本方案描述了一种独特的临床方案，采用酚红线法采集人泪液样本，并结合基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的工作流程，用于发现泪液脂质组学特征。该简单的甲基叔丁基醚（MTBE）/甲醇双相分离方法可实现快速泪液脂质提取，具有高回收率，适用于泪液生物标志物的发现。
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摘要
摘要
泪液脂质对于泪膜稳定性和眼表健康至关重要。泪液成分的变化可能与睑板腺功能障碍和脂质代谢紊乱等眼部及全身性疾病相关。对泪液脂质进行谱型分析，有助于发现可用于疾病诊断与管理的生物标志物。然而，常规的泪液采样方法存在明显局限性：Schirmer 试纸因其与眼表接触面积较大，常引起眼部刺激和不适；而毛细管采集法则由于操作者间差异，尤其是不同人员操作时，可能导致重复性较差。这些局限性可能影响脂质组学数据的准确性和一致性。本研究介绍了一种基于酚红线（PRT）的微创采样方法，经优化适用于泪液脂质组学分析。PRT 的细小结构可最大限度降低眼部刺激风险，并实现快速、轻柔的泪液采集。该方法操作简便、用户友好，适用于泪液量减少或对异物感耐受性较低的受试者，同时通过减少操作者依赖性差异，提高了样本采集的可重复性。采用优化的甲醇/甲基叔丁基醚（MTBE）相分离法提取 PRT 采集的泪液脂质，并通过高分辨 LC-Orbitrap-IQX MS/MS 结合 LipidSearch 软件进行分析。该工作流程鉴定出超过 700 种独特的泪液脂质分子，每种均通过特定的脂肪酸来源产物离子加以表征。结果表明，基于 PRT 的采样方法可实现稳定的脂质回收，适用于泪液脂质组学分析。这种微创且可重复的方法为临床和实验性泪液脂质研究提供了实用平台，最终也有助于生物标志物的发现和疾病监测。
引言
泪膜是最外层的屏障，可保护眼表免受病原体侵袭并维持眼部稳态1,2，而泪膜中的脂质层是防止泪液蒸发和维持泪膜稳定性的关键成分3,4。泪脂成分的失调已与多种眼病相关，包括干眼症（DED）、睑板腺功能障碍（MGD）和过敏性结膜炎5,6,7,8。因此，对泪脂组学进行详细表征已成为一项重要且前沿的研究方向，有助于更全面地理解这些眼表疾病背后的分子病理机制9。
尽管泪液脂质组学方法具有重要的临床意义，但泪液脂质组学面临的一个关键挑战是建立标准化、可重复的采集与分析流程。目前的泪液采样方法，如Schirmer试纸条和微毛细管，各自存在明显局限性。Schirmer试纸条与眼表接触面积较大，常引起眼部刺激和反射性流泪9,10。相比之下，微毛细管采....
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方案
本研究获得了香港理工大学机构审查委员会（IRB）的批准。受试者在参与研究前均签署了书面知情同意书。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 基于酚红线（PRT）的人类泪液采集
- 佩戴手套并消毒工作台，以防止样本污染。
- 打开前请确认PRT包装密封且未过有效期。
- 握住线材时应抓取弯曲钩的对侧末端，切勿触碰PRT的弯曲钩部分。
- 请受试者注视上方鼻侧方向。
- 轻轻下拉受试者的下眼睑，将PRT插入下眼睑颞侧结膜处，弯曲钩应置于靠近眼外眦的位置（图2）。
图2：采集泪液时酚红棉线的位....
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结果
从16名健康志愿者中采集了复合泪液样本，每位志愿者分别在三个独立的访视中进行采样，每次访视间隔两周（R1为最早批次；R2、R3依次在前一次采样后两周采集）。使用LipidSearch软件并设定严格筛选标准（即信噪比≥100、等级为C及以上，离子强度≥30,000），在R1–R3样本中分别鉴定出773、890和1,025种独特的脂质分子（图5A）。正离子模式共鉴定出1,302种脂质分子，其中26.0%为A级（即脂质类别及该脂质的所有脂肪酸链均被完全鉴定；共338种脂质），13.2%为B级（即脂质类别完全鉴定，脂肪酸链部分鉴定），60.8%为C级（即检测到特异于脂质类别的离子或由脂肪酸衍生的产物离子）。负离子模式鉴定出257种独特的脂质分子，其中8.2%为A级（21种脂质），22.9%为B级，68.9%为C级（图5B）。两种模式联合分析共检测到1,559种不同的脂质分子。尽管存在与储存相关的差异，仍有394种脂质分子在全部三个样本集中被稳定检出（图6）。三次访视间.......
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讨论
基于PRT的泪液采样与脂质提取的优势
本文所介绍的基于PRT的泪液脂质组学流程提供了一种微创且实用的采样方法，适用于全面的泪液脂质谱分析。与需要较长时间接触且采集样本量较大的Schirmer试纸条相比，PRT采样速度快，可在2分钟内完成，适用于包括泪液分泌减少或眼部敏感性增高在内的多种人群，且所获得的泪液样本适用于高分辨率液相色谱-质谱（LC-MS）脂质组学分析14,20。与耗时较长、操作技术要求高且依赖操作者经验的微毛细管管采集方法不同，基于PRT的采样方法几乎无需专门培训，可在临床环境中轻松实施，具有高度的可重复性和易用性14。在脂质提取方法方面，采用MTBE/甲醇体系的液相分离法避免了氯仿的毒性，同时对大多数脂质类别而言，其脂质回收率与传统的Folch法和Bligh-Dyer法相当甚至更优，尽管在某些极性较强的溶血磷脂（如LPC、LPE）上回收率可能略有降低。该流程成功鉴定出跨越23个脂质类别的700余种独特泪液脂质分子，.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由创新香港研发平台计划（InnoHK）、中国香港特别行政区政府以及香港理工大学SHARP视觉研究中心资助。作者还衷心感谢香港理工大学化学与环境分析大学研究设施（UCEA）和生命科学大学研究设施（ULS）提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈（ACN），液相色谱-质谱级 | RCI Labscan | LM1005 | |
| ACQUITY UPLC CSH C18 色谱柱 | 沃特世公司 | 186005297 | 130Å, 1.7 µ2.1 mm × 100 mm |
| 甲酸铵，LC-MS级 | Sigma-Aldrich | 55674 | |
| 自动进样器玻璃小瓶 | 威尔里奇科学公司 | 2ML-9-V1002 | 2 mL 透明玻璃瓶，12×32 mm 平底，9-425 螺纹，带标签（含书写区） |
| 蓝色 9-425 开顶螺纹盖 | 威尔里奇科学公司 | 9-SP1003 | 带9毫米白色聚四氟乙烯/红色硅胶隔垫，1毫米 |
| 氯仿，HPLC 级 | 杜克桑试剂 | 1271 | |
| Eppendorf Safe-Lock 离心管，1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| 甲酸（FA）， LC-MS 级 | 赛默飞世尔科技 | A117-50 | |
| 玻璃微量插件 | 威尔里奇科学公司 | 2ML-N2002 | 250 µl 插入件，透明玻璃，锥形底带聚苯乙烯弹簧，规格：5.8*28.5mm |
| 异丙醇，液相色谱-质谱级 | RCI Labscan | LM1162 | |
| LipidSearch 软件 | 赛默飞世尔科技 | OPTON-30879 | 版本 5 |
| 甲醇， LC-MS级 | RCI Labscan | LM1115 | |
| 酚红棉线试验 (PRT) | 天津精明新技术开发有限公司 | 20192160086 | |
| 冷藏离心机 | 赛默飞世尔科技 | 75007200 | |
| 冷藏式CentriVap离心浓缩仪及CentriVap冷阱 | Labconco | 16108335 | |
| 带螺帽微量管 | 赛默飞世尔科技 | 3488 | |
| 叔丁基甲基醚（MTBE），HPLC 级 | 杜克桑试剂 | 1070 | |
| 赛默飞世尔科技 Dionex UltiMate 3000 高效液相色谱仪 | 赛默飞世尔科技 | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Thermo Scientific Orbitrap IQ-X Tribrid 质谱仪 | ThermoFisher Scientific | FSN05-10001 | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
| 超声波清洗器 | Crest 超声波 | P500D-45 | |
| 涡旋混合器 | 基准测试 | BV1003 |
参考文献
- Esam, S., Singh, S., Konda, N., Gandhi, R., Vemuganti, G. K. Tear film lipid layer thickness: Measurement techniques, normative values and alteration in ocular surface diseases. Curr Eye Res. , (2025).
- Ambaw, Y. A., et al.
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重印与许可
