本方案利用激光显微切割技术，成功从胶质瘤样本中制备出足量高质量的新生血管组织，用于肿瘤血管生成的定量蛋白质组学分析，克服了传统研究主要集中于血管生成因子的局限性，提供了胶质瘤血管生成的大规模蛋白质组学图谱。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
胶质瘤是中枢神经系统中发病率和死亡率均较高的原发性恶性肿瘤。肿瘤血管生成是胶质瘤病理生理学的标志性特征，也是肿瘤微环境中的重要事件。肿瘤新生血管结构异常，具有双重作用：既为肿瘤提供营养供应，又作为转移门户，使肿瘤细胞侵入血液循环。抗血管生成治疗是癌症研究领域的热点。以往大多数研究集中于肿瘤血管生成的激活因子与抑制因子，但这仅在有限范围内阐明了肿瘤血管生成机制。异常的蛋白表达或翻译后修饰导致胶质瘤中血管形态异常。本实验方案采用激光捕获显微切割技术（LCM），从胶质瘤组织中分离并纯化足量的新生血管组织，用于同位素标记定量蛋白质组学分析，以鉴定胶质瘤新生血管组织与对照组之间差异表达的蛋白质。这些数据为阐明肿瘤血管生成的病理机制、发现抗血管生成治疗靶点以及构建基于肿瘤血管生成的生物标志物提供了重要的科学依据。
引言
胶质瘤是一类高度异质性的中枢神经系统（CNS）肿瘤，起源于为神经元提供结构和代谢支持的胶质细胞1，组织学上可分为星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤和室管膜瘤等亚型2。根据世界卫生组织（WHO）分级系统，胶质瘤Ⅰ级和Ⅱ级属于低级别胶质瘤（LGG），通常表现为生长缓慢、具有潜在的长期稳定性，且根据解剖位置的不同，常可进行手术切除。相比之下，Ⅲ级和Ⅳ级属于高级别胶质瘤（HGG），以未分化、恶性程度高为特征，具有高度侵袭性行为和不良预后3。目前的治疗手段仍然有限且疗效不佳；尽管最大程度的安全切除联合术后放疗/化疗可在一定程度上改善预后，但由于肿瘤呈弥漫性浸润性生长且边界不清，难以实现根治性切除，因此仍存在显著的治疗局限性和毒性反应4,5。人类胶质瘤，尤其是高级别胶质瘤，是高度血管化的恶性肿瘤，其生长、增殖和侵袭过程高度依赖于异常的新生血管形成，这是胶质瘤恶性表型的关键特征之一6,7。靶向肿瘤血管生成的研究在实现治疗突破方面具有重要的科学意义。
血管生成本质上涉及内皮细胞在特定刺激下的增殖、迁移和分化，相关研究主要集中在调控因子上：（i）诱导因子，包括血管内皮生长因子（VEGF）8、血管素（VASN）9、缺氧诱导因子1（HIF1）10、转化生长因子β（TGF-β）11、内皮素（endocan）12、血小板源性生长因子（PDGF）13和表皮生长因子（EGF）14；以及（ii）抑制因子，包括血管抑素（angiostatin）15、内皮抑素（endostatin）16、血小板活化因子受体-1（TSP-1）17和金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）18。在I/II/III期脑肿瘤临床试验中，大多数抗血管生成药物靶向VEGF信号通路，因其在血管生成中起核心作用，例如贝伐珠单抗（bevacizumab）是一种通过阻断VEGF抑制新生血管形成的单克隆抗体19,20,21。然而，近期的II/III期临床试验显示，与单用洛莫司汀相比，接受贝伐珠单抗联合洛莫司汀治疗的晚期胶质母细胞瘤患者并未显示出显著的总体生存获益19,20,21,22。关键的是，抗VEGF治疗虽可改善血管异常，但仅能抑制血管生成，缺乏对肿瘤的直接细胞毒性作用，且可能诱导治疗耐药性。因此，仅靶向单一或少数几个血管生成调控因子难以实现根治；有效的治疗策略需同时抑制血管生成，并阻断肿瘤通过血管途径的侵袭与转移。蛋白质在胶质瘤中的诊断和预后价值已得到充分证实，但数十年来恶性胶质瘤的治疗进展仍然有限。
蛋白质组学可利用基于质谱（MS）的技术，包括自上而下法（TDP）和自下而上法（BUP），对生物样本中的全部蛋白质进行全局分析，涵盖表达谱、翻译后修饰（PTMs）以及蛋白质相互作用。高通量质谱技术单次运行即可鉴定数以万计的蛋白质，因而在研究肿瘤机制及治疗靶点发现中具有重要作用。胶质瘤组织以及血液及其衍生物23,24,25、脑脊液26和尿液27等液体活检样本中的蛋白质丰度及其翻译后修饰均可被鉴定。在肿瘤血管系统中，异常的蛋白质表达和翻译后修饰驱动病理性血管改变。胶质瘤新生血管形成过程中的蛋白质变化可通过蛋白质组学方法加以识别，这推动了针对胶质瘤新生血管可靠蛋白质组学分析方案的建立。
然而，新生血管组织仅是全部胶质瘤组织中的一个组成部分。从全部胶质瘤组织中分离并纯化新生血管组织，是实现胶质瘤血管生成准确定量蛋白质组学分析的关键步骤。激光捕获显微切割（LCM）28,29,30,31 是一种有效分离和纯化全部胶质瘤组织中新生血管组织的方法。要获得足量的新生血管组织蛋白用于定量蛋白质组学分析极为困难。2007年，一个研究团队尝试使用LCM从IV级胶质瘤中分离新生血管组织进行蛋白质组学分析，仅通过质谱（MS）鉴定出4种蛋白质32。随后在2012年，该团队继续使用LCM富集IV级胶质瘤的新生血管组织进行定量蛋白质组学分析，也仅通过质谱鉴定出29种蛋白质33。这两项关于胶质瘤血管生成的蛋白质组学研究显示出极低的蛋白质组通量，无法反映胶质瘤血管生成复杂的蛋白质组全景。
本方案建立了一种能够获取足量新生血管蛋白的方法，用于胶质瘤血管生成的定量蛋白质组学分析，从而构建肿瘤血管生成的大规模蛋白质组学图谱。该研究对于发现有效的基于血管生成的生物标志物以及抗血管生成治疗靶点/药物具有重要的科学意义。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本涉及人体组织样本的实验方案已获得山东第一医科大学医学伦理审查委员会批准（批准号：R202211090133），并已取得患者及其家属的知情同意。本研究所用胶质瘤样本均来自中南大学湘雅医院神经外科手术切除标本，包括7例III级星形细胞瘤组织。正常对照血管（n = 3）取自因脑外伤而切除的受损脑组织中的微血管。所有患者均为首次就诊，术前未接受过放疗或化疗，并均由中南大学湘雅医院病理科确诊。三例正常对照血管组织来自中南大学湘雅医院神经外科手术中切除的因外力损伤但无胶质瘤的正常脑组织中的极细小血管。所用试剂与设备详见材料表。
1. 使用激光捕获显微切割技术从人脑胶质瘤组织中分离新生血管组织
- 准备激光显微切割（LCM）载玻片：将聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜手动涂覆于可重复使用的金属载玻片上，并将涂覆后的载玻片保存于 -80 °C环境中。
注意：预涂覆的金属载玻片将用于直接黏附冷冻组织切片。 - 配制甲苯胺蓝染色液（0.5%）：将0.25 g甲苯胺蓝溶于40 mL去离子水（ddH₂O）中，加入一片蛋白酶抑制剂，搅拌至完全溶解，再用去离子水定容至50 mL，过滤后置于冰上保存。
- 处理组织：保持冷冻切片机在工作温度下运行（-25 °C的腔体/样本头温度）。从-80 °C环境中取出胶质瘤组织，置于冰上转移，用滤纸去除血液，选择合适的组织块进行包埋。
- 组织包埋步骤：预先冷却样本盘，加入包埋介质并迅速包埋组织块，随后在-25 °C条件下冷冻10分钟以固化。
- 切片并筛选血管：以8 µm厚度进行组织切片，将切片贴附于普通载玻片上，使用甲苯胺蓝染色液染色，并在光学显微镜下筛选新生血管区域。
注意：若未检测到血管，弃去3–5张组织切片，重复染色步骤，直至出现新生血管区域。 - 将含血管的组织切片转移至已准备好的LCM载玻片上：将确认含有血管的切片转移至涂有PEN膜的LCM载玻片，密封、标记后保存于-80 °C环境中。
- 用预冷的70%乙醇（4 °C，1–2分钟）固定LCM载玻片上的组织切片；倾去乙醇，再用0.5%甲苯胺蓝染色（4 °C，30秒）；倾去染液，用去离子水（4 °C）漂洗两次（使用两个独立的洗液槽），倾去液体，随后在蛋白酶抑制剂溶液中孵育30秒，最后保存于-80 °C环境中。
- 提前启动LCM仪器，预热30分钟，再使用固态红外激光继续预热30分钟，然后安装500 µL微量离心管收集装置。
- 将已装载组织样本的LCM切片（保存于-80 °C）置于准备好的LCM仪器上，借助配套软件调整焦距，聚焦于胶质瘤组织中的新生血管区域。
- 沿新生血管外缘精确绘制激光标记线（避免触及血管壁），使用激光烧蚀并分离新生血管，随后将其收集至EP管盖中。
注意：可进行第二次激光烧蚀，以确保新生血管已完全分离。 - 将收集的新生血管样本管倒置并密封，保存于-80 °C超低温冰箱中。
2. 激光捕获显微切割分离的胶质瘤新生血管组织中蛋白质的提取及蛋白含量定量
- 准备含有4%十二烷基硫酸钠（SDS）、1 mM二硫苏糖醇（DTT）和150 mM Tris-HCl（pH 8.0）的蛋白提取缓冲液。
注意：SDS为有害粉尘，严重刺激眼睛、皮肤和呼吸道，必须在通风橱中称量；DTT具有刺激性，也必须在通风橱中称量。 - 将激光捕获显微切割（LCM）获取的胶质瘤新生血管组织重悬于提取缓冲液中，在冰水浴中超声处理1分钟以实现完全裂解。
- 在16,000 × g 条件下离心10分钟，转移上清至新的微量离心管中。
- 取少量上清用于蛋白定量。向剩余上清中加入DTT（终浓度：1 mM DTT），轻轻吹打混匀以避免产生气泡。分装后于-80 °C保存。
- 按照以下步骤进行二喹啉乙酸（BCA）蛋白定量检测：
- 配制工作液（试剂A:B = 50:1）。
- 配制牛血清白蛋白（BSA）标准品溶液（0.5 mg/mL）。
- 根据表1加入相应溶液。
- 将样品/标准品与工作液混合后转移至96孔板。
- 37 °C孵育30分钟。
- 在562 nm处测定吸光度。
- 根据标准曲线计算蛋白浓度。
3. 采用定量蛋白质组学分析制备的新生血管蛋白
- 制备提取的新生血管蛋白的胰蛋白酶肽样品。
- 向每份提取的蛋白质样品（肿瘤；对照）中加入预冷的丙酮（样品：丙酮 = 1:5，v/v），充分混匀，并于 -20 °C 孵育 °C孵育1小时。以12,000 x 胶质瘤 (4 °C）15 分钟。弃去上清液以去除蛋白提取试剂（SDS、DTT 和 Tris-HCl），将沉淀重悬于 20 µL 溶解缓冲液含 1 µL 1% SDS
注意：使用丙酮时需在通风良好的环境中进行，佩戴安全护目镜，远离点火源，并将废液置于专用的防爆容器中处理。 - 加入2 µ加入还原剂（DTT）至各样品中，充分混匀，并于60℃孵育 °C孵育1小时。加入1 µL-半胱氨酸封闭试剂（碘乙酰胺），室温孵育10分钟。
- 加入胰蛋白酶（蛋白质：胰蛋白酶 = 20:1，v/v）至各样品中，涡旋混匀后于37℃孵育。 °C 过夜。
- 向每份提取的蛋白质样品（肿瘤；对照）中加入预冷的丙酮（样品：丙酮 = 1:5，v/v），充分混匀，并于 -20 °C 孵育 °C孵育1小时。以12,000 x 胶质瘤 (4 °C）15 分钟。弃去上清液以去除蛋白提取试剂（SDS、DTT 和 Tris-HCl），将沉淀重悬于 20 µL 溶解缓冲液含 1 µL 1% SDS
- 使用同重标记相对与绝对定量（iTRAQ）试剂标记已制备的胰蛋白酶消化肽段。
注意：本实验方案使用六重 iTRAQ 试剂（plex 标签 113、114、115、116、117 和 118）标记胰蛋白酶消化的肽段样本（肿瘤；对照），每种样本重复标记三次。表2).- 用50 µL异丙醇复溶每管iTRAQ试剂 µL-异丙醇
- 将胰蛋白酶消化的肽段样品加入相应的试剂管中，室温孵育1小时。
- 通过加入 3 终止反应× 加入超纯水至终体积，然后在室温下孵育30分钟。
- 将标记的六个样本等量混合，充分混匀后冻干。
- 使用强阳离子交换（SCX）对iTRAQ标记的胰蛋白酶消化肽样本进行分级分离。
- 将冻干肽在2 mL溶液A（10 mM KH₂PO₄，25%乙腈，pH 2.7）。上样至磺乙基功能化阳离子交换柱（4.6 × 100 mm, 5 µm, 200 Å).
- 使用溶液B（500 mM KCl，10 mM KH）以1 mL/min的恒定流速进行洗脱₂PO₄，25% ACN，pH 2.7）：0%→10 %（2 分钟） → 10 %→20 %（25 分钟） → 20 %→45 %（5 分钟） → 50 %→100 %（5 分钟）。全程在 214 nm 处监测，每分钟收集一管，共收集 30 个组分。
- 通过真空离心浓缩各组分，然后用 40 重悬 µL 的 0.1%（v/v）三氟乙酸（TFA）。所有 30 个组分均储存于 -80 °C 冰箱
注意：三氟乙酸（TFA）具有强腐蚀性和毒性，可导致严重的皮肤和眼部损伤，并刺激呼吸系统；必须在通风橱中操作，佩戴适当的个人防护装备，包括耐酸手套、护目镜和实验服，废弃物须作为酸性废液收集。
- 使用 LC-MS/MS 分析每个分馏的肽样品。
- 使用C18反相固相萃取柱（标准密度，柱床内径7 mm，体积3 mL）进行脱盐。
- 使用 C18 反相液相色谱柱（10 cm 长，75 µm i.d.，3 µm 树脂）以洗脱 10 µ每种组分分别用溶液C（0.1%甲酸）和溶液D（80%乙腈和0.1%甲酸）以250 nL/min的流速进行140 min的梯度洗脱。
- 在线将经液相色谱分离的肽段输入高分辨率质谱仪进行 MS/MS 分析。
- 使用 Proteome Discoverer 1.4 将 Q Exactive 生成的原始谱图文件（.raw）转换为 .mgf 格式，然后将这些 .mgf 文件提交至 MASCOT 2.2 服务器 软件内置的数据库搜索模块
注意： Uniprot 人类 数据库（共 146,704 条序列；于 2025 年 7 月 20 日下载自 http://www.uniprot.org）使用详细的搜索参数（表3). - 从 MASCOT 服务器中获取搜索结果文件（.dat），并重新导入 Proteome Discoverer 1.4。在错误发现率（FDR）阈值下进行数据过滤 <0.01 以获得高置信度的鉴定结果。
- 利用 MS/MS 数据鉴定蛋白质氨基酸序列，通过 iTRAQ 报告离子强度定量蛋白质丰度。
- 计算实验重复性以确定差异表达蛋白（DEPs）的截断值及显著性 p 值<0,05.
注意：在本研究中，截断值确定为倍数变化（FC） > 1.4，可有效消除系统误差。
- 分析胶质瘤新生血管差异表达蛋白的功能特征。
- 访问 DAVID（功能注释、可视化与集成发现数据库，版本 6.7； https://david.ncifcrf.gov/) 主页并选择 开始分析 在菜单栏中启动分析。
- 选择左侧面板作为上传界面；将蛋白质或基因 ID 输入到 步骤 1 按照提示将输入框中的内容复制粘贴。
- 对于 步骤 2，选择与上传的蛋白质匹配的标识符类型；本研究使用了 UniProt登录号
- 对于 步骤 3选择基因列表或背景设置：基因富集分析需要选定一个背景基因集。系统默认使用该物种的全基因组，用户也可上传自定义的蛋白质/基因列表作为背景。
- 点击 提交列表 提交条目并启动分析。
注意：分析结果显示在“注释摘要结果”面板的右侧。用户可根据分析需求选择输出内容；本研究特别使用了 GOTERM_BP_FAT 列出以分析涉及差异表达蛋白的生物过程。 - 获取胶质瘤新生血管差异表达蛋白的生物过程（BPs）、细胞组分（CCs）、分子功能（MFs）及KEGG通路。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
已获得足量的LCM分离蛋白质样品，用于定量蛋白质组学分析
为了获得胶质瘤新生血管组织中差异表达蛋白的可靠蛋白质组学谱型，本研究选取了最常见的胶质瘤亚型——III级星形细胞瘤，并利用激光显微切割技术（LCM）分离新生血管组织，因为该组织中富含新生血管。此外，定量蛋白质组学分析要求每个样本至少含有400 µg蛋白质。本研究采用LCM技术，从7例III级星形细胞瘤组织中精确分离出新生血管组织，共获得8.4 mg的LCM分离新生血管组织（表4）。同时，以因脑外伤而切除的3例受损脑组织为来源，共获得27.5 mg正常对照微血管组织（表4）。
由于激光显微切割分离的新生血管组织样本极为珍贵，因此在提取前估算其蛋白质含量至关重要。通常情况下，蛋白质提取率可达样本重量的5%–10%。因此，胶质瘤新生血管组织的预计蛋白含量为420–840 µg，对照组织为1375–2750 µg，此数量足以满足定量蛋白质组学分析的要求(表4)<...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
激光显微切割联合同位素标记定量蛋白质组学首次鉴定出胶质瘤血管生成的大规模蛋白质组谱
肿瘤血管生成是胶质瘤的关键病理特征，与其高度侵袭性和治疗抵抗性密切相关6,7。传统的抗血管生成疗法（如 VEGF 抑制剂）由于靶点单一及代偿性耐药机制，临床疗效有限19,20,21,22。以肿瘤血管生成为靶向的研究具有重要的科学意义。获取肿瘤血管生成的大规模蛋白质组谱图具有迫切需求。本方案的一项关键创新在于利用激光显微切割技术（LCM），从胶质瘤组织中有效分离并富集足量新生血管组织，从而首次获得胶质瘤中肿瘤血管生成的大规模蛋白质组谱图。该技术通过 LCM 直接靶向新生血管组织进行肿瘤...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本工作得到中国国家自然科学基金（81272798 资助 X.Z.，82203592 资助 N.L.）、山东省自然科学基金（ZR2022QH112 资助 N.L.）、山东省泰山学者工程专项经费（NO.tstp20221143 资助 X.Z.）、中国国家高端外国专家人才计划（H20240743；外国专家：X.Z.）以及山东第一医科大学新兴战略领域科研培育项目（202403）的支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔板 | Thermo Fisher Scientific (USA) | 468667 | 耗材 |
| 丙酮 | NanJing Reagent (China) | C0720114023 | 试剂 |
| 乙腈 | Merck (China) | CN34892 | 试剂 |
| BCA蛋白检测试剂盒 | Abcam (UK) | ab102536 | 试剂 |
| 牛血清白蛋白（BSA）标准品 | Solarbio (China) | PC0001-1 | 试剂 |
| 离心管（50 mL） | Kirgen (China) | KG2811 | 耗材 |
| 冷冻切片机 | Leica (Germany) | C1900 | 设备 |
| 半胱氨酸 | Aladdin (China) | C108238 | 试剂 |
| DL-二硫苏糖醇（DTT） | Amresco (USA) | D8220 | 试剂 |
| EASY-Spray C18反相高效液相色谱柱 | Thermo Scientific (USA) | ES800A | 耗材 |
| 电子天平 | Sartorius (USA) | BSA224S | 设备 |
| 包埋介质 | Leica (Germany) | 39475237 | 耗材 |
| Empore SPE C18固相萃取柱 | Sigma-Aldrich (USA) | 66872-U | 耗材 |
| Eppendorf管 | Kirgen (China) | KG2211 | 耗材 |
| 滤纸 | Cytiva (USA) | Grade42 | 耗材 |
| 甲酸 | Aladdin (China) | F112032 | 试剂 |
| 玻璃烧杯 | SHUBO (China) | 1015479 | 耗材 |
| 玻璃量筒 | SHUBO (China) | 1601 | 耗材 |
| 高分辨率液相色谱-质谱联用仪 | Thermo Scientific (USA) | Q-Exactive | 设备 |
| 保温容器 | Fhefon (China) | LCZYX-12 | 耗材 |
| 倒置显微镜 | Leica (Germany) | XDS-1 | 设备 |
| 碘乙酰胺 | Solarbio (China) | I8010 | 试剂 |
| 异丙醇 | Aladdin (China) | I112018 | 试剂 |
| iTRAQ试剂 | Sigma-Aldrich (USA) | 4381663 | 试剂 |
| KCl | Beyotime (China) | ST1596 | 试剂 |
| KH2PO4 | ShangHai YuanYe (China) | S24278 | 试剂 |
| 激光捕获显微切割系统 | Leica (Germany) | LMD 6000 | 设备 |
| 激光捕获显微切割载玻片 | Leica (Germany) | 3800040 | 耗材 |
| Leica高轮廓一次性刀片 | Leica (Germany) | 14035838926 | 耗材 |
| 液氮罐 | KEYICRYO (China) | YDS-3 | 设备 |
| 磁力加热搅拌器 | ShanghaiSILE (China) | LAB-0002-0068-SHSL | 设备 |
| 酶标仪 | TECAN (Switzerland) | INFNITE F200 | 设备 |
| PEN 膜 | Leica (Germany) | 11505189 | 耗材 |
| pH计 | Sartorius (USA) | PB-10 | 设备 |
| 移液器 | Eppendorf (Germany) | 3123000268 | 设备 |
| 移液器 | Eppendorf (Germany) | 3123000241 | 设备 |
| 移液器 | Eppendorf (Germany) | 3123000225 | 设备 |
| PolySULFOETHYL A | PolyLC Inc (USA) | 104SE0303 | 耗材 |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche (Switzerland) | 05892791001 | 试剂 |
| 冷冻离心机 | Beckman (USA) | AllegraTM X-22R | 设备 |
| 冰箱 | MEILING (China) | BCD-180KCT | 设备 |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Amresco (USA) | 1027P033 | 试剂 |
| 染色缸 | Beyotime (China) | FG005 | 耗材 |
| 不锈钢药匙 | Muzixing (China) | XYS-101 | 耗材 |
| 吸头 | Kirgen (China) | KG1313 | 耗材 |
| 甲苯胺蓝染色液 | Sigma-Aldrich (USA) | 198161-5G/198161-25G | 试剂 |
| 三氟乙酸 | Aladdin (China) | T103293 | 试剂 |
| Tris-HCl | Amresco (USA) | T8230 | 试剂 |
| 胰蛋白酶-EDTA溶液 | Solarbio (China) | T1300 | 试剂 |
| 超低温冰箱 | Sanyo (Japan) | MDF-382E | 设备 |
| 超纯水净化系统 | ELGA (UK) | PureLAB flex | 设备 |
| 超声波细胞破碎仪 | QSONICA (USA) | Q500 | 设备 |
| 真空冷冻干燥机 | Thermo (USA) | SNL 315SV | 设备 |
| 涡旋混合器 | Crystal Technology & Industries (USA) | HYQ-3110 | 设备 |
| 水浴培养箱 | Shanghai Yiheng Technology Instrument (China) | HWS-26 | 设备 |
| 称量纸 | Cole-parmer (USA) | 133802 | 耗材 |
参考文献
- Lapointe, S., Perry, A., Butowski, N. A. Primary brain tumours in adults. Lancet. 392 (10145), 432-446 (2018).
- Pienkowski, T., et al. Proteomic profiling reveals dynamic regulation of vesicle trafficking across glioma grades. J Neurooncol. 175 (2), 585-598 (2025).
- Louis, D. N., et al. The 2021 WHO classification of tumors of the central nervous system: A summary. Neuro Oncol. 23 (8), 1231-1251 (2021).
- Kan, L. K., et al. Potential biomarkers and challenges in glioma diagnosis, therapy and prognosis. BMJ Neurol Open. 2 (2), e000069(2020).
- Bertolini, G., et al. Prognostic impact of second surgical resection in IDH wildtype recurrent glioblastoma following chemo-radiation therapy: a propensity score analysis cohort study. J Neurooncol. 174 (3), 789-798 (2025).
- Ma, X., et al. Long non-coding RNA HOTAIR enhances angiogenesis by induction of VEGFA expression in glioma cells and transmission to endothelial cells via glioma cell derived-extracellular vesicles. Am J Transl Res. 9 (11), 5012-5021 (2017).
- Wang, R., et al. MCPIP1 promotes cell proliferation, migration and angiogenesis of glioma via VEGFA-mediated ERK pathway. Exp Cell Res. 418 (1), 113267(2022).
- Seyedmirzaei, H., Shobeiri, P., Turgut, M., Hanaei, S., Rezaei, N. VEGF levels in patients with glioma: a systematic review and meta-analysis. Rev Neurosci. 32 (2), 191-202 (2021).
- Zhong, Y., et al. Vasorin exocytosed from glioma cells facilitates angiogenesis via VEGFR2/AKT signaling pathway. Mol Cancer Res. 22 (7), 668-681 (2024).
- Domènech, M., Hernández, A., Plaja, A., Martínez-Balibrea, E., Balañà, C. Hypoxia: The cornerstone of glioblastoma. Int J Mol Sci. 22 (22), 12608(2021).
- Chen, Z., et al. Prrx1 promotes stemness and angiogenesis via activating TGF-β/smad pathway and upregulating proangiogenic factors in glioma. Cell Death Dis. 12 (6), 615(2021).
- Bastola, S., et al. Endothelial-secreted Endocan activates PDGFRA and regulates vascularity and spatial phenotype in glioblastoma. Nat Commun. 16 (1), 471(2025).
- Krenzlin, H., et al. Cytomegalovirus promotes murine glioblastoma growth via pericyte recruitment and angiogenesis. J Clin Invest. 129 (4), 1671-1683 (2019).
- Hong, G., et al. EGFL7: Master regulator of cancer pathogenesis, angiogenesis and an emerging mediator of bone homeostasis. J Cell Physiol. 233 (11), 8526-8537 (2018).
- Feldo, M., et al. Effect of diosmin administration in patients with chronic venous disorders on selected factors affecting angiogenesis. Molecules. 24 (18), 3316(2019).
- Anakha, J., Dobariya, P., Sharma, S. S., Pande, A. H. Recombinant human endostatin as a potential anti-angiogenic agent: therapeutic perspective and current status. Med Oncol. 41 (1), 24(2023).
- Kaur, S., et al. Functions of thrombospondin-1 in the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 22 (9), 4570(2021).
- Qi, J. H., Anand-Apte, B. Deglycosylation increases the aggregation and angiogenic properties of mutant tissue inhibitor of metalloproteinase 3 protein: Implications for sorsby fundus dystrophy. Int J Mol Sci. 23 (22), 14231(2022).
- Sandmann, T., et al. Patients with proneural glioblastoma may derive overall survival benefit from the addition of bevacizumab to first-line radiotherapy and temozolomide: Retrospective analysis of the AVAglio trial. J Clin Oncol. 33 (25), 2735-2744 (2015).
- Funakoshi, Y., et al. Update on chemotherapeutic approaches and management of bevacizumab usage for glioblastoma. Pharmaceuticals (Basel). 13 (12), 470(2020).
- Sferruzza, G., Malcangi, M., Bosco, L., Finocchiaro, G. Reassessing the efficacy of bevacizumab in newly diagnosed glioblastoma: A systematic review and external pseudodata-based analysis. Neurooncol Adv. 6 (1), vdad174.31(2024).
- Ahir, B. K., Engelhard, H. H., Lakka, S. S. Tumor development and angiogenesis in adult brain tumor: glioblastoma. Mol Neurobiol. 57 (5), 2461-2478 (2020).
- Hallal, S., et al. A comprehensive proteomic SWATH-MS workflow for profiling blood extracellular vesicles: A new avenue for glioma tumour surveillance. Int J Mol Sci. 21 (13), 4754(2020).
- Westphal, M., Lamszus, K. Circulating biomarkers for gliomas. Nat Rev Neurol. 11 (10), 556-566 (2015).
- Santangelo, A., Tamanini, A., Cabrini, G., Dechecchi, M. C. Circulating microRNAs as emerging non-invasive biomarkers for gliomas. Ann Transl Med. 5 (13), 277(2017).
- Gahoi, N., et al. Multi-pronged proteomic analysis to study the glioma pathobiology using cerebrospinal fluid samples. Proteomics Clin Appl. 12 (2), 201870013(2018).
- Hao, X., et al. Urinary protein biomarkers for pediatric medulloblastoma. J Proteomics. 225, 103832(2020).
- Mustafa, D., Kros, J. M., Luider, T. Combining laser capture microdissection and proteomics techniques. Methods Mol Biol. 428, 159-178 (2008).
- Zheng, P. P., et al. Differential expression of splicing variants of the human caldesmon gene (CALD1) in glioma neovascularization versus normal brain microvasculature. Am J Pathol. 164 (6), 2217-2228 (2004).
- Miyai, M., Iwama, T., Hara, A., Tomita, H. Exploring the vital link between glioma, neuron, and neural activity in the context of invasion. Am J Pathol. 193 (6), 669-679 (2023).
- Komiyama, K., et al. Glioma facilitates the epileptic and tumor-suppressive gene expressions in the surrounding region. Sci Rep. 12 (1), 6805(2022).
- Mustafa, D. A. N., et al. Identification of glioma neovascularization-related proteins by using MALDI-FTMS and nano-LC fractionation to microdissected tumor vessels. Mol Cell Proteomics. 6, 1147-1157 (2007).
- Mustafa, D. A. N., et al. A proteome comparison between physiological angiogenesis and angiogenesis in glioblastoma. Mol Cell Proteomics. 11 (6), M111.008466(2012).
- Li, C., et al. Accurate qualitative and quantitative proteomic analysis of clinical hepatocellular carcinoma using laser capture microdissection coupled with isotope-coded affinity tag and two-dimensional liquid chromatography mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 3 (4), 399-409 (2004).
- Woo, J., Schoenfeld, M., Sun, X., Iraguha, T., Zhou, Z., Zhang, Q. Mouse paneth cell-enriched proteome enabled by laser capture microdissection. Proteome Res. 21 (10), 2435-2442 (2022).
- Zhang, Y., et al. Quantitative phosphoproteomics reveals molecular pathway network alterations in human early-stage primary hepatic carcinomas: potential for 3P medical approach. EPMA J. 14 (3), 477-502 (2023).
- Yang, H., et al. Ubiquitinomics revealed disease- and stage-specific patterns relevant for the 3PM approach in human sigmoid colon cancers. EPMA J. 14 (3), 503-525 (2023).
- Wen, S., et al. Quantitative acetylomics revealed acetylation-mediated molecular pathway network changes in human nonfunctional pituitary neuroendocrine tumors. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 753606(2021).
- Su, J., Yang, L., Sun, Z., Zhan, X. Personalized drug therapy: Innovative concept guided with proteoformics. Mol Cell Proteomics. 23 (3), 100737(2024).
- Yang, L., et al. What does one-dimensional gel electrophoresis-based western blotting data really mean in the reality of proteoforms. Talanta. 295, 128266(2025).
- Fang, Z., et al. Proteoformics: Current status and future perspectives. J Proteomics. 321, 105524(2025).
- Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA J. 9 (1), 77-102 (2018).
- Jia, W., Gong, X., Ye, Z., Li, N., Zhan, X. Nitroproteomics is instrumental for stratification and targeted treatments of astrocytoma patients: Expert recommendations for advanced 3PM approach with improved individual outcomes. EPMA J. 14 (4), 673-696 (2023).
- Gong, X., et al. Glioma angiogenesis phosphoproteome landscape and biomarker sets identified with phenome-centered multiomics toward 3P medical approaches. EPMA J. 16 (4), 831-856 (2025).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
