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方法文章

益脑解郁方对大脑中动脉阻塞联合行为束缚诱导的大鼠卒中后抑郁的影响

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DOI：

10.3791/69537

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2026年1月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, 2Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, 3Capital Medical University Yanjing College, 4School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 5Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University

本文内容

摘要

本方案描述了通过结合大脑中动脉闭塞（MCAO）与慢性轻度应激、行为束缚及隔离饲养，建立卒中后抑郁（PSD）大鼠模型的方法，并利用行为学测试评估益脑解郁方（YNJYP）的治疗效果。

摘要

卒中后抑郁（PSD）是卒中后一种常见且可治疗的并发症，其特征为抑郁和躯体症状，会损害患者的康复进程和生活质量。本研究描述了一种结合大脑中动脉闭塞（MCAO）与行为束缚及隔离饲养的方法，用于建立大鼠PSD模型，并评估益脑解郁方（YNJYP）对PSD大鼠成体神经发生的治疗作用。在模型建立过程中，卒中组、PSD组、盐酸氟西汀（FXT）组和YNJYP组大鼠均接受MCAO手术：将单丝缝合线从颈内动脉推进至大脑中动脉（MCA），阻断血流2小时以造成缺血，随后进行再灌注。自MCAO术后第7天起，PSD组、FXT组和YNJYP组大鼠被单独饲养，并在特制的T型平台上每日束缚2小时，持续7天。行为学评估包括强迫游泳实验（FST，评估绝望行为）、蔗糖消耗实验（SCT，评估快感缺失）和开放旷场实验（OFT，评估探索行为）。卒中后4周和8周，PSD大鼠在FST中的不动时间显著长于卒中组大鼠，在SCT中的蔗糖偏好率也显著降低（P < 0.01）。YNJYP可逆转这些类抑郁行为（P < 0.01），其疗效与FXT相当。该方案通过严谨的实验设计和数据分析，验证了PSD模型的有效性以及YNJYP的治疗潜力。

引言

卒中后抑郁（PSD）是卒中后常见且可治疗的并发症，显著影响患者的康复过程和生活质量。PSD患者不仅存在躯体功能障碍，还面临情绪低落、兴趣减退等心理困扰，严重阻碍神经功能的恢复，甚至增加死亡率。目前，PSD的发病机制复杂，涉及神经生物学、神经递质失衡和炎症反应等多个方面，迫切需要深入探索有效的干预方法。

本方法的总体目标是建立一种可靠且可重复的卒中后抑郁（PSD）大鼠模型，通过结合大脑中动脉闭塞（MCAO）、慢性轻度应激（CMS，主要是行为束缚）以及隔离饲养，以密切模拟人类疾病状态，并利用该模型评估潜在治疗药物，如益脑解郁方（YNJYP）。开发该技术的依据在于需要将初始缺血性损伤和随后的慢性心理应激——这两个已被公认是PSD发病机制中的关键因素——整合到一个标准化的模型中1,2,3。与替代方法（例如仅依赖广泛的CUMS范式）相比，本方案采用一种特定的行为束缚方式，旨在模拟卒中患者常经历的活动受限，从而提供一种更聚焦且可重复性更高的建模方法3,4,5。

该模型通过提供一种在啮齿类动物中诱导和评估卒中后抑郁（PSD）的详细且实用的框架，为现有的PSD文献做出了贡献，满足了临床前研究中对标准化方法的需求。对于希望研究脑缺血与卒中后应激共同导致的病理生理效应，或筛选针对PSD新型干预措施的研究人员而言，本方案具有适用性，因其明确了模型构建、应激施加及行为学评估的具体操作步骤。

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方案

动物研究方案已获得北京中医药大学动物护理与使用委员会的批准。所使用的试剂和设备列于材料表中。

1. 准备

  1. 取216只体重为300–320 g的雄性SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠。
  2. 实验前将大鼠在饲养环境中适应1周。
    1. 饲养环境条件维持在23 ± 3 °C，相对湿度45% ± 5%，光照周期为12 h明/12 h暗（光照时间：上午8:00至晚上8:00）。
    2. 每笼饲养5只大鼠，自由摄取无菌标准饲料和水。
      注：通过轻柔操作和优化实验流程（例如使用可调节的固定装置以防止呼吸抑制），尽量减少实验动物使用数量并减轻其痛苦。

2. 大脑中动脉闭塞（MCAO）手术

注意：此步骤描述了大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型的建立，该方法经 Bederson 等人6改良。

  1. 为手术准备大鼠。
    1. 手术前禁食大鼠过夜（12 小时）（不禁水）。
      注意：所有手术操作均采用无菌技术进行：手术器械在使用前经高压灭菌，操作者佩戴无菌手套，手术区域覆盖无菌洞巾。
    2. 通过腹腔注射 1% 戊巴比妥钠（50 mg/kg）对大鼠实施麻醉。通过脚趾夹捏反射和呼吸频率监测确认麻醉深度。手术期间将 大鼠置于加热垫上（37 ± 0.5 °C），直至完全恢复，以维持体温。手术过程中，向大鼠双眼涂抹红霉素眼膏或人工泪液，防止角膜干燥。
      注意：本研究中未使用术前或术后镇痛药物，因为非甾体抗炎药（NSAIDs）和阿片类药物可能干扰缺血后炎症反应和梗死体积的评估8。
      警告：戊巴比妥钠为管制类麻醉药品。应在通风橱中操作，佩戴手套和护目镜，并根据机构规定存放在上锁的柜子中。
  2. 固定并准备手术区域。
    1. 将麻醉后的大鼠置于仰卧位并固定四肢。手术期间将大鼠放在加热垫上（37 ± 0.5 °C），并持续监测体温。
    2. 剃除颈部毛发。从切口部位开始，以同心圆方式涂抹聚维酮碘溶液进行皮肤消毒，随后以相同由内向外的环形方式使用 75% 乙醇消毒，重复此过程共 3 次。用无菌洞巾覆盖手术区域（每只大鼠更换新的洞巾）。
  3. 暴露并准备颈部血管。
    1. 在颈部正中做一 2–3 cm 的皮肤切口，钝性分离皮下腺体和筋膜。分离出颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA），其中 ICA 和 ECA 为 CCA 的分支。
    2. 找到 CCA，在其下方放置两根缝线作为备用；将其中一根在靠近心脏端结扎，另一根在 CCA 分叉处附近打活结。
    3. 使用动脉夹夹闭 CCA 远端靠近分叉处的位置。
    4. 找到 ECA 并用缝线结扎。
  4. 插入缝线以闭塞大脑中动脉（MCA）。
    1. 在 CCA 近端结扎部位与动脉夹夹闭部位之间的血管壁上小心切开一个小口，然后将特制的单丝线栓（单股缝线）从此切口插入。
    2. 打开动脉夹，将线栓从分叉处沿 ICA 向前推进，直至感到轻微阻力后停止（图 1）。
      注意：线栓长度（18 mm ± 2 mm）对实现稳定的大脑中动脉闭塞至关重要；可根据大鼠体重（300–320 g）略作调整。
  5. 诱导缺血与再灌注。
    1. 维持缺血状态 2 小时（严格使用秒表计时）。
    2. 2 小时后，轻柔地抽出线栓以恢复 MCA 血流，剪除多余线栓，并移除动脉夹。
  6. 关闭手术切口并监测恢复情况。
    1. 用无菌生理盐水冲洗切口，然后缝合皮下组织和皮肤。
    2. 将大鼠置于恢复笼中（温度维持在 25 ± 1 °C），直至意识恢复；术后 24 小时内密切观察是否有出血或痛苦表现。<
      注意：出于本研究的科学目的，术后未给予全身性镇痛药物（理由见步骤 2.1.2 的注释）。然而，动物在恢复期间接受了温度支持（25 ± 1 °C），并每 30 分钟 观察一次疼痛迹象。未观察到明显的疼痛行为。
  7. 建立假手术对照组。
    1. 按照步骤 2.1–2.3 的方法进行相同的颈部解剖和血管暴露。
    2. 将缝线插入 CCA 仅 5 mm 深度，随即立即拔出；在不闭塞 MCA 的情况下缝合切口。

3. 动物分组

  1. 将大鼠随机分为六组（每组最初 n = 36），用于神经功能评分。
    1. 脑卒中组：仅进行MCAO，无行为束缚或药物治疗。
    2. PSD组：MCAO + 行为束缚 + 隔离饲养，无药物治疗。
    3. FXT组：MCAO + 行为束缚 + 隔离饲养 + 盐酸氟西汀灌胃。
    4. YNJYP组：MCAO + 行为束缚 + 隔离饲养 + 益脑解郁方（YNJYP）灌胃。
    5. 空白组：未进行任何手术操作。
    6. 假手术组：不阻塞大脑中动脉。
  2. 排除术后评分为0或4分或死亡的大鼠。
    1. MCAO术后24小时进行Longa7神经功能评分，以筛选合格大鼠。
    2. 采用5分制Longa评分标准：0分 = 无神经功能缺损；1分 = 尾部提起时前肢屈曲；2分 = 向偏瘫侧做环形行走；3分 = 向偏瘫侧倾倒；4分 = 昏迷或无法行走。

4. 盐酸氟西汀（FXT）和 YNJYP 的给药

  1. 制备 YNJYP 和 FXT。
    注意：YNJYP 包含六种中药材：刺五加（刺五加 根）30 g，郁金（姜黄 根茎）10 g，五味子（五味子 果实）15 g，栀子（栀子花 果实）10 g，丹参（丹参 根）15 g，川芎（川芎 根茎）15 g（由北京中医药大学第三附属医院药剂科提供）。根据既往研究8经口灌胃给药剂量确定为9.92 g/(kg·d)。
    1. 将盐酸氟西汀胶囊溶于蒸馏水中，使用时配制成浓度为 0.233 g/L 的溶液。根据成人剂量乘以 7 换算，大鼠给药剂量设定为 2.33 mg/(kg·d)。
  2. 给药 通过 灌胃
    1. 从MCAO术后第1天开始灌胃，并持续至实验结束，所有组均在早晨统一进行操作。
    2. 对FXT组给予FXT 2.33 mg/(kg·d)，对YNJYP组给予YNJYP 9.92 g/(kg·d)，对脑卒中组和PSD组给予0.9%生理盐水（10 mL/kg）。
      注意：使用1 mL灌胃针；确保针头插入胃中（而非气管），以避免吸入性风险。

5. 慢性轻度应激（行为束缚）联合隔离饲养

  1. 在MCAO术后第7天开始行为限制和隔离饲养（以避免急性卒中阶段）。
  2. 准备定制的T形限制平台。
    1. 该平台由一个底座（20 cm × 10 cm × 2.8 cm）和一个限制区域（22 cm × 6.6 cm）组成。
    2. 限制区域设有用于固定大鼠头部和四肢的槽孔，以及三条可调节的绑带，以适应不同体型的大鼠（图2、图3 和 图4）。
      注：该平台在Chen3 和 Tian4 的基础上改进，增加了前肢固定槽，以模拟卒中患者的偏瘫姿势。
  3. 进行每日限制操作。
    1. 每天随机选择一个2小时的时间段（例如上午9:00–11:00或下午2:00–4:00），以避免昼夜节律偏差。
    2. 使用平台上的槽孔和绑带将每只大鼠固定；调整绑带松紧度，以防止挣扎但不引起呼吸抑制。
    3. 连续7天，每天持续限制2小时。
  4. 将大鼠进行隔离饲养。
    1. 在行为限制开始时，将PSD组、FXT组和YNJYP组的大鼠从群养（每笼5只）转移至单笼饲养。
    2. 持续单笼饲养，直至行为限制结束（MCAO术后第14天）。

6. 蔗糖消耗实验（SCT）

注意：在 MCAO 术后 2、4 和 8 周时，从每组中随机选取六只大鼠。所有大鼠均按 SCT、OFT 和 FST 的顺序进行测试。

  1. 准备实验大鼠。
    1. 实验前 24 小时对大鼠进行禁食和禁水处理。
    2. 确保测试房间的温度（23 ± 2 °C）和光照条件与饲养环境一致。
  2. 进行实验。
    1. 在每个笼子中放置两个瓶子（每个 150 mL）：一个装自来水，另一个装 1% 蔗糖溶液。
    2. 自由饮水 1 小时后，记录消耗的蔗糖溶液和水的体积。
  3. 计算蔗糖偏好程度。
    1. 使用公式：蔗糖偏好 (%) = (消耗的蔗糖溶液体积 / 消耗的总体积) × 100%。
    2. 在饮水期间中途交换两个瓶子的位置，以消除位置偏好带来的偏差。

7. 旷场实验（OFT）

注意：从强迫游泳实验（FST）在2、4和8周时使用的各组大鼠中选择同一批次的大鼠。测试前禁食并禁水24小时，以保持一致的生理条件。

  1. 准备旷场实验装置。
    1. 使用一个黑色方形箱体，底部均分为25个相等的方格。
    2. 保持测试房间安静且光线昏暗。
  2. 进行实验。
    1. 将每只大鼠放置于箱体中央的方格中，并启动5 min计时器。
    2. 记录水平活动（四肢有四分之三进入新方格的方格穿越次数）和垂直活动（四肢有二分之一离地的直立次数），通过手持计数器进行人工观察记录。
    3. 记录在中央方格区域停留的时间以及理毛频率（可选，用于进一步的行为学分析）。

8. 强迫游泳实验（FST）

注意：从强迫游泳实验（FST）在2、4和8周时使用的各组大鼠中选择同一批次的大鼠。测试前禁食并禁水24小时，以保持一致的生理状态。

  1. 准备测试装置。
    1. 将适量的水倒入玻璃圆筒中，确保水位足够高，使大鼠无法用脚接触底部以支撑身体。
    2. 调节水温至 25 ± 1 °C。
  2. 进行测试。
    1. 将每只大鼠放入圆筒中，使其游泳 5 分钟。
    2. 记录 5 分钟内的总静止时间。
    3. 将“静止”定义为被动漂浮（仅进行最小程度的动作以保持鼻部露出水面），将“活动”定义为肢体划水或抓挠筒壁。
  3. 测试后大鼠护理。
    1. 5 分钟后将大鼠从圆筒中取出，用毛巾擦干，并置于加热灯下（30 ± 2 °C）30 分钟，以防止低体温（图 5）。

9. 统计分析

  1. 将数据整理为均值 ± 标准差（mean ± SD）的形式。
  2. 使用 SPSS 20.0 版本软件进行数据分析。
  3. 在进行参数检验前，需对数据进行正态性检验（采用 Shapiro-Wilk 检验）和方差齐性检验（采用 Levene 检验）。各组数据均符合正态分布，并满足方差齐性。
    1. 组间样本均值比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），结合最小显著差异法（LSD）和 Student-Newman-Keuls（SNK）检验；当方差不齐时，采用 Welch 检验。
  4. 统计学显著性水平设定为 p < 0.05。

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结果

本研究共设置了5个实验组进行相关检测。经对各组大鼠行为学数据进行统计分析发现，在实验第4周时，PSD组大鼠在强迫游泳实验（FST）中的不动时间显著长于脑卒中组大鼠，两组间差异具有统计学意义（P < 0.01）；同时，PSD组大鼠在糖水偏好实验（SCT）中的糖水偏好率显著低于脑卒中组大鼠，两组在实验第4周和第8周的差异均具有统计学意义（P < 0.01）。根据上述行为学指标的变化，可判定本研究中PSD大鼠模型构建成功（具体数据分析见图6）。

在对卒中后抑郁（PSD）大鼠进行 YNJYP 干预后，行为学测试结果表明，该化合物对大鼠的抑郁样行为具有显著改善作用。具体而言，在实验的第4周和第8周，YNJYP 能够缩短 PSD 大鼠在强迫游泳试验（FST）中的不动时间，经统计学检验，干预组大鼠与未干预 PSD 大鼠之间的差异具有统计学显著性（P < 0.01）；此外，YNJYP 还能够提高 PSD 大鼠在蔗糖偏好试验（SCT）中的蔗糖偏好率，在实验的第4周和第8周，干预组与未干预 PSD 大鼠之间的差异同样具有统计...

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讨论

在构建大鼠脑缺血模型的过程中，存在多种不同的建模方法，包括结扎法、开颅法、窒息法和线栓法。与结扎法、开颅法和窒息法这三种建模方法相比，线栓法表现出显著且独特的优势。这些优势主要体现在三个关键方面：手术的微创性、时空控制的精确性以及模型的可靠性1,2,3。

首先，从手术的侵入性角度来看，线栓法与其他方法存在显著差异。采用线栓法建立大鼠脑缺血模型时，无需对大鼠进行开颅手术，也无需广泛的血管分离和结扎操作。具体操作方法仅为在大鼠颈部做一个小切口，随后将线栓经颈动脉系统插入，以实现目标血管的阻塞。该手术方式显著减少了手术本身对大鼠造成的身体创伤，同时也显著降低了术后感染的风险。相比之下，开颅法在操作过程中容易导致大鼠脑脊液漏出，术后感染的概率也相对较高。

其次，在应用线栓法时，其在时间控制方面的优势是其他方法无法比拟的，并具有不可替代的精确性。该方法...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

YuanKai Su 和 YongHao Sun 撰写了论文，包括结果解释和讨论部分。HuiLing Tian 进行了实验并分析了数据。Ning Ding 和 Xin Wang 对论文进行了审阅。ZiTong Yang 和 JingYao Zhao 在数据检索方面做出了贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠北京维通利华实验动物技术有限公司编号 SCXK2012-0001300–320 g
盐酸氟西汀胶囊法国Patheon公司，中国江苏0943A
淫羊藿-牛膝-骨碎补颗粒（YNJYP）北京中医药大学第三附属医院药剂科自制
旷场实验用敞箱自制 -
戊基巴比妥钠美国Sigma公司P3761-5
结扎线北京沙东生物技术有限公司2838-A4
强迫游泳实验用水箱自制 -

参考文献

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