坏死性凋亡期间溶酶体膜透化的活细胞成像

摘要

该协议描述了一种活细胞成像方法，用于监测坏死性凋亡期间溶酶体膜通透性，利用荧光探针检测溶酶体膜完整性和酸化的变化。

摘要

坏死性凋亡是调节性坏死的一种形式，最终导致细胞膜破裂。我们的实验室和其他人发现，溶酶体膜透化 （LMP） 是该过程中的早期和关键事件，在膜破裂之前。快速 LMP 将强效溶酶体酶，特别是蛋白酶，释放到细胞质中，积极促进细胞死亡。活细胞成像为实时检测坏死性凋亡期间的 LMP 提供了宝贵的工具。几种荧光染料非常有效：（1） pH 敏感的 LysoTracker 染料跟踪溶酶体 pH 值的变化。荧光信号的降低表明溶酶体 pH 梯度的丧失，这是溶酶体功能障碍的主要体征，这可能是 LMP 的前兆或直接后果。（2）荧光素标记的葡聚糖珠被内化并积累在溶酶体中。它们释放到细胞质中表明 LMP 完全泄漏和货物泄漏。在这里，我们观察到Lysotracker荧光逐渐丧失，在坏死性凋亡诱导后，葡聚糖荧光扩散到细胞质中。因此，活细胞成像方法使研究人员能够精确跟踪溶酶体功能障碍的时间和程度，有助于更全面地了解坏死性凋亡机制并阐明潜在的治疗干预措施。

引言

坏死性凋亡是一种非半胱天冬酶的调节细胞死亡形式，与许多炎症性疾病、神经退行性疾病、肺、肝和心脏疾病有关 ^1,2,3。该途径由复杂的级联反应介导，最终激活受体相互作用蛋白激酶 1 （RIPK1），该蛋白激酶 1 通过其同型 RIP 相互作用基序 （RHIM） 结构域与受体相互作用蛋白激酶 3 （RIPK3） 相互作用 ^4,5,6。反过来，RIPK3 招募混合谱系激酶样蛋白 （MLKL） 以形成坏死体 ^7,8。RIPK3 对 MLKL 的磷酸化导致其低聚化和随后的聚合。然后MLKL聚合物易位到细胞膜，最终导致细胞膜破裂和细胞死亡9,10,11。然而，MLKL 聚合物易位到膜室并诱导膜破坏的机制尚不完全清楚。

溶酶体是负责细胞材料降解和回收的细胞器。在其管腔中，有蛋白酶、脂肪酶、核酸酶和水解酶，负责消化大分子，从而维持细胞稳态^12,13。因此，维持溶酶体完整性和正常功能对于确保有效的细胞清除、适应压力和总细胞存活至关重要14,15,16。最近的研究表明坏死性凋亡与溶酶体膜透化（LMP）之间存在关联17,18,19。

我们最近的观察表明，LMP是坏死性凋亡过程中的早期和重要事件，在细胞膜最终破裂之前¹⁹。具体来说，溶酶体膜上的MLKL聚合诱导LMP快速释放强效溶酶体酶，特别是蛋白酶，包括组织蛋白酶B，到细胞质中。然后，这些蛋白酶会切割重要的蛋白质以促进细胞死亡。重要的是，抑制CTSB活性可以强有力地防止细胞死亡^19,20。该数据表明 LMP 是坏死性凋亡途径的关键调节剂。因此，监测坏死性凋亡期间 LMP 的时间对于了解分子机制和确定潜在的治疗靶点至关重要。

许多传统的LMP检测方法，如免疫染色，透射电子显微镜（TEM）或流式细胞术，需要固定样品或以其他方式仅提供终点信息21,22,23，未能捕获溶酶体破坏的动态过程，特别是在快速坏死性凋亡进展的情况下。相比之下，活细胞成像方法可以在坏死性凋亡期间对 LMP 进行高分辨率、实时可视化。在该协议中，我们结合了两种互补的溶酶体标记物并在HT-29细胞中诱导坏死性肺，以实时分析溶酶体膜完整性¹⁹。该技术提供了一个强大且适应性强的平台，不仅用于研究坏死性凋亡中的LMP，还可用于研究溶酶体完整性受损的其他形式的细胞应激，特别是在疾病或使用溶酶体靶向疗法的情况下24,25,26。

方案

1. 细胞培养 - 第 0 天

1. 将 5,000 个细胞接种在 2 mL DMEM（Dulbecco 改良鹰培养基）中，补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素和链霉素 （P/S），在无菌玻璃底培养皿中。
2. 将细胞与 5% CO₂ 在 37°C 下孵育过夜。

2. 葡聚糖珠装载 - 第 1 天

1. 通过加入 20 μL 2.5 mg/mL 储备溶液，在补充有 10% FBS 和 1% P/S 的新鲜 DMEM 中将葡聚糖绿珠稀释至 25 μg/mL。
2. 取出旧培养基，用补充有 10% FBS 和 1% P/S 的 2 mL 含珠子 DMEM 代替。
3. 将细胞在37°C下与5%CO₂ 孵育24小时，以允许珠子内化到溶酶体中。

3. 溶菌追踪器染色 - 第 2 天（实验日）

1. 通过将 2 μL 1 mM Lysotracker 储备溶液添加到 2 mL 补充有 10% FBS 和 1% P/S 的新鲜 DMEM 中来制备染色培养基，以获得 1 μM 的终浓度。用这种染色溶液替换旧培养基。
2. 按照Life^{Technologies 27}分子探针使用指南中规定的推荐孵育时间（30分钟至2小时），在37°C下与5%CO₂孵育2小时。在我们的实验中，在HT-29细胞中孵育2小时，结果与葡聚糖珠具有很强的共定位性，表明染料荧光稳定。
   注意：在活细胞成像前 30 分钟打开共聚焦显微镜。

4. 共聚焦显微镜设置

1. 按以下顺序打开共聚焦系统组件：PC显微镜;扫描仪电源;激光功率;激光发射;徕卡动力。
2. 打开环境控制：立方体 - 温度控制器;砖 - CO₂ 气体混合器控制器。打开 CO₂ 和 O₂ 供应。
3. 设置气体参数：
   1. 将温度控制器（立方体）设置为 37 °C。
   2. 将气体和湿度控制器（砖块）设置为 5% CO₂ 和 95% 湿度。
4. 如 图 1 所示组装成像室。
5. 设置共聚焦物镜：
   1. 使用 63x/1.40 NA 油浸物镜。
   2. 将激发激光器设置为 488 nm（绿色荧光团）和 555 nm（红色荧光团）。
   3. 对于 488 nm 激光器，选择混合 （HyD） 检测器，对于 555 nm 激光器，选择 PMT 检测器。
      注意：通过在共聚焦软件中使用预定义的门将荧光串扰降至最低，这证实了通道之间没有串扰。

5. 染色后制备（LysoTracker孵育后）

1. 用 2 mL PBS 仔细洗涤细胞 3 次。
2. 加入 2 mL 补充有 10% FBS 和 1% P/S 的新鲜 DMEM。
3. 成像前在物镜上滴一滴浸油。
4. 将培养皿安装在显微镜载物台上。
5. 调整激光强度和背景。
   1. 将激光强度调节至 3%，但不超过 5%。
   2. 在显微镜软件中调整检测器增益以优化信号。
   3. 要最小化背景，请调整对比度条。
6. 获取未处理细胞的基线图像（在添加 T/S/Z 之前），作为对照条件。
7. 将板放回层流罩中，加入 1 mL 补充有 10% FBS 和 1% P/S 的 DMEM，其中含有 100 ng/mL 的 TNF-α （T）、500 nM 的 SMAC 模拟物 （S） 和 100 μM 的 Z-VAD-FMK （Z）。
8. 继续在共聚焦显微镜上成像。
   注意：T/S/Z 有意以高于标准方案的浓度添加。做出这一选择是为了加速 LMP 和细胞死亡，从而在实时成像中更可靠地捕获早期事件。

6. 图像采集设置

1. 在采集软件中，设置参数如下：模式：xyt;格式：512 x 512;速度：400;变焦：3;线平均值：1;线累积：3;框架累积：1;时间间隔：3分钟;持续时间：8小时;启用自动对焦。
2. 单击 “开始” 开始延时采集。

结果

该协议中描述的程序能够使用共聚焦显微镜获取活细胞图像以实时监测LMP。 图1 说明了从细胞电镀到图像采集的实验方案的示意图。在第 0 天，将 5,000 个 HT-29 细胞接种并在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 24 小时。24 小时后（第 1 天），在相同条件下将细胞与荧光素标记的葡聚糖珠 （25 μg/mL） 再孵育 24 小时。这些珠子通过内吞作用和流向溶酶体的运输而内化，在那里它们积累并显示为明亮的点。在第 2 天（实验日），用 pH 敏感的 LysoTracker 染料 （1 μM） 在 37 °C 和 5% CO 2 下处理细胞₂ 小时。LysoTracker 在酸性区室（例如晚期内体和溶酶体）内浓缩并表现出强烈的荧光。成像前30分钟，共聚焦显微镜系统通电并稳定，包括温度，气体和湿度控制器，如协议的步骤4所述。组装成像室，如 图 2 所示。使用了 488 nm（绿色）和 555 nm（红色）激光器。

用LysoTracker孵育后，用PBS仔细洗涤细胞3次，并加入2mL补充有10%FBS和1%P/S的新鲜DMEM。将板转移到显微镜上，在63x/1.40 NA油浸物镜上滴一滴浸油。然后调整激光强度和背景水平以优化成像条件，如步骤5.5中所述。协议的。我们的初始图像证实了溶酶追踪器和荧光素标记葡聚糖的稳定点点的存在，表明溶酶体完整（图3）。在 T/S/Z 之前获取基线图像并用作对照。没有应用车辆。

建立初始成像和显微镜设置后，将板返回层流罩，并添加1 mL DMEM，补充有10%FBS和1% P / S，含有100 ng / mL TNF-α（T），500 nM SMAC模拟物（S）和100 μM Z-VAD-FMK（Z）。使用协议步骤 6 中概述的成像采集参数在共聚焦显微镜上继续成像。如图3、补充电影S1和补充电影S2所示，T/S/Z处理细胞中LysoTracker荧光的逐渐降低是溶酶体变化的早期指标。这种损失之后是荧光素标记的葡聚糖从溶酶体流出到细胞质（点状到弥漫性转移）的同时发生，表明LMP。在8 h时，几乎所有的溶菌跟踪信号都消失了，然而，许多细胞仍然保留带有胞质绿色信号的绿色点，表明溶酶体pH梯度的丧失先于完全LMP和货物释放。

图1：实验方案的示意图。（创建于 BioRender.com）最初，将5,000个细胞接种（0小时）并孵育24小时;之后，加入葡聚糖珠（25μg/mL）并再孵育24小时。在48小时时，加入LysoTracker（1μM）并孵育2小时。用PBS洗涤细胞3次（步骤1），然后加入2mL补充有10%FBS和1%P/S的新鲜DMEM（步骤2）。调整显微镜设置（步骤3），并在采集活细胞图像（步骤5）之前用TNF-α（T），SMAC模拟物（S）和泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMZ（Z）（步骤4）处理细胞。 请点击此处查看此图的大图。

图 2：成像室设置图。 （A） 样品架，（B） 气体培养室，以及 （C） 顶盖。 请点击此处查看此图的大图。

图3：T/S/Z处理前后HT29细胞的代表性图像。 用溶菌追踪器红色和葡聚糖绿珠染色细胞，并用TNF-α（T）、SMAC模拟物（S）和泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMZ（Z）处理。比例尺：10 μm。 请点击此处查看此图的大图。

补充视频 S1：与葡聚糖绿珠一起孵育并用 T/S/Z 处理的 HT29 细胞的延时摄影。 监测细胞超过 6 小时以评估细胞反应。 请点击此处下载此电影。

补充视频 S2：与 LysoTracker red 孵育并用 T/S/Z 处理的 HT29 细胞的延时摄影。 监测细胞超过 6 小时以评估细胞反应。 请点击此处下载此电影。

讨论

该协议表明，LysoTracker和荧光素标记的葡聚糖珠的组合可以同时实时监测溶酶体pH值和货物释放。代表性结果（图3，补充电影S1和补充电影S2）证实，未经处理的细胞对两种标记物都保持稳定的点信号。相反，T/S/Z 处理表明 Lysotracker 强度逐渐丧失，葡聚糖从点向弥漫性胞质分布转变，与 LMP 一致。

该协议中关键的第一步是选择用于图像采集的细胞。我们之前的数据表明，T/S/Z 处理导致大约 80% 的 HT-29 细胞在 24 小时内死亡，其余 20% 存活¹⁹ 小时。由于 LMP 在实验开始时不存在，因此最初根据形态及其对 LysoTracker 和葡聚糖珠的双阳性信号来选择细胞。尽管这种方法无法预测哪些特定细胞将经历LMP，但我们一致观察到，大约60%的监测群体最终在8小时成像期间表现出LMP。另一个挑战源于顺序成像的固有性质。在图像采集过程中，每 3 分钟发生一次细胞 Z 位置的轻微漂移，从而阻止了在整个实验中连续跟踪相同的点信号。此外，细胞响应 T/S/Z 处理迁移并经历形态变化²⁸。因此，不可能在整个成像期间跟踪单个溶酶体的动态。在长期活细胞成像中，光毒性作为细胞死亡介质的潜在贡献是一个重要的考虑因素。长时间的持续兴奋会产生活性氧并损害细胞活力²⁹，可能会干扰真正的坏死反应。为了尽量减少这种影响，我们应用了低激光功率和短曝光时间。此外，施用五倍浓度的 T/S/Z 以加速细胞死亡过程。然而，我们不能完全排除光诱导的应激对观察到的溶酶体变化的贡献。

这种活细胞成像方案的一个重要优势是它能够实时监测溶酶体 pH 值变化和 LMP，捕获终点分析（例如 TEM、流式细胞术和免疫染色）遗漏的动态事件。虽然 TEM 提供了高分辨率的结构洞察力，但它无法捕捉 LMP 的时间进展。替代活细胞方法，如吖啶橙重定位测定³⁰或半乳糖凝集素-点状形成³¹，也是监测溶酶体完整性的宝贵工具，但每种方法在单独使用时都有局限性。吖啶橙测定报告了染料从酸性细胞器到细胞质的重新分布，这受到溶酶体 pH 值变化和膜透化的影响，因此与货物释放没有直接关系。类似地，半乳糖凝集素-点状形成反映了管腔聚糖暴露于细胞质，从而标志着溶酶体膜损伤^31,32，但它不区分部分透化和完全溶酶体破裂。

该协议的核心优势在于结合 LysoTracker 和葡聚糖珠，从而能够同时研究溶酶体酸化和货物泄漏。这为溶酶体功能和结构完整性提供了独特的双重读数。LysoTracker 褪色可作为溶酶体 pH 值变化的指标，而葡聚糖释放则直接报告溶酶体内容物的物理泄漏。通过同时使用这两个标记物，我们显着增强了部分和完全 LMP 的检测。因此，这种活细胞成像策略具有广泛的适用性。研究人员可以将其与其他细胞类型和不同的荧光探针一起使用，以研究各种实验条件下的溶酶体完整性，包括药理学或遗传扰动。这种能力是增进我们对坏死性凋亡机制的理解和确定潜在治疗干预措施的关键。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HT-29 电池	空军交通管制委员会	HTB-38	结肠癌细胞
35毫米玻璃底盘	MatTek公司	P35G-1.5-14-C-GRD
二氧化碳孵化器	PHCBI	MCO-170AICUVL
共焦点显微镜	徕卡	SP8WLL
达克斯顿绿珠	热扑鱼	D1820	右旋糖酐，荧光素，10,000兆瓦，阴离子，赖氨酸可修复
杜尔贝科改良鹰中型（DMEM）	康宁	10-013-CV
胎牛血清（FBS）	Cytiva	SH30910.03
LysoTracker 红色 DND-99	Invitrogen	L7528
油浸式HF	电子显微镜科学	16915-01
青霉素和链霉素（P/S）	西格玛-奥尔德里奇	P4333
磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）	科宁	21-040-CV
Smac 模仿（S）	BV6，ApexBio，目录	B4653	最终浓度，1 mM
《砖块与黑人》;	生命影像服务	13685	气体混合器二氧化碳控制器
魔方	生命影像服务	CBO2A	温度控制室显微镜
肿瘤坏死因子α（TNF-&α; - T）	Peprotech	30001A100UG	最终浓度，20 ng/ml
z-VAD-FMK（Z）	ApexBio	A1902	最终浓度，20 mM