，现有的生物制造策略在模拟所观察到的细微的细胞-刚度相互作用方面存在局限性。 体内其依赖于在负载细胞的基质内精确模拟微尺度刚度梯度和空间异质性。

先前的研究表明，即使细胞未与刚性物体直接接触，也能感知其有效刚度³⁰。基于该研究，我们提出一种新型的双层聚二甲基硅氧烷（PDMS）细胞培养基底，可在5至50 µm的空间尺度上产生可控的刚度梯度，与亚细胞及单细胞力学感知相关的尺寸范围相匹配。该基底由两层不同结构组成：底层为具有可调几何微结构的刚性PDMS，上层为均匀平坦的柔软PDMS，作为与细胞接触的表面。该设计仅通过底层微结构几何形状的变化实现力学性能调控，同时保持表面化学性质和形貌的一致性。因此，该系统可有效将刚度信号与其他物理和化学信号解耦，为刚度调控提供一种更具生物学相关性的实验体系。

与传统的基于水凝胶的基底相比，我们的方法能够实现单一变量的力学研究，且不受溶胀、孔径大小或表面形貌的干扰。该基底采用标准的软光刻技术即可简便制备，且具有高度可重复性³¹它还兼容高分辨率显微镜，因此特别适用于对细胞响应微尺度刚度信号的实时成像和定量研究。本文详细介绍了该基底的完整制备方案，阐述了参数控制策略，并通过典型的细胞培养实验展示了其应用价值。最终，该方法提供了一种可靠且易于获取的技术手段 体外 用于探究细胞对微尺度刚度梯度响应的工具。

方案

从小鼠胫骨和股骨中分离出原代小鼠骨髓基质细胞（mBMSCs）（批准号：WP20230204，由武汉大学实验动物中心伦理委员会批准）。

1. 主模具制备

注意：我们的实验方案仅适用于本研究中使用的环氧基负性光刻胶。

1. 放置两片洁净的硅片（50.8 ± 0.2 mm， <100> 在加热板上放置几分钟以脱水，方向为定向，尺寸为525 ± 25 µm。
2. 从热板上取下一片硅片，冷却至室温，然后进行旋涂。在硅片中心滴加3-5 mL光刻胶。
3. 要获得20 µm的特征高度，请执行以下旋涂程序：以7.1 × 10³ rpm转速旋转10秒。 g，随后在410 × g 30秒。为获得30 µm的特征高度，执行以下旋涂程序：以7.1 × g，随后在170 × g条件下离心 g 30秒。使用手术刀小心去除旋涂过程中可能形成的边缘液滴。
4. 软烘按以下方式进行：将加热板温度设为95 °C，使晶圆在加热板上放置13 min。从加热板上取下晶圆，使其自然冷却至室温，避免温度骤降。
5. 将光掩模与涂有光刻胶的晶圆对准，并用紫外光照射，总剂量为120 mJ/cm²².
6. 以如下方式执行曝光后烘烤：使用两块加热板（65 °C 和 95 °C），先将涂有光刻胶的晶圆置于 65 °C 加热板上静置 1 分钟，随后转移至 95 °C 加热板上继续加热 5 分钟。将晶圆移至一叠无尘布上，使其冷却至室温。
7. 将晶圆转移至盛有PGMEA的培养皿中进行显影，确保整个晶圆完全浸入显影液。通过手动摇晃加速显影过程。
   注意：PGMEA 易燃，对眼睛和呼吸道有刺激性。应将其作为 "易燃有机废液" 在专用容器中。
8. 显影后取出 将晶圆从显影液中取出，并用异丙醇冲洗。若出现乳白色流动物 在异丙醇中靠近样品表面处（显影未完成）时，将样品重新浸入显影液中以完成显影过程。用异丙醇清洗已显影的样品，直至样品表面附近不再形成乳白色流动物。显影完全后，将晶圆置于150 °C的热板上烘烤15分钟，对光刻胶进行坚膜处理。
9. 对晶圆进行氟化处理，以用于后续的软光刻工艺：将晶圆置于真空条件下，用氧气等离子体处理30秒（100 W）以活化表面，随后放入真空干燥器中。在置于真空干燥器内的载玻片上滴加30 µL三氯(1H,1H,2H,2H-十三氟正辛基)硅烷，抽真空2分钟，并维持真空状态30分钟。将晶圆在90 °C下烘烤1小时，完成硅烷化过程。
   注意：整个过程中必须严格将环境相对湿度控制在60%以下。湿度过高会引发硅烷的快速水解，产生白色非挥发性聚硅氧烷沉淀物。这些沉淀物将影响硅烷蒸气分布的均匀性，导致硅烷化失败。由于三氯(1H,1H,2H,2H-十三氟正辛基)硅烷遇水会发生剧烈反应，释放有毒的氯化氢烟雾，因此处理操作应在通风橱中进行。含氟/含氯有机废液在处置前需用稀碱中和。硅烷化过程的成功率可达90%。

2. 制备

注意：用于制备双层聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底的软光刻工艺可分为两个独立步骤：1）结构化底层和顶层的制备，2）两层PDMS的键合。整体制造产率超过80%。

1. PDMS 制备
   1. 对于结构化底层，通过按重量比10:1混合预聚物和固化剂来制备PDMS前体，随后在真空下脱气。将1.5 mL PDMS前体（10:1）倒入SU8模具上，覆盖整个表面，再次在真空下脱气并静置30分钟。小心将其转移至烘箱中，在90 °C下固化1小时。从母模上脱模得到结构化PDMS底层。
   2. 对于顶层，通过按重量比30:1混合预聚物和固化剂制备PDMS前体，并在真空下脱气。将PDMS前体浇注在氟化硅晶圆上。为获得9 µm的厚度，采用以下旋涂程序：先以7.1 × g转速旋转10秒，随后以2,300 × g转速旋转60秒。
   3. 旋涂完成后，在环境光下目视检查PDMS薄膜的均匀性——特别注意是否存在条纹、气泡或边缘不均匀堆积等可见缺陷。若薄膜在整个晶圆表面呈现均匀透明且反射率一致，则进入下一步；否则，更换新的晶圆重复旋涂过程。将涂覆后的晶圆置于水平表面上，以确保PDMS薄膜厚度均匀。小心将其转移至烘箱中，在90 °C下固化3小时。
      ​注意：所获得的薄膜厚度为9.11 ± 0.34 µm。
2. 键合
   1. 将结构化PDMS底层（10:1）图案面向下放置于PDMS顶层薄膜上，确保两层之间良好接触，界面无气泡。
   2. 将组装件移入烘箱，在90 °C下固化3小时。
   3. 将组装件放置在一层无尘布上，冷却至室温。将最终的双层结构从晶圆上剥离，并存放在培养皿中以备后续使用。
      注意：若在剥离过程中顶层与底层之间出现气泡，通常表明两层之间粘附不完全。应在旋涂前对PDMS前体进行充分脱气，并在PDMS底层贴合前确认薄膜表面无灰尘或污染物，以实现完全接触。确保硅晶圆在旋涂、组装和固化过程中保持水平。薄膜撕裂可能由晶圆表面硅烷化不均或PDMS厚度不均引起。为解决该问题，需严格控制硅烷化过程中的环境湿度低于60% RH。硅烷化工艺的成功率可达90%。

3. 表征

1. 扫描电子显微镜（SEM）
   1. 使用锋利的刀片切割样品，以获得干净的边缘。
   2. 使用导电碳胶带将样品分别固定在90°和0°的SEM样品台上，以便进行横截面和表面表征。
   3. 对样品进行120秒的金溅射镀膜，以提高SEM成像质量，并采集样品的SEM图像。
2. 原子力显微镜（AFM）
   注：选择ScanAsyst-Air探针用于模量的定量纳米力学映射。
   1. 将AFM悬臂探针尖端定位在视场中心。通过调节光学杠杆系统，将激光光斑对准悬臂末端。
   2. 在进行PeakForce定量纳米力学映射（PeakForce QNM）测量之前，校准AFM悬臂以确定以下关键参数：悬臂弹簧常数：0.40135 N/m；偏转灵敏度：28.993 nm/V（通过对刚性参考样品进行力曲线测量确定）；探针半径：约21 nm（使用已知模量的参考样品通过相对法校准）。
   3. 在扫描参数列表的扫描面板中，配置以下初始扫描设置：对于具有周期性条纹且间距为50 µm的样品，将扫描尺寸设为70 µm；对于具有周期性条纹且间距为20 µm的样品，将扫描尺寸设为50 µm。将每行采样点数和行数均设为256（生成256 × 256像素的图像）。
   4. 在显微镜中打开进针设置，并在进针参数中设置仪器默认的Peak Force进针设定值。
   5. 点击工作流程工具栏上的进针图标，并在自动接近过程中持续监测实时信号。
   6. 确保ScanAsyst自动控制设置为独立模式。调节PeakForce设定值至适当数值，以实现所需的变形范围：对于顶层，PeakForce设定值为0.020 nN；对于结构化的底层，PeakForce设定值为5 nN。
   7. 通过点击从上到下或从下到上按钮启动扫描。
   8. 力曲线监测与校正：如果力曲线出现畸变或同步问题（例如形状不规则、基线不一致），在力监测窗口内右键单击并选择自动配置，以自动校正力曲线的对齐和灵敏度。
   9. 在模量计算通道设置中，选择DMT模型拟合力曲线的回撤部分，用于计算弹性模量。
   10. 点击采集按钮，获取并保存高分辨率的形貌图和纳米力学性能图。
   11. 使用AFM图像处理与分析软件进行采集后分析。打开保存的AFM数据文件，通过选择样品表面不同区域提取模量值；利用软件内置的统计分析工具，计算顶层和底层的平均模量、标准偏差及分布曲线。导出处理后的模量图和定量数据。
   12. 每样品AFM扫描次数：对每个样品进行三次独立的全区域扫描。确保每次扫描覆盖与样品结构特征尺寸相匹配的区域，即具有50 µm间距周期性条纹的样品为70 µm × 70 µm，具有20 µm间距条纹的样品为50 µm × 50 µm。对于底层结构（10:1 PDMS）和顶层薄膜（30:1 PDMS）的模量测量，采用以下采样策略以确保数据可靠性。
       1. 顶层薄膜（30:1 PDMS）：独立测量模量2次，每次测量包含两个不重叠的5 µm × 5 µm扫描区域。
       2. 底层结构（10:1 PDMS）：由于其具有两种不同的周期性条纹构型（20 µm和50 µm间距），对每种构型分别独立测量模量2次。

4. 体外 细胞培养实验

注意：聚二甲基硅氧烷（PDMS）是一种疏水性材料，在进行细胞培养前需包被以促进细胞黏附，应根据细胞类型选择合适的包被方法。若细胞实验使用原代细胞，必须事先获得伦理批准。

1. 多聚-D-赖氨酸（PDL）包被
   1. 将基质在酒精中浸泡10分钟进行灭菌，然后用PBS洗涤3次，每次5分钟。
   2. 使用PBS溶解PDL（分子量150,000至300,000 Da），使其浓度为0.1 mg/mL。对于24孔板规格的基质，加入1 mL PDL工作液，并置于37 °C培养箱中孵育4小时，以充分包被基质表面。
   3. 包被完成后，移除PDL工作液，并用PBS洗涤3次以去除残留的PDL。随后即可用于后续细胞实验。若不立即使用，应将包被后的基质干燥后于4 °C保存。
      注意：成功的包被在相差显微镜下呈现均匀、无特征的表面，无可见的结晶沉淀或干燥伪影。出现结晶或包被不均的基质应弃用。
2. 原代小鼠骨髓基质细胞（mBMSCs）的分离与培养
   1. 从小鼠的胫骨和股骨中分离原代小鼠骨髓基质细胞（mBMSCs）。
   2. 将细胞培养于生长培养基中，该培养基由添加10%胎牛血清（FBS）、1%抗生素-抗真菌剂和1%丙酮酸钠的α-MEM组成。
   3. 将第3代细胞以5,000个细胞/cm²的密度接种至步骤4.1.3获得的基质上，以最大限度减少细胞间接触可能带来的干扰效应。
3. 免疫荧光染色与成像
   1. 培养16小时（37 °C，5% CO₂）后，在室温下用4%多聚甲醛固定细胞10分钟，并用PBS洗涤3次。随后在室温下用0.1% Triton X-100对细胞进行透化处理15分钟，再用PBS洗涤3次。
   2. 为观察细胞骨架，使用鬼笔环肽（phalloidin，稀释比例1:500）在室温下染色20分钟，并用足量PBS洗涤3次以去除残留染料。
   3. 进行基质封片的同时对细胞核进行共染色。滴加含DAPI的甘油覆盖细胞，然后小心地将盖玻片置于基质上方，并用指甲油密封边缘。应尽可能避免产生气泡。
   4. 使用倒置荧光显微镜获取荧光图像，以观察细胞形态和细胞核定位。

结果

采用光刻技术制备具有平行脊槽微结构的可重复使用硅模板。设计了两种结构，其沟槽宽度（脊的宽度与沟槽宽度相同）分别为20和50 μm。每个图案化区域的尺寸为7 mm × 7 mm。硅模板的高精度和可重复使用性显著简化了基底的重复制备过程。随后利用该母模在聚二甲基硅氧烷（PDMS）中复制微结构。使用硬度较高的PDMS配方在硅模板上成型，制得底层；再将一层薄而柔软且平整的PDMS薄膜键合在底层之上，从而形成双层结构系统。

图1 展示了所制备的双层基底，其中包含一个中央方形区域，该区域内具有刚度梯度，周围环绕着作为刚度对照的平坦区域。扫描电镜（SEM）图像证实了结构转移的保真性，并显示梯度区域的上表面平坦且无拓扑特征（图2）。该设计确保了在基底上培养的细胞仅受到刚度变化的影响，而不受拓扑线索的干扰。

为了验证该系统的力学性能，采用原子力显微镜（AFM）独立测量了两层材料的弹性模量。柔软的上层模量为 899 ± 50 k...

讨论

本研究提出了一种新型方法，用于构建基于双层聚二甲基硅氧烷（PDMS）的基底，旨在引入局部刚度变化，同时保持表面形貌均匀且无特征结构。该方法仅通过改变底层结构的几何形状来实现力学性能的调控，同时保持表面化学性质和形貌的一致性。因此，该系统能够将刚度信号与其他物理和化学信号有效解耦，为刚度调控提供了一个更符合生物学实际的研究平台。

本研究通过调节刚性底层PDMS的几何结构实现刚度调控，顶部较薄且较柔软的PDMS层则确保了平整的接触界面，从而与多种细胞类型和成像系统具有良好的兼容性。与依赖完全交联水凝胶或具有离散刚度水平的整体PDMS基底的传统方法相比，该方法具有更高的空间分辨率和连续性。它可在单一基底上构建多个不同刚度区域，提高了实验间的可比性，并最大限度地减少了批次差异。该基底可在较宽范围内精确调节刚度，有效覆盖骨组织早期愈合过程中肉芽组织（~0.99 MPa）的力学特性，以及正常皮肤与瘢痕皮肤之间的刚度差异^32,33。因此，该系统非常适用于在上述背景下研究刚度依赖性...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4% 多聚甲醛	Servicebio Technology	G1101
丙酮	上海阿拉丁	10000418
双抗	Gibco	15240-062	抗生素-抗真菌素
含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂	碧云天生物技术	P0131	含 DAPI 的甘油
细胞培养板	NEST	702001	24 孔
干燥器	四川蜀波（集团）有限公司	913354-30SN	内径=180 mm
胎牛血清	HyClone	SV30208.02
倒置荧光显微镜	Olympus	DP74
异丙醇	上海阿拉丁	80109218	色谱纯≥99.7%
掩模对准器	四川南光真空技术有限公司	H94-37
MEM α 改良培养基	HyClone	SH30265.01
Nanoscope Analysis	Bruker	Version 3.0	原子力显微镜图像处理与分析软件
Opera Phenix Plus 高内涵成像系统	Perkin Elmer	2400L23248	配备 10x 空气物镜
PGMEA	苏州纳微科技有限公司	171011-1	负性光刻胶显影液；规格：UL；纯度：最小 99.7%
鬼笔环肽	Uelandy	YP0052L	594-鬼笔环肽
磷酸盐缓冲液	HyClone	SH30256.01
等离子清洗仪	Plasma technology (德国)	Flecto 10
多聚赖氨酸	碧云天生物技术	ST508	CAS 编号 27964-99-4
扫描探针显微镜	Bruker	Dimension Icon	使用 Nanoscope 控制软件，包含 PeakForce 定量纳米力学成像 (PF-QNM) 和点触式斜坡实验工作区。
氮化硅悬臂梁上的硅探针	Bruker	SCANASYST-AIR	探针具有单个 V 形铝反射涂层悬臂梁；k = 0.4 N/m（标称值），f0 = 70 kHz。
硅片	深圳严谨科技有限公司	-	直径 50.8±0.3 mm，(100) 晶向，厚度 525±25 μm
丙酮酸钠	Gibco	11360-070
旋涂仪	中国科学院微电子研究所	KW-4A
SU-8 3025	苏州纳微科技有限公司	-	负性光刻胶；固含量 72.3%；黏度 4400；密度 1.143 g/mL
SYLGARD 184 硅橡胶弹性体试剂盒	陶氏化学公司	01673921
三氯(1H,1H,2H,2H-十三氟正辛基)硅烷	上海阿拉丁	78560-45-9
吐温 X-100	BioFroxx	1139ML100	用于透化处理的 0.1% 吐温 X-100
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200-072	0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1x)
真空烘箱	Memmert (德国)	VO 200