Method Article

基于酚红线的非靶向泪液脂质采样程序在生物标志物发现中

DOI:

10.3791/69474

⸱

December 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Myopia Research, School of Optometry, The Hong Kong Polytechnic University, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR), 3Department of Food Science and Nutrition, The Hong Kong Polytechnic University, 4Research Centre for SHARP Vision (RCSV), The Hong Kong Polytechnic University, 5Department of Applied Biology and Chemical Technology, The Hong Kong Polytechnic University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该方案描述了一种独特的临床方案，用于利用酚红线和基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的工作流程采集人类泪液样本，以发现泪液脂质组剖面。简单的甲基叔丁基醚（MTBE）/甲醇双相分离方法能够快速提取泪脂，并实现高回收率，以发现泪液生物标志物。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

泪脂对泪膜的稳定性和眼表面健康至关重要。泪液成分的变化可能与睑板腺功能障碍和血脂异常等眼部和全身性疾病相关。对泪液脂质进行分析有助于发现疾病诊断和管理的生物标志物。然而，常见的泪液采样方法存在明显局限性：Schirmer试纸因与眼表接触面积大，常引起眼部刺激和不适，而微毛细血管管采集则因作者差异性而可能重复性较低，尤其是由不同专业人员执行时。这些限制可能影响脂质组数据的准确性和一致性。本研究引入了一种基于微创苯酚红线（PRT）的采样方法，优化用于泪液脂质组学。PRT薄的结构最大限度地减少了眼部刺激的风险，并允许快速且温和地收集泪液。这种用户友好且易于执行的方法适合泪液量减少或对异物感觉耐受性较低的受试者，并通过减少操作员依赖性变异性，提高了样本采集的重复性。PRT采集的泪脂采用优化的甲醇/甲基叔丁基醚（MTBE）相分离协议提取，并用高分辨率LC-Orbitrap-IQX MS/MS和LipidSearch软件进行分析。该工作流程识别出700多种独特的泪脂类，每种都具有特定的脂肪酸衍生产物离子。这些结果表明基于PRT的采样为泪液脂质分析提供了强健的脂质回收。这种微创且可重复的方法为临床和实验性泪液脂质研究提供了实用平台。最终，这也可能促进生物标志物的发现和疾病监测。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

泪膜是最外层的屏障，保护眼表面免受病原体侵害并维持眼球稳态 1,2，而泪膜中的脂质层则是防止泪液蒸发和维持泪膜稳定性的关键成分 3,4。泪脂成分调节失调已被发现与多种眼病有关，包括干眼病（DED）、睑板腺功能障碍（MGD）和过敏性结膜炎5,6,7,8。因此，对泪滴脂质组学的详细表征已成为更全面理解这些眼部疾病背后分子病理的关键且趋向的研究方向。

尽管泪液脂质学方法具有重要的临床意义，但泪液脂质学的一个关键挑战是建立一个标准化、可重复的采集和分析工作流程。目前的泪滴取样方法、Schirmer试纸和微毛细管各有其局限性。Schirmer 试纸与眼表面接触面积较大，常引起眼部刺激和反射撕裂 9,10。相比之下，微毛细管采集高度依赖作技术，不同人员作时结果可能不一致。此外，不当使用这些采样工具还可能带来眼表损伤的风险。这些限制可能影响下游数据的准确性和可重复性12,13。此外，需要复杂处理程序的泪液收集方法可能限制其在不同实验室和临床环境中的可及性和标准化。因此，迫切需要建立一种非侵入性、稳健且可重复的泪液采集和处理流程，以保持天然的泪脂谱。

近期研究强调了酚红线（PRT）在蛋白质组学和代谢组学应用中LC-MS/MS下游工作流程分析中的实用性（14,15）。PRT作为泪液收集工具具有固有优势。其薄结构、微创性质和简便采样程序可最大限度降低技术复杂性，减少操作员依赖性变异性，同时大多数受试者能良好耐受14,16。然而，针对基于PRT的泪液脂质分析，尚未建立出标准化的工作流程。

该方案引入了可重复的泪液脂质组学集成工作流程：一种用户友好的基于PRT的泪液采集方法，适用于脂质分析;一种优化的甲基叔丁基醚（MTBE）/甲醇脂质提取协议，具有定义溶剂与样品比例和储存控制17,18;以及一种使用高分辨率LC-MS/MS的改良脂质鉴定方法。这种标准化方法能够实现一致的泪液脂质剖析，用于下游生物标志物的发现和疾病表征。此外，它特别适合泪液量低或对异物感觉耐受度较低的受试者（见图1）。

figure-introduction-1
图1：基于酚红线（PRT）的人体泪液脂质组学工作流程示意概述。采用PRT方法的受试者采集泪液，实现稳定采样且减轻不适感。样品处理包括连续的MTBE/甲醇双相提取、SpeedVac介导的浓度，以及泪脂提取物的重组，用于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）。随后通过LC-MS/MS获取脂质组图谱，并使用LipidSearch软件进行注释和鉴定。请点击此处查看该图的放大版本。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该研究获得了香港理工大学机构审查委员会（IRB）的批准。受试者在参与研究前提供了书面知情同意。试剂和所用设备列于 材料表中。

1. 基于苯酚红线（PRT）的人体泪液采集

  1. 请戴手套并消毒工作站，以防止样本被污染。
  2. 打开前一定要确保PRT包裹密封且没有过期。
  3. 用与弯曲钩针相反的端头握住线头。一定要避免触碰PRT弯曲的钩子部分。
  4. 让受试者看上鼻的方向。
  5. 轻轻拉下受试者的下眼睑，将弯曲钩子插入PRT，钩子位于受试者眼外眼角附近的下颞叶结膜（见图2）。

figure-protocol-1
图2：泪液收集过程中酚红线的位置。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 让受试者轻轻闭上眼睛，微微前倾头，防止PRT触碰他的面部皮肤。
    注意：被泪吸收时会逐渐形成红色染料前沿，表明由于pH敏感的酚红，PRT的采样区域。为确保有足够的泪液进行脂质分析，建议采集相当于50毫米PRT的泪液体积，通常在2分钟内完成。
  2. 轻轻拉下受试者的下眼睑，取出采样的PRT。避免触碰采样区域。
  3. 记录PRT采样区域的长度，并借助无菌镊子将PRT转移到新的样本管中。
    注意：如果采样的PRT长度为<50毫米，请请受试者休息1-3分钟，并用同一只眼睛重复采集。将每个采样PRT转移到单独的样品管中。
  4. 正确标记并封好样品管。
  5. 用甲醇彻底清洁手套和镊子，并用清洁的纸巾去除撕裂残留物或污染物，然后晾干。
  6. 对另一只眼睛重复步骤1.2-1.10。
  7. 用防腐胶封住样品管，立即将样品存放于-20°C进行临时保存，或-80°C进行长期保存。避免不必要的冷冻解冻循环，并保护采样PRT免受光照影响。

2. 采样PRT的处理

  1. 在处理PRT之前，先用甲醇预洗微剪刀。
  2. 丢弃PRT的弯曲钩端（即前3毫米）。

figure-protocol-2
图3：酚红线（PRT）的外观。 （A） 未使用的PRT钩端弯曲。（B）使用PRT切开并采集标注切片进行脂质提取。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 将采样的PRT区域（即酚红染料前端以上）切成2毫米的片段，并将这些片段转移到一个干净的1.5毫升有机溶剂耐受微离心管中。

3. MTBE/甲醇二相分离，用于从采样PRT中提取脂质

注意：MTBE和甲醇是易燃且易燃的。在通风良好的区域或排气柜中使用。避免明火和火花。戴手套和实验服。处理完后要洗手。

  1. 把样品冰块放上冰块。
  2. 向每个样品加入232微升冰冷甲醇（MS级），并进行涡旋15秒。
  3. 用预冷的超声清洗器对样品进行超声波清洗15分钟。
  4. 每个样品加入774微升MTBE（高效液相色谱级）和194微升去离子水，并进行15秒的涡旋。样品中MTBE：甲醇：水的体积比应为4：1.2：1（v/v/v）。
  5. 再次用预冷却的超声波清洗剂对样本进行超声波处理15分钟。
  6. 将样品在4°C下孵育8小时，摇晃时每分钟1200转。
  7. 让混合物在室温下静置10分钟。
  8. 将混合物在10,000 × g 下离心，温度为4°C，离心10分钟。
  9. 离心后，混合物被分离为两相（见图4）。
    注意：相分离完成后，检查样品是否有两层明显的分隔：上层有机相（富含MTBE）应呈现透明且略带乳白色不透明度，而下层水相表现出因酚红指示剂而呈现黄色。只有在观察到这些相位特性时才进行，如 图4所示。

figure-protocol-3
图4：使用MTBE-甲醇水进行脂质提取的相分离：上有机相和下水相。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 仔细收集700微升含脂质的上部有机分馏，转移到预冷的1.5毫升微离心机管中。
  2. 将含有残留MTBE和甲醇的下层水相作为有害化学废弃物丢弃。收集带有标签、密封的容器中的废物，并按照机构的有害废弃物规范和当地法规进行处置。不要将溶剂倒进排水口。
  3. 用冷藏的SpeedVac浓缩器在4°C下干燥脂质提取物4小时。
    注意：为确保完全干燥，从2小时开始定期检查样品干燥情况。根据需要延长干燥时间，直到样品完全干燥。
  4. 干燥脂质提取物可短期储存在-20°C，长期储存时可保存至-80°C。

4. 提取的泪脂重组以进行LC-MS/MS分析

  1. 用50微升冰冷甲醇（MS级）/氯仿（HPLC级）混合物（1：1，v/v）作为溶剂（每1毫米PRT加1微升溶剂）重新合成干燥脂质提取物，并在预冷超声清洗机中进行超声波清洗15分钟。
  2. 在14,000× 克 、4摄氏度下离心复合脂质提取物，离心10分钟。
  3. 小心地将40微升上清液转移到装有玻璃插入件的自动取样玻璃瓶中。
  4. 用非裂缝隔开盖紧闭瓶盖，准备进行LC-MS/MS分析。

5. 通过LC-MS/MS采集样品

  1. 液相色谱时，将柱室和取样器温度分别设为50°C和4°C。
  2. 每次注射时，将5微升样品装入反相液氨酸液谱柱（C18;1.7微米，100毫米×2.1毫米），并以24分钟的分离梯度以0.3毫升/分钟的流速分馏脂质。
    1. 使用流动相A，由60：40乙腈（MS级）：水（v/v）与5 mM的铵亚芽（MS级）和0.1%（v/v）甲酸（MS级）以及含有90：10异丙醇（MS级）的流动相B（含90：10异丙醇）和5 mM的铵甲酸和0.1%（v/v）甲酸的混合物组成。
    2. 使用以下梯度：0-2分钟：40% B;2-2.5分钟：40%B;2.5-3分钟：58%B;3-18分钟：99% B;18-20分钟：99%为B;20-20.1分钟：40%B;20.1-24分钟：40%B。
  3. 对于Orbitrap质谱仪，正模式将喷雾电压设置为+3.5 kV，负模式为-2.5 kV。
  4. 将护套气体流量调整为45 Arb，辅助气体流量调整为10 Arb。
  5. 将扫气流量设置为2 Arb。
  6. 将离子转移管温度设为300°C，蒸发器温度设为320°C。
  7. 使用数据依赖采集（DDA）模式。
  8. 对于MS1，分辨率设置为120,000，扫描范围为100-2000 m/z，标准AGC目标，自动注入时间，动态排除为6秒，强度阈值设为5.0e4。
  9. 对于MS2，分辨率设置为15,000，自动扫描距离，标准AGC目标，动态注入时间，隔离窗口为1.6 m/z，碰撞能量类型为高能碰撞解离（HCD），并将归一化碰撞能量（NCE）设为15、30和40的阶梯值。
  10. 使用LipidSearch软件或其他兼容平台分析原始数据。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

从16名健康志愿者中采集了复合撕裂样本，分三次独立就诊，间隔两周（R1，最老一批;R2、R3在每项后连续采集两周。利用严格标准（即信噪比≥100、C级及以上、离子强度≥30,000）的脂质搜索，我们在R1-R3中分别鉴定出773、890和1,025个独特的脂质物种（见图5A）。阳性离子模式识别出1302种脂质，具有26.0%的A级（即完全鉴定了脂类及属于某脂质的所有脂肪酸链;338种脂质），13.2%为B级（即完全识别脂质类，部分鉴定了脂肪酸链），60.8%为C级（即检测到脂类特异性离子或脂肪酸衍生产物离子）。负离子模式识别出257种独特的脂质，分别为8.2%为A级（21种脂质）、22.9%为B级和68.9%为C级（见图5B）。综合分析在两种模式中检测出共1559种独特的脂质物种。尽管存在储存相关变异，三组样本中一致识别出394个物种（见图6）。三次就诊中受试者间变异系数为21.5%（阳性模式...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基于PRT的泪液采样和脂质提取的优势
本文介绍的基于PRT的泪脂组学工作流程，提供了一种微创且实用的全面泪脂脂质剖析方法。与需要长时间接触和更大样本量的Schirmer试纸相比，PRT采样速度快，可在2分钟内完成，适合多样人群，包括泪液体积减少或眼部敏感度较高者，且泪液样本与高分辨率LC-MS脂质组学兼容14,20.与耗时且需要精确技术作和作专家的微毛细管采集不同，PRT采样培训简便，且可在临床环境中轻松执行，具有高重复性和易用性14。关于脂质提取方法，基于MTBE/甲醇的相分离避免了氯仿毒性，同时在大多数脂类中提供与传统Folch和Bligh-Dyer方法相当或更优的脂质回收率，尽管某些极性溶磷脂（LPC、LPE）的回收率可能略有下降。该工作流程成功识别了23个脂类中700多种独特的泪脂物，显著扩展了之前的泪脂组数据集...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无需声明利益冲突。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了InnoHK倡议、香港特别行政区政府以及香港理工大学SHARP愿景研究中心的支持。作者还感谢香港理工大学化学与环境分析大学研究设施（UCEA）及生命科学研究设施（ULS）的技术支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
丙腈（ACN），LC-MS级RCI LabscanLM1005
ACQUITY UPLC CSH C18 柱沃特斯公司186005297130Å， 1.7 µ米，2.1毫米 X 100毫米
铵甲酸酯，LC-MS级西格玛-奥尔德里奇55674
自动采样玻璃瓶韦尔里奇科学2ML-9-V10022mL透明玻璃 12*32mm 平底 9-425 螺纹小瓶，带标签（附写板）
蓝色9-425敞篷肋纹螺丝盖;韦尔里奇科学9-SP10039毫米，白色PTFE/红色硅胶Septa 1毫米
氯仿，HPLC级独山试剂1271
Eppendorf 安全锁管，1.5 毫升埃彭多夫30120086
甲酸（FA）及nbsp;LC-MS级热飞世科学A117-50
玻璃微型插入件韦尔里奇科学2ML-N2002250和微小;L 型插片，透明玻璃，锥形底座，带聚弹簧，尺寸：5.8*28.5毫米
异丙醇，LC-MS级RCI LabscanLM1162
脂质搜索软件热飞世科学OPTON-30879版本5
甲醇，nbsp;LC-MS级RCI LabscanLM1115
酚红线 （PRT）天津景明新技术发展有限公司20192160086
冷藏离心机热飞世科学75007200
冷藏离心式蒸汽离心式浓缩器和离心式真空冷水弯拉布孔科16108335
螺丝帽微管热飞世科学3488
叔丁基甲基醚（MTBE），HPLC级独山试剂1070
Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 高效液相色谱热飞世科学ULTIM3000RSLCNANO
Thermo Scientific Orbitrap IQ-X 三混 MS热飞世科学FSN05-10001
热混合器C埃彭多夫5382000015
超声清洁器克雷斯特超声波P500D-45
漩涡混合器基准测试BV1003

References

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