需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

用于胶质纤维酸性蛋白及其疾病相关变异体生化分析的实验方法

1.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/69523

⸱

2025年11月28日

 , 
1Institute of Molecular Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University

本文内容

摘要

本研究概述了对GFAP及其致病突变进行生化表征的实验方法，重点在于中间丝的组装、聚集以及翻译后修饰。通过对高纯度GFAP蛋白的分析，揭示了Alexander病发病机制的相关见解，可能为研究潜在治疗靶点以及理解GFAP突变及相关疾病提供框架。

摘要

胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是一种关键的中间丝蛋白，在维持中枢神经系统星形胶质细胞的结构完整性和功能中起重要作用。GFAP基因的突变是亚历山大病（AxD）的根本病因，该病是一种罕见且常致死的神经退行性疾病，其特征是GFAP水平升高以及GFAP以罗森塔尔纤维的形式积聚。本文概述了一整套用于生化表征GFAP及其致病突变体的实验方法。通过优化表达和先进的纯化技术，我们获得了高产量且高纯度的野生型和突变型GFAP蛋白。采用生化检测方法评估了致病性突变对中间丝组装、溶解性及聚集性的影响。此外，我们还探讨了异常翻译后修饰在GFAP聚集中的作用及其对中间丝特性的影响。本研究加深了我们对GFAP在AxD中作用的理解，并为开发靶向GFAP功能障碍的治疗策略奠定了基础。同时，本文所介绍的方法学为研究GFAP突变的生化后果以及推进GFAP相关疾病的干预措施提供了有价值的工具。

引言

Alexander病（AxD）是一种由编码胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的基因发生显性突变所引起的遗传性疾病1，GFAP属于III型中间丝（IF）蛋白，主要存在于成熟的星形胶质细胞中。AxD的特征包括GFAP表达上调2、反应性星形胶质细胞增生3，以及Rosenthal纤维的积聚，后者是由GFAP及其相关蛋白（如αB-晶状体蛋白4和泛素5）组成的蛋白包涵体。GFAP基因的突变会破坏正常的中间丝组装过程6，导致异常聚集、诱发细胞应激反应7，并通过异常的翻译后修饰（PTMs）——如磷酸化8、氧化9和泛素化10——进一步加剧蛋白稳定性失调。

尽管GFAP在AxD病理过程中起着核心作用，但突变型GFAP如何破坏中间丝组装、促进蛋白聚集并诱导细胞应激的分子机制仍不清楚。这一知识空白阻碍了针对GFAP聚集和毒性的靶向治疗策略的开发。研究GFAP及其与AxD相关变异体的生物化学特性，对于揭示疾病进展的分子机制至关重要。然而，GFAP本身易于聚集的特性及其在疾病相关变异体中异常的组装行为，为实验分析带来了独特的挑战。开展可控的生化研究需要纯化的GFAP蛋白，可通过动物模型或重组表达获得，以探究AxD突变对中间丝组装、蛋白聚集及病理修饰的影响。

本研究中介绍的实验方法相较于其他技术具有多项优势。例如，尽管基于细胞的模型11和免疫组织化学研究12能够为GFAP的表达与定位提供有价值的见解，但由于细胞环境的复杂性，这些方法往往难以精确揭示中间丝组装与聚集的生化机制。相比之下，本文所述的方法（如体外（in vitro）中间丝组装实验、沉降分析以及翻译后修饰（PTM）表征）能够对GFAP及其疾病相关变异体的内在生化特性进行可控研究。这些方法使研究人员能够在简化的体系中解析中间丝的组装与聚集行为，有助于揭示GFAP功能障碍的分子机制。既往研究已证明，此类生化技术在分析中间丝蛋白（如desmin13和角蛋白keratins14）方面具有实用性，进一步印证了其在GFAP研究中的适用性。

此外，本文还提供了相关信息，帮助读者判断所述方法是否适用于其特定的应用场景。对于致力于研究GFAP的生化特性、组装行为或翻译后修饰（PTMs）的研究人员而言，这些技术在探究与疾病相关的变异体及其病理效应方面尤为有用。通过将这些生化方法与其他实验体系（如基于细胞的研究或动物模型）相结合，研究人员能够更全面地理解GFAP在Alexander病（AxD）及其他相关星形细胞病中的功能障碍机制。

本方法的总体目标是介绍针对GFAP及其与Alexander病（AxD）相关变异体的生化分析实验方法，包括蛋白质纯化技术、体外（in vitro）纤维组装实验、沉降分析以及翻译后修饰（PTM）的表征。这些方法为深入理解GFAP在AxD中功能障碍的分子机制提供了关键见解，为治疗策略的开发奠定了基础。此外，这些实验技术的应用将推动我们对AxD中GFAP生物化学特性的认识，并促进中间纤维（IF）研究领域的整体发展。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本研究使用的动物是携带 R237H 基因敲入突变的 AxD 模型大鼠11。所有动物实验均经国立清华大学生命科学与医学学院动物实验管理委员会批准（NTHU IACUC 批准号：109088 和 111060），并遵循《实验动物照护与使用指南》中的相关规定。

1. 从细菌中纯化重组GFAP（图1）

  1. 转化 E. coli 含WT或突变型GFAP cDNA的pET23b载体的BL21(DE3) pLysS菌株。
  2. 在含有100 µg/mL氨苄青霉素和34 µg/mL氯霉素的1 L LB（Luria-Bertani）培养基中，于37 °C培养细菌至OD600约为0.2。
  3. 加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，0.5 M），使其终浓度为 0.5 mM，在 37 °C 诱导 GFAP 表达 4 小时。
  4. 通过离心收集细菌，离心条件为 6,371 xg 4 °C 下孵育 30 分钟。
  5. 在Dounce匀浆器中，用50 mL TEN缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8，5 mM EDTA，150 mM NaCl）并添加0.2 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）裂解细菌。
  6. 以 22,045 x g 离心细菌裂解液g 在4 °C下孵育20分钟，然后用Triton X-100缓冲液（含1% (v/v) Triton X-100的TEN缓冲液）重悬沉淀。
  7. 在相同条件下离心后，用高盐缓冲液（TEN 加 1% (v/v) Triton X-100 和 1.5 M KCl）提取所得沉淀。
  8. 在相同条件下离心后，用TEN缓冲液洗涤沉淀。
  9. 将最终沉淀物溶于10 mL尿素缓冲液（8 M尿素，20 mM Tris-HCl，pH 7.4，5 mM EDTA，0.2 mM PMSF）中，室温下搅拌3小时。
  10. 80,000 × g 离心尿素提取物g 在4 °C条件下，于台式超速离心机中离心20分钟。
  11. 向尿素可溶性组分中加入聚乙烯亚胺（1% (v/v)），使其终浓度为 0.06% (v/v)，冰上孵育 5 分钟。
  12. 在 80,000 x g 条件下离心g 4 °C 下孵育 20 分钟，然后将上清液部分用缓冲液 A（6 M 尿素，20 mM MES，pH 6.0，14.4 mM β-巯基乙醇）进行透析。
  13. 将透析液上样至NGC蛋白纯化系统中预先用缓冲液A平衡的CM-Sepharose离子交换柱。
  14. 使用缓冲液A中0-0.5 M NaCl的线性梯度，在1 mL/min流速下洗脱蛋白质，持续1小时。
  15. 合并含GFAP的组分，并用缓冲液B（6 M尿素，10 mM Tris-HCl（pH 8.0）和1 mM EDTA）透析。
  16. 将透析液上样至预先用缓冲液B平衡的阴离子交换柱。以缓冲液B中0-0.5 M NaCl的线性梯度在1 mL/min流速下洗脱蛋白质，历时1小时。
  17. 通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析柱流份。收集含有纯化GFAP的流份，并于-80 °C保存。
    注意：可通过多次冻融循环促进细菌裂解。聚乙烯亚胺的终浓度不应超过0.06%（v/v），否则会导致蛋白质共同沉淀。操作PMSF和β-巯基乙醇等危险物质时，必须提供明确的安全操作指导和危险废物处理说明。PMSF具有高毒性，可引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。应在通风橱中新鲜配制PMSF溶液，并避免直接接触。β-巯基乙醇应在通风良好的环境中使用，因其会释放强烈且有毒的气体。

2. 体外 组装与沉降实验（图2)

  1. 将纯化的野生型或突变型 GFAP 用含 6 M 尿素的低盐缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8，1 mM EDTA 和 14.4 mM β-巯基乙醇）稀释至 0.3 mg/mL。
  2. 将样品在室温下分别用含 4 M 和 2 M 尿素的低盐缓冲液透析 4 小时。
  3. 将样品在 4 °C 下用不含尿素的低盐缓冲液透析过夜。
  4. 将样品在室温下用组装缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7，50 mM NaCl 和 14.4 mM β-巯基乙醇）透析 12–16 小时。
  5. 将组装混合物转移至含 0.2 mL 组装缓冲液中 0.85 M 蔗糖的蔗糖垫顶部。
  6. 在高速沉降实验中，使用台式微量超速离心机在 20 °C 下以 80,000 ×g 离心 20 分钟。
  7. 通过甲醇/氯仿沉淀法浓缩上清组分中未组装的 GFAP15。将沉淀物重悬于 0.2 mL Laemmli 样品缓冲液（25 mM Tris-HCl（pH 6.8），1%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS），12.5%（v/v）甘油，0.01%（w/v）溴酚蓝和 355 mM β-巯基乙醇）中。
  8. 将沉淀组分中已组装的 GFAP 用 Laemmli 样品缓冲液重悬。
  9. 将上清和沉淀组分均在 10%（w/v）SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶上电泳，并用 10 mL 考马斯亮蓝染色。
  10. 在低速沉降实验中，使用台式离心机在 20 °C 下以 3,000 ×g 离心 5 分钟。
  11. 向上清组分中未聚集的 GFAP 加入 0.2 mL Laemmli 样品缓冲液。
  12. 将沉淀组分中聚集的 GFAP 直接用与上清组分体积成比例的 Laemmli 样品缓冲液重悬。
  13. 通过 10%（w/v）SDS-PAGE 凝胶分析上清和沉淀组分，随后进行考马斯亮蓝染色。
    注意：甲醇和氯仿为有毒溶剂，可能引起严重健康危害。避免皮肤接触和吸入。应在通风橱中谨慎操作，防止泄漏。

3. 负染色法与电子显微镜观察（图2）

  1. 在辉光放电清洗系统中，将覆有Formvar/碳膜的铜网在20 mA条件下进行45秒的辉光放电处理。
  2. 将组装混合物滴加至经辉光放电处理的铜网上，使样品在支撑膜上结合60秒。
  3. 用滤纸边缘轻轻吸去铜网边缘的多余液体。
  4. 用蒸馏水洗涤铜网，然后加入20 µL 1% (w/v) 醋酸铀酰溶液染色60秒。
  5. 去除多余的染色液，让铜网在空气中干燥30秒。
  6. 使用H-7600透射电子显微镜（TEM），在100 kV加速电压下的高分辨率模式下观察铜网。
    注意：在添加蛋白质样品前，于真空蒸发器中对铜网进行辉光放电处理，可改善样品在铜网上的吸附效果。醋酸铀酰是一种具有放射性且高度毒性的化学试剂，常用于电子显微镜的负染色。操作时必须严格遵守安全规程和危险废物处置指南，以最大限度降低对人员和环境的暴露风险。配制醋酸铀酰溶液时，仅可在通风橱内进行，以防止吸入空气中的颗粒或蒸气。

4. 氧化修饰（图3）

  1. 在室温下，将GFAP溶于含6 M尿素的低盐缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8，1 mM EDTA和14.4 mM β-巯基乙醇）中，稀释至0.3 mg/mL，孵育2小时。
  2. 在室温下，用含4 M尿素的低盐缓冲液透析2.5小时。使用磁力搅拌器轻轻搅拌缓冲液，以保持均匀分布并防止浓度梯度形成。
  3. 2.5小时后，将透析膜转移至含2 M尿素的低盐缓冲液中，在室温下继续透析2.5小时，全程保持轻柔搅拌。
  4. 在4 °C下，用不含尿素的低盐缓冲液透析18小时。
  5. 将透析后的样品用10 mM H2O2处理15分钟，随后在室温下用10 mM或100 mM二硫苏糖醇（DTT）再处理15分钟。
  6. 通过标准10%（w/v）SDS-PAGE（不含β-巯基乙醇）分析蛋白样品，并用10 mL考马斯亮蓝染色。
    注意：H2O2为强氧化剂，可引起灼伤，操作时应格外小心。需佩戴个人防护装备，避免接触皮肤和眼睛。DTT可能对皮肤、眼睛和呼吸系统造成刺激。使用DTT和H2O2时，必须遵循适当的安全操作规程，以最大限度降低风险。

5. 从 AxD 大鼠脑中纯化 GFAP（图 4A，B）

  1. 使用Douce匀浆器，以10 mL TEN缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，100 mM NaCl和5 mM EDTA）提取脑组织。
  2. 将脑匀浆在4 °C下以76,000 ×g离心20分钟，然后用10 mL Triton X-100缓冲液（TEN缓冲液中含1% (v/v) Triton X-100）提取所得沉淀。
  3. 在4 °C下以76,000 ×g离心20分钟，然后用10 mL蔗糖缓冲液（0.85 M蔗糖和0.5% (v/v) Triton X-100溶于TEN缓冲液）提取所得沉淀。
  4. 在4 °C下以76,000 ×g离心20分钟，然后用10 mL高盐缓冲液（1.5 M KCl和0.5% (v/v) Triton X-100溶于TEN缓冲液）提取所得沉淀。
  5. 在4 °C下以76,000 ×g离心20分钟，然后用10 mL尿素缓冲液（8 M尿素，10 mM Tris-HCl，pH 7.4，和5 mM EDTA）提取最终沉淀。
  6. 收集上清组分，并在Q柱缓冲液（6 M尿素，10 mM Tris-HCl，pH 8，5 mM EDTA，和14.4 mM β-巯基乙醇）中透析。
  7. 将透析后的样品加载至NGC层析系统中的阴离子交换柱。
  8. 以Q缓冲液中0–0.5 M NaCl的线性梯度、1 mL/min的流速洗脱结合蛋白。
  9. 合并含GFAP的组分，并在S柱缓冲液（6 M尿素，20 mM MES，pH 6，和14.4 mM β-巯基乙醇）中透析。
  10. 将透析后的样品上样至阳离子交换柱，然后以S缓冲液中0–1 M NaCl的线性梯度、1 mL/min的流速洗脱结合蛋白。
  11. 通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析洗脱组分，并收集含有纯化GFAP的组分。

6. 通过免疫印迹分析GFAP的泛素化（图4C）

  1. 在10%（w/v）SDS-PAGE凝胶上电泳纯化的GFAP。
  2. 将蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜上。
  3. 用含有0.1%（v/v）Tween 20的10 mL 3%（w/v）牛血清白蛋白TBS溶液（TBS：20 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl）在室温下孵育膜1小时以进行封闭。
  4. 将膜与5 µL抗GFAP抗体和5 µL抗泛素一抗溶于5 mL TBST中，于4 °C孵育过夜。用TBST洗涤膜三次。
  5. 将膜与5 µL 荧光染料标记的二抗（用5 mL TBST稀释）在室温下孵育至少1小时。用TBST洗涤膜三次。
  6. 使用荧光图像检测系统采集图像。
  7. 分析 体外 通过透射电子显微镜和沉降实验组装天然GFAP图5）采用与步骤2.1至2.13以及步骤3.1至3.6中所述相同的方法进行。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

为了研究导致 Alexander 病的突变如何影响 GFAP 的组装特性，我们使用基于 PET 表达系统的细菌系统表达重组蛋白。本文详细描述了 GFAP 蛋白的表达与纯化方案，并以野生型 GFAP 为例进行说明。在 IPTG 诱导后（图 1A，第 2 泳道），GFAP 通过三步纯化流程进行纯化，包括包涵体的制备（图 1B）以及使用 CM 柱（图 1C，第 1 泳道）和 Q 柱（图 1C，第 2 和第 3 泳道）进行的离子交换层析。

通过透析法在体外组装纯化的重组GFAP，并采用醋酸铀负染色后结合电子显微镜进行观察。野生型GFAP形成典型的10 nm中间丝（图2A），而R239H突变型GFAP则倾向于发生聚集（图2B）。低速离心实...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本方案建立了一个全面的实验框架，用于对GFAP及其疾病相关突变体进行生物化学表征。通过提供一种可靠且标准化的方法，该技术为深入理解GFAP的生物学功能及其病理学意义提供了重要资源，尤其在Alexander病（AxD）的研究背景下具有重要意义。在本节中，我们将讨论该方案的若干关键方面，包括可能的改进方法与故障排除策略、本方法的局限性、相较于现有技术的优势，以及其在特定研究领域中的广泛重要性与应用价值。

本研究建立了重组野生型GFAP及其疾病相关突变体纯化的标准化方案（图1），为后续的体外分析提供了便利。该详细方案可作为中间丝（IF）研究领域的重要参考，确保以高产量和高纯度可靠地制备GFAP蛋白。值得注意的是，该方案具有两个显著的实用优势：操作简便且易于放大。为确保GFAP纯化的可靠性与可重复性，以下几个关键步骤至关重要。首先，提取与纯化过程所使用的缓冲液经过专门优化，以维持GFAP的溶解性与稳定性，从而防止其沉淀并保持功能活性。例如，当缓冲液pH接近GFAP的等电点（约5.2）时，其溶解度降低，易发生沉淀。...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Tracy Hagemann 博士（美国威斯康星大学麦迪逊分校 Waisman 中心）提供了 R237H 基因敲入大鼠。衷心感谢 Albee Messing 教授（美国威斯康星大学麦迪逊分校 Waisman 中心）在本研究中提出的建议与支持。本研究得到了科技部资助（项目编号：111-2320-B-007-008 和 112-2320-B-007-006，授予 N.-H. L. 和 M.-D. P.）。我们同时感谢中国台湾国立清华大学生物电子显微镜中心（MOST-104-2731-M-007-002）提供本研究所用设备。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 37.5:1伯乐（Bio-Rad）1610158
过硫酸铵（APS）伯乐（Bio-Rad）1610700
氨苄青霉素usb11259
抗GFAP抗体细胞信号技术公司12389
抗泛素抗体MilliporeST 1200克隆 FK2
Avanti J-26S XP 离心机贝克曼
氯霉素usb23660
CM-SepharoseCytiva1707 1901
考马斯亮蓝染料usb32826
铜网Ted Pella01753-F
CS 150 NX 微型超速离心机日立NA
邓氏匀浆器Wheaton
DTT尿液DTT
大肠杆菌 BL21(DE3) pLysS 菌株安捷伦
EasiGlowTed Pella
ECL试剂PerkinElmerNEL 105001
EDTAusb15699
H2O2Sigma-Aldrich18312
HiRes S 柱Cytiva2927 5877
HiTrap Q 柱Cytiva1711 5301
IPTGURIPTG
KCl霍尼韦尔12636
LB培养基（LB琼脂）usb75851
LB培养基（LB肉汤）BD Difco244620
巯基乙醇Sigma-AldrichM3148
MESSigma-AldrichM8250
NaCl霍尼韦尔31434S
NGC色谱系统伯乐（BioRad）
Optima XE-90 超速离心机贝克曼
PMSFACROS ORGANICS215740050
聚乙烯亚胺Sigma-AldrichP3143
转子贝克曼
S55S 转子日立
S80AT3 转子日立
SDSusb75819
SDS-PAGE伯乐（Bio-Rad）
StarBright Blue 520 山羊抗小鼠 IgG 伯乐（Bio-Rad）12005867
StarBright Blue 700 山羊抗兔 IgG 伯乐（BioRad）12004161
蔗糖Sigma-AldrichS5391
TEMEDusb76320
透射电子显微镜 H-7700日立NA
Trisusb75825
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
醋酸铀酰电子显微镜科学 22400
尿素霍尼韦尔15604H

参考文献

  1. Brenner, M., et al. Mutations in GFAP, encoding glial fibrillary acidic protein, are associated with Alexander disease. Nat Genet. 27 (1), 117-120 (2001).
  2. Hagemann, T. L., et al. Gene expression analysis in mice with elevated glial fibrillary acidic protein and Rosenthal fibers reveals a stress response followed by glial activation and neuronal dysfunction. Hum Mol Genet. 14 (16), 2443-2458 (2005).
  3. Hagemann, T. L. Alexander disease: models, mechanisms, and medicine. Curr Opin Neurobiol. 72, 140-147 (2022).
  4. Iwaki, T., et al. Alpha B-crystallin and 27-kd heat shock protein are regulated by stress conditions in the central nervous system and accumulate in Rosenthal fibers. Am J Pathol. 143 (2), 487-495 (1993).
  5. Goldman, J. E., Corbin, E. Rosenthal fibers contain ubiquitinated alpha B-crystallin. Am J Pathol. 139 (4), 933-938 (1991).
  6. Yang, A. W., Lin, N. H., Yeh, T. H., Snider, N., Perng, M. D. Effects of Alexander disease-associated mutations on the assembly and organization of GFAP intermediate filaments. Mol Biol Cell. 33 (8), ar69(2022).
  7. Chen, Y. S., Lim, S. C., Chen, M. H., Quinlan, R. A., Perng, M. D. Alexander disease-causing mutations in the C-terminal domain of GFAP are deleterious both to assembly and network formation with the potential to both activate caspase 3 and decrease cell viability. Exp Cell Res. 317 (16), 2252-2266 (2011).
  8. Battaglia, R. A., et al. Site-specific phosphorylation and caspase cleavage of GFAP are new markers of Alexander disease severity. Elife. 8, e47789(2019).
  9. Viedma-Poyatos, A., Gonzalez-Jimenez, P., Pajares, M. A., Perez-Sala, D. Alexander disease GFAP R239C mutant shows increased susceptibility to lipoxidation and elicits mitochondrial dysfunction and oxidative stress. Redox Biol. 55, 102415(2022).
  10. Lin, N. H., Jian, W. S., Snider, N., Perng, M. D. Glial fibrillary acidic protein is pathologically modified in Alexander disease. J Biol Chem. 300 (7), 107402(2024).
  11. Kondo, T., et al. Modeling Alexander disease with patient iPSCs reveals cellular and molecular pathology of astrocytes. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 69(2016).
  12. Hagemann, T. L., et al. Antisense therapy in a rat model of Alexander disease reverses GFAP pathology, white matter deficits, and motor impairment. Sci Transl Med. 13 (620), eabg4711(2021).
  13. Bar, H., et al. Severe muscle disease-causing desmin mutations interfere with in vitro filament assembly at distinct stages. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15099-15104 (2005).
  14. Gu, L. H., Coulombe, P. A. Defining the properties of the nonhelical tail domain in type II keratin 5: insight from a bullous disease-causing mutation. Mol Biol Cell. 16 (3), 1427-1438 (2005).
  15. Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal Biochem. 138 (1), 141-143 (1984).
  16. Ralton, J. E., Lu, X., Hutcheson, A. M., Quinlan, R. A. Identification of two N-terminal non-alpha-helical domain motifs important in the assembly of glial fibrillary acidic protein. J Cell Sci. 107 (Pt 7), 1935-1948 (1994).
  17. Nagai, K., Thogersen, H. C. Synthesis and sequence-specific proteolysis of hybrid proteins produced in Escherichia coli. Methods Enzymol. 153, 461-481 (1987).
  18. Vorgias, C. E., Traub, P. Isolation of glial fibrillary acidic protein from bovine brain white matter and its purification by affinity chromatography on single-stranded DNA-cellulose. Biochem Biophys Res Commun. 115 (1), 68-75 (1983).
  19. Vorgias, C. E., Traub, P. Nucleic acid-binding activities of the intermediate filament subunit proteins desmin and glial fibrillary acidic protein. Z Naturforsch C J Biosci. 41 (9-10), 897-909 (1986).
  20. Lin, N. H., Jian, W. S., Perng, M. D. Deletions in glial fibrillary acidic protein leading to alterations in intermediate filament assembly and network formation. Int J Mol Sci. 26 (5), 1913(2025).
  21. Herrmann, H., Kreplak, L., Aebi, U. Isolation, characterization, and in vitro assembly of intermediate filaments. Methods Cell Biol. 78, 3-24 (2004).
  22. Kim, B., Kim, S., Jin, M. S. Crystal structure of the human glial fibrillary acidic protein 1B domain. Biochem Biophys Res Commun. 506, 2899-2905 (2018).
  23. Lin, N. H., Messing, A., Perng, M. D. Characterization of a panel of monoclonal antibodies recognizing specific epitopes on GFAP. PLoS One. 12 (7), e0180694(2017).
  24. Eliasson, C., et al. Intermediate filament protein partnership in astrocytes. J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).
  25. Jing, R., et al. Synemin is expressed in reactive astrocytes in neurotrauma and interacts differentially with vimentin and GFAP intermediate filament networks. J Cell Sci. 120 (Pt 7), 1267-1277 (2007).
  26. Thomsen, R., Pallesen, J., Daugaard, T. F., Borglum, A. D., Nielsen, A. L. Genome-wide assessment of mRNA in astrocyte protrusions by direct RNA sequencing reveals mRNA localization for the intermediate filament protein nestin. Glia. 61 (11), 1922-1937 (2013).
  27. Perng, M. D., et al. Intermediate filament interactions can be altered by HSP27 and alphaB-crystallin. J Cell Sci. 112 (Pt 13), 2099-2112 (1999).
  28. Tian, R., Gregor, M., Wiche, G., Goldman, J. E. Plectin regulates the organization of glial fibrillary acidic protein in Alexander disease. Am J Pathol. 168 (3), 888-897 (2006).
  29. Lin, N. H., Yang, A. W., Chang, C. H., Perng, M. D. Elevated GFAP isoform expression promotes protein aggregation and compromises astrocyte function. FASEB J. 35 (5), e21614(2021).
  30. Hagemann, T. L., Connor, J. X., Messing, A. Alexander disease-associated GFAP mutations in mice induce Rosenthal fiber formation and a white matter stress response. J Neurosci. 26 (43), 11162-11173 (2006).
  31. Eng, L. F. The glial fibrillary acidic protein: the major protein constituent of glial filaments. Scand J Immunol Suppl. 9, 41-51 (1982).
  32. Yen, S. H., Dahl, D., Schachner, M., Shelanski, M. L. Biochemistry of the filaments of brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (2), 529-533 (1976).
  33. Goldman, J. E., Schaumburg, H. H., Norton, W. T. Isolation and characterization of glial filaments from human brain. J Cell Biol. 78 (2), 426-440 (1978).
  34. Tsukita, S., Ishikawa, H., Kurokawa, M. Isolation of 10-nm filaments from astrocytes in the mouse optic nerve. J Cell Biol. 88 (1), 245-250 (1981).
  35. Rasmussen, S., Sensenbrenner, M., Devilliers, G., Schousboe, A., Bock, E. Isolation of intermediate filaments from rat astrocytes in culture. Neurosci Lett. 25 (2), 119-124 (1981).
  36. Yang, Z. W., Babitch, J. A. Factors modulating filament formation by bovine glial fibrillary acidic protein, the intermediate filament component of astroglial cells. Biochemistry. 27 (18), 7038-7045 (1988).
  37. Liem, R. K., Hutchison, S. B. Purification of individual components of the neurofilament triplet: filament assembly from the 70 000-dalton subunit. Biochemistry. 21 (13), 3221-3226 (1982).
  38. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal and gliosed human brain: demonstration of multiple related polypeptides. Biochim Biophys Acta. 386 (1), 41-51 (1975).
  39. Fukuyama, R., Fushiki, S., Fujita, S. Purification of glial fibrillary acidic protein (GFAP) from normal bovine brain. J Neurosci Methods. 40 (2-3), 133-137 (1991).
  40. Dahl, D., Crosby, C. J., Gardner, E. E., Bignami, A. Purification of the glial fibrillary acidic protein by anion-exchange chromatography. Anal Biochem. 126 (1), 165-169 (1982).
  41. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain: purification and properties. Brain Res. 57 (2), 343-360 (1973).
  42. Perng, M., et al. The Alexander disease-causing glial fibrillary acidic protein mutant, R416W, accumulates into Rosenthal fibers by a pathway that involves filament aggregation and the association of alpha B-crystallin and HSP27. Am J Hum Genet. 79 (2), 197-213 (2006).
  43. Hsiao, V. C., et al. Alexander-disease mutation of GFAP causes filament disorganization and decreased solubility of GFAP. J Cell Sci. 118 (Pt 9), 2057-2065 (2005).
  44. Rueger, D. C., Dahl, D., Bignami, A. Purification of a brain-specific astroglial protein by immunoaffinity chromatography. Anal Biochem. 89 (2), 360-371 (1978).
  45. Bignami, A., Dahl, D. Isolation of GFA protein from normal brain-a comment. J Histochem Cytochem. 27 (2), 693-696 (1979).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

GFAP Alexander SDS PAGE
用于胶质纤维酸性蛋白及其疾病相关变异体生化分析的实验方法
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。