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通过植入微透析探针实时采集大鼠股动静脉外膜间质液

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DOI：

10.3791/69551

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2025年12月30日

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1Beijing Hospital, National Center of Gerontology, Institute of Geriatric Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 2Peking Union Medical College, 3The Key Laboratory of Geriatrics, Beijing Institute of Geriatrics, Institute of Geriatric Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, 4Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究介绍了一种微透析技术，可实现对麻醉大鼠外膜间质液（AISF）的实时、解剖学精确定位取样，揭示了其独特的代谢差异，并证实了其重要的生理意义。与现有的间质液（ISF）取样方法相比，该方法具有更高的分子分辨率和取样稳定性。

摘要

组织间液（ISF）是细胞外微环境的重要组成部分，参与代谢物质交换和细胞间通讯。然而，由于解剖位置较深且邻近血管结构，血管外膜组织间液（AISF）的采集极易受到污染或导致组织损伤，因而极具挑战性。本研究介绍了一种在麻醉大鼠中通过微透析技术实时、微创采集AISF的方法。将两根截留分子量为20 kDa的探针分别手术植入股动静脉外膜和颈静脉，以实现对ISF和血液的连续取样。使用人工细胞外液进行灌流，可选择性地扩散小分子量代谢物。通过主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），观察到AISF与血液之间存在显著的代谢差异，共鉴定出146种差异显著的代谢物。乳酸和5-羟色胺的富集模式验证了该方法在解剖特异性和功能可靠性方面的优势。尤为重要的是，AISF中含有多种在血浆中未检测到的局部合成代谢物，凸显其独特的生理意义。与现有的ISF采样技术（如微针、负压水疱法和反向离子电渗法）相比，微透析具有更高的分子分辨率、更稳定的采样性能以及更低的侵入性。该技术为 体内 分析间质液中的分析物（AISF），在推动生物标志物发现及血管病理生理学研究方面展现出重要潜力。

引言

组织液，即间质液（ISF），是细胞微环境的关键组成部分，其学术研究可追溯至19世纪末。1896年，Starling提出了毛细血管滤过-重吸收理论，首次将ISF描述为通过血浆超滤产生的均质液体，在营养物质运输和代谢废物清除中发挥重要作用1。在过去二十年中，显微成像技术和分子生物学的进步加深了研究人员对ISF在解剖分布、组成和功能方面显著多样性的理解2。

对不同解剖部位间质液（ISF）的研究揭示了其在各类组织中的独特功能。例如，在脑组织中，ISF可在睡眠期间促进神经毒性代谢产物（如β-淀粉样蛋白）的清除 通过 类淋巴系统3相反，肿瘤间质液（TIF）通过乳酸的积累形成酸性微环境，从而促进肿瘤侵袭和免疫逃逸。4这些发现表明，间质液（ISF）不仅作为代谢交换的媒介，还作为组织特异性病理生理过程的主动调节者发挥作用。在此背景下，外膜间质液（AISF）因其特定的解剖定位和功能复杂性，成为一个独特的研究难题。AISF位于外膜与周围组织的交界处。5，在血管壁与神经和免疫系统之间的相互作用中起着关键作用。然而，由于其解剖位置较深且邻近血液和淋巴液，给研究带来了重大的技术挑战 原位 采样与组分分析

传统的脑脊液取样技术，包括纱布条法和手术引流法，在获取高纯度脑脊液样本时面临重大挑战，主要由于存在血液污染和组织损伤的风险。例如，手术切除血管上皮可能损伤周围神经或淋巴管，导致非目标生物分子混入6此外，这些方法受限于采样率低、不稳定、易受干扰以及重复性差，这些问题通常归因于皮下棉芯插入所引发的炎症反应。7 以及肌肉植入过程中发生的细胞损伤。微透析技术的发展为ISF研究提供了更有效的方法。该技术能够实现 原位 利用半透膜探针在不破坏血管结构的前提下，实现对间质液（ISF）中代谢物和细胞因子等小分子的动态捕获。该探针可精确定位于血管上皮间隙内，从而降低来自血液或淋巴液污染的风险。此外，该技术支持连续采样，能够在不同条件下实时监测ISF代谢的动态变化。实验过程中需确保对这些代谢过程进行持续且稳定的监测。

方案

动物实验经北京协和医学院动物伦理委员会批准后进行。所有操作均严格遵循既定的实验方案。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 实验准备

  1. 如图1所示，展示微透析采样系统及相关外科手术器械。
  2. 配制含153.5 mM Na、4.3 mM K、0.41 mM Mg、0.71 mM Ca、139.4 mM Cl和1.25 mM葡萄糖的人工细胞外液（aECF），并将pH值调节至7.4。
  3. 准备两根20-kDa微透析探针，分别标记为探针1（组织液探针）和探针2（血液探针）。将探针1置于经无菌过滤的去离子水（dH₂O）中，探针2置于1%肝素钠溶液中，确保探针尖端始终保持湿润。
  4. 建立两组通路（通路1和通路2），分别用于"进液"和"出液"。使用PE50导管连接两段1米长的FEP导管，尽量减少死腔。将每根进液管连接至1 mL Exmire注射器：注射器1中装入dH₂O，注射器2中装入1%肝素钠。将微量注射器连接至探针，并在将探针置入颈静脉后，准备进行aECF灌注。
  5. 启动微透析泵，将流速设为1.5 µL/min，直至液体从出液管端流出。将出液管连接至样品收集管线。
  6. 用过滤后的aECF填充两支微量注射器，并以1 µL/min的流速开始泵送。

2. 动物准备

  1. 选取体重为 280 ± 20 g 的成年 Sprague-Dawley 大鼠（n = 6）。
  2. 使用 3% 异氟烷进行麻醉诱导，并以空气/氧气混合气体中 1.8%–2.2% 的异氟烷维持麻醉，同时监测心脏活动（遵循机构批准的实验方案）。通过评估疼痛反应的消失以及心率降低（340–390 次/分钟）确认深度麻醉状态。将大鼠置于恒温毯上，并固定四肢。
  3. 在颈部及左后肢至左下腹部区域涂抹脱毛膏。使用碘伏对脱毛区域消毒两次，并用 75% 医用酒精清除残留碘液。

3. 双位点探针放置（股动脉外膜和颈静脉）

  1. 使用带有10 mm活性透析窗口的探针（CMA-20，截留分子量20 kDa，针杆直径0.5 mm），如图2A所示。
  2. 准备引导针和可撕开导管（图2B）。
  3. 伸展大鼠后肢，使连接膝关节与腹股沟皱襞中点的直线垂直于身体纵轴。沿腹股沟区皮肤向后肢方向测量2 cm的区段，以确定手术标志区域（图2C）。将该腹股沟区域的中点确定为微窗定位点，并在该定位点外侧2 cm处标记穿刺部位（图2D）。
  4. 将动物置于体视显微镜下。
  5. 在腹股沟皱襞中点处做0.5–0.8 cm的切口，以便观察并确保探针准确置入血管周围膜内。钝性分离皮下组织，暴露股动脉和股静脉、隐静脉以及浅腹壁静脉（图2E）。
  6. 将穿刺针外层包裹可撕开导管，制成引导针。
  7. 确认穿刺部位皮肤下方无血管存在。将针头垂直刺入皮肤，随后调整角度至45°，进入隐静脉周围的组织间隙。
  8. 沿大隐静脉血流方向推进针头，操作过程中始终保持针头紧贴血管壁。使用体视显微镜实时监测针头位置，避免血管损伤或血液污染。随后将针头引导进入股静脉的外膜（图2F）。
  9. 撤出穿刺针，同时保留可撕开导管在组织内原位（图2G）。
  10. 将组织液探针插入可撕开导管中，小心打开导管以暴露采样部位并获取组织样本（图2H）。确保探针精确置于股动脉和股静脉的外膜内（图2I）。缝合前将探针固定于皮肤上（图2J）。所有操作均须在严格无菌条件下进行，注意避免扰动血管外膜，防止组织炎症或异物反应，以免影响组织液采集。
  11. 通过拍摄固定探针与手术尺的照片，记录探针暴露长度，以验证探针位置，并按图2I所示方式呈现图像。
  12. 在颈部中线外侧约0.5 cm处做一2 cm长的皮肤切口，起始点位于胸骨切迹上方1 cm。
  13. 钝性分离胸锁乳突肌，暴露位于颈动脉外侧的颈静脉，其呈深蓝色。用湿润的棉签轻轻分离筋膜，注意避免接触迷走神经。
  14. 使用显微镊子轻轻提起颈静脉外膜，仔细清除周围结缔组织，获得至少1 cm的游离血管段。在近端放置一根4-0丝线作为备用结扎线（图2K）。
  15. 进行静脉穿刺时，在血管直径约三分之一处以45°角做斜行切口。使用显微镊子轻轻撑开切口，为探针插入建立入口。
  16. 小心将探针尖端插入静脉，并缓慢推进至3.5–4.0 cm深度，确保尖端到达右心房入口（图2L）。
  17. 通过双结扎紧近端丝线固定探针。使用4-0 Vicryl缝线缝合肌肉层，然后用间断缝合关闭皮肤。将探针外露部分固定于皮肤表面，防止移位。

4. 样品采集与探针回收

  1. 样品采集：评估组织透析与样品转移至收集管之间的关系。保持探针与收集器之间的总体积为 20 µL。
    1. 以 1 µL/min 的流速，使样品在探针和管路中运行 20 分钟，到达管路末端以便收集。收集足够的样品体积，以达到检测所需的浓度。每个收集管收集 30 µL 透析液。
  2. 样品储存：将 0.5 mL 聚丙烯收集管预先冷却至 4 °C。样品收集后立即盖紧管盖，于液氮中速冻 30 秒，并在 2 分钟内转移至 -80 °C 超低温冰箱中保存。
  3. 基线样品：在开始样品收集前完成样品平衡。每只大鼠在麻醉状态下采集三个样品，以建立稳定的测量基线。
  4. 探针取出：样品收集完成后，将探针从动物头部取出，并放入含有 1% 肝素钠的储存瓶中。通过吸入过量异氟烷实施安乐死。
  5. 探针保存：用生理盐水彻底冲洗探针，并将其储存在含有生理盐水溶液的瓶中。使用注射器用生理盐水冲洗管路，以防止微生物生长。仅当探针保持足够流量且膜结构完整时方可重复使用。

5. 数据分析

  1. 使用 MetaboAnalyst 6.0 进行主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）及其他统计分析。特别使用 OPLS-DA 来确定投影变量重要性值（VIP）。
  2. 采用非参数检验方法，包括 P 值评估和倍数变化分析，以检测差异代谢物。设定筛选差异代谢物的关键阈值为 VIP > 1、FC ≥ 2 或 FC ≤ 0.5，且 P < 0.05。
  3. 利用 KEGG 化合物数据库对鉴定出的代谢物进行注释。

6. 高效液相色谱-串联质谱法

  1. 使用配备电喷雾电离（ESI）源的 AB Sciex 6500+ 三重四极杆质谱仪，在正离子模式下进行代谢物定量分析。
  2. 设定仪器参数如下：气帘气，40 psi；碰撞气，10 psi；离子源气体1（GS1），50 psi；离子源气体2（GS2），55 psi；离子喷雾电压，4500 V；源温度，550 °C。
  3. 以多反应监测（MRM）模式运行系统。针对每种代谢物分别优化MRM跃迁、去簇电位和碰撞能量。使用Analyst 1.7.1软件进行数据采集，使用MultiQuant 3.0.3软件进行定量分析。
  4. 进行色谱分离时，使用C18色谱柱（2.1 × 100 mm，1.7 µm），柱温维持在45 °C。流动相配制如下：（A）含0.1%甲酸的水溶液，（B）含0.1%甲酸的乙腈溶液。设定流速为0.35 mL/min，进样体积为6 µL。分析前将自动进样器温度维持在4 °C。
    注意：本研究中，每次运行总时长约25分钟。

结果

通过求和与对数转换对数据集进行归一化处理，随后进行了一系列全面的统计分析。进行了主成分分析（PCA）（图3A），结果显示了明显的分离趋势，并突出了代谢差异。接着构建了正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型，其得分结果如图3B所示，展示了该模型良好的判别能力。在对618种代谢物的评估中，通过火山图比较AISF与血液样本，共鉴定出146种差异代谢物，其中组织液中既包含下调代谢物也包含上调代谢物（图3C）。此外，绘制了热图以直观展示前50种差异代谢物的比较情况（图3D）。

为评估采样方法的可靠性，分别采用血清素和乳酸作为组织液成分和血液的阳性对照。结果与这些成分在不同体液中已知的分布模式一致，如图4所示。补充图1展示了保存在-80 °C的微透析液等分试样中乳酸和血清素的稳定性。

146种差异代谢物被系统地分为多个类别：核苷、核苷酸及其类似物；脂肪酸及其衍生物；氨基酸、肽及其类似物；碳水化合物及碳水化合物缀合物；有机酸及其衍生物；生物胺；嘌呤和嘧啶；维生素和类固醇；以及其他化合物（图5A）。补充表1列出了在血液中检测到的差异代谢物。热图分析进一步阐明了生物胺以及氨基酸、肽及其类似物在不同体液中的富集模式（图5B、C）。差异代谢物富集分析结果见图6。补充表2列出了在三个连续的血管周围组织液样本中随机选取的15种代谢物的变异系数（CV）。

用于光纤实验的实验室设备设置：泵、注射器、手术工具、连接器。
图1：实验装置示意图。（A）冷藏式组分收集器。（B）注射泵。（C）微量注射器。（D）手术器械，包括血管剪、镊子等。（E）麻醉机。（F）微透析探针。（G）微透析探针、组织导引针和可撕裂导管。（H）组织导引针组件。请点击此处查看该图的放大版本。

股静脉微切口方法；手术示意图；针头、切口；研究、血管研究。
图 2：本研究的关键步骤。（A）示意图，展示手术部位的位置及探针的方向。（B）识别关键血管连接点，以确保准确观察探针放置位置。（C）插入引导针，穿透皮肤并进入组织间隙。（D）撤出引导针芯，将可撕裂套管留置于组织内。（E）通过已建立的通道将微透析探针置入组织。via（F）轻柔撤出可撕裂套管。在固定探针位置后，缓慢撤出可撕裂套管。（G）观察探针在股动脉和股静脉内皮中的位置。（H）从颈静脉分离组织。（I）将探针置入颈静脉内。（J）将微透析探针固定于皮肤表面。（K）隔离颈静脉。（L）将探针插入颈静脉。 请点击此处查看该图的放大版本。

代谢组学研究的主成分分析得分图、载荷条形图、火山图和热图。
图3：组织间液（ISF）与血液的多变量统计分析。（A）数据已进行缩放以突出显著分离，显示ISF与血液成分之间存在明显差异。（B）正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型得分显示R2Y和Q2值分别为0.925和0.811。（C）火山图展示了146种差异代谢物，其中85种在ISF中下调，61种上调。（D）相应地，ISF与血液中前30种代谢物的热图对比揭示了两组成分之间的清晰区分。请点击此处查看该图的放大版本。

乳酸和5-羟色胺水平；箱线图；脑间质液与血液；峰面积测量分析。
图4：一系列箱线图展示了乳酸和5-羟色胺在脑间质液（ISF）和血液中的富集水平。所有数据点均表示均值±标准误（SEM）；所有定量图中均显示误差线。图（A）表明，与血液样本相比，脑间质液样本中的乳酸富集程度显著更高。相反，图（B）显示，5-羟色胺在血液样本中富集更多，而这些样本同时表现出较低的乳酸水平。请点击此处查看该图的放大版本。

通过环形图和热图展示内源性胺类和氨基酸的代谢组学分析。
图 5：差异代谢物的分类环形图，以及氨基酸、肽类及其类似物和内源性胺类的热图。 (A) 每种颜色区块代表一类不同的代谢物。氨基酸、肽类及其类似物占比最高，占总数的19.29%，其次为核苷、核苷酸及其类似物（15%）、脂肪酸及其衍生物（12.86%）、碳水化合物及碳水化合物缀合物（7.86%）、有机酸及其衍生物（10%）、内源性胺类（7.14%）、嘌呤/嘧啶类（5.71%）、维生素和类固醇（8.57%），以及其他化合物（包括吲哚、氮杂环庚烷、吡啶和苯类），占13.57%。( B) 在组织间液（ISF）中，内源性胺类中的脱氧肉碱（Deoxycarnitine）和亚精胺（Spermidine）等化合物的富集水平显著高于血液中的水平，而血清素（D4）、血清素、色胺及相关化合物的水平则显著降低。( C) 在ISF中，大多数与氨基酸、肽类及其类似物相关的代谢物水平明显低于血液中的水平。 请点击此处查看该图的放大版本。

代谢物集合富集结果，气泡图；log p值 对 富集比，代谢通路分析。
图6：正常组织间液的代谢物集合富集分析（MSEA）显示，代谢活性主要分布于与能量生成、氧化还原稳态及氨基酸转化相关的通路中。 富集最显著的通路包括丁酸盐代谢、嘌呤代谢和谷胱甘肽代谢，反映了生理条件下线粒体能量供应和抗氧化能力的维持。此外，还出现了多个与氨基酸相关的通路，如精氨酸和脯氨酸代谢、色氨酸代谢以及半胱氨酸和甲硫氨酸代谢，表明细胞外微环境中存在活跃的氨基酸相互转化及氮平衡调控。这些结果提示，正常组织间液的代谢组在生物能量过程、氧化防御和氨基酸代谢之间维持着动态平衡，从而支持组织稳态和微循环稳定。请点击此处查看该图的高清版本。

补充图1：乳酸和5-羟色胺在-80 °C储存的微透析液等分试样中的稳定性。 数据为均值±标准误（每时间点 n = 6 个重复）。在72小时内，无任何分析物相对于基线偏离超过>5%。请点击此处下载该文件。

补充表 1：在血液和外膜间质液微透析液中检测到的差异代谢物。 包括代谢物名称、倍数变化（FC）、Student t 检验 P 值和 VIP 值（OPLS-DA）。请点击此处下载该文件。

补充表 2：连续三份血管周围组织液样本中随机选择的十五种代谢物的变异系数（CV）。所有 CV 均<20%。请点击此处下载该文件。

讨论

组织液（ISF）是包绕每个组织细胞的水相微环境，约占细胞外液 compartment 的 75%8，9。ISF 由血浆经毛细血管滤过生成，缺乏血液中的细胞成分和高浓度蛋白质，但仍保留电解质、小分子溶质和水9。这种组成使 ISF 成为血管系统与细胞世界之间的关键界面。功能上，ISF 是一种动态的运输介质，将氧气、葡萄糖、氨基酸和微量营养素从血液输送至细胞，同时收集二氧化碳、尿素及其他代谢废物并运回循环系统10。该液体还起到润滑和缓冲作用，维持组织间隙的渗透压、pH 值和离子平衡11。除代谢功能外，ISF 通过在组织间隙中转运白细胞、抗体和细胞因子，支持免疫监视，并作为激素和旁分泌信号的通讯通路12，13。与血液相比，ISF 本质上是一种无细胞、低蛋白的滤过液14。血液局限于血管系统内，含有红细胞、白细胞、血小板以及高浓度的白蛋白和凝血因子。由于细胞摄取作用，血液中的氧气和营养物质浓度最高，而在 ISF 中逐级降低；相反，代谢废物则在进入淋巴或静脉回流前于 ISF 中积聚10。正常 ISF 中缺乏大分子蛋白质和细胞，从而降低了胶体渗透压，有利于快速扩散，但在炎症状态下，这一特性可发生短暂改变15。

然而，由于缺乏简单、快速且可靠的取样方法，对组织间液（ISF）的研究仍然受限。目前的方法包括微针（MN）贴片、负压水疱法、反向离子电渗、热消融和微透析。微针贴片通过皮肤形成微通道以提取ISF，其中核壳结构变体可在30秒内完成提取，而渗透性水凝胶微针则约需3分钟。这些方法可与传感器结合实现贴片上分析，但受限于采集体积，且需在机械强度与溶胀性能之间取得平衡。负压水疱法可获得几乎无血液污染的纯净ISF，但具有侵入性，会引起疼痛且耗时较长16,17,18。反向离子电渗（RI）利用低强度电流将带电分析物（如葡萄糖和锂离子）驱动至皮肤表面，实现无创监测。然而，该方法存在通量低、个体间差异大以及可能引起皮肤刺激等挑战19,20。经皮给药（TA）通过局部加热破坏角质层，使ISF被动进入亲水性微通道。尽管设备设计较为简单，但采集液体积通常不足5 µL，需要高灵敏度检测手段，并需精确控制温度以避免烫伤21,22。相比之下，微透析（MD）依赖于分析物通过植入式半透膜探针的扩散，可通过调节分子量截断值（MWCO）膜实现独特的分子选择性，例如使用10 kDa膜分离葡萄糖，100 kDa膜分离蛋白质和细胞因子23,24。该技术支持连续且微创的取样。然而，MD操作复杂，需要进行in vivo校准，且对疏水性物质的回收率不稳定。值得注意的是，MD是唯一能够实现大分子生物分子尺寸选择性分离的技术25。对采集自血管外膜附近透析液与血液的对比研究表明，乳酸和5-羟色胺的分布特征存在明显差异，从而验证了MD方法的稳定性和特异性。

动物研究表明，在心脏和肺部的协同调控下，ISF 可沿大动脉、静脉及外周神经的外膜流动5,9。通常，ISF 含有直接来自血浆的代谢物以及在组织内局部合成的代谢物26,27,28。因此，AISF 与血浆中代谢物的重叠与差异很可能反映了 ISF 循环系统在沿血管系统运输和清除组织中营养物质及代谢物过程中的作用。本文介绍的基于微透析技术的 AISF 取样方法，将显著促进对全身 ISF 循环在调控多个器官和组织代谢中作用的研究。

本研究中使用的20 kDa分子量截留膜（MWCO）经过优化设计，可高效定量回收葡萄糖、乳酸、丙酮酸和氨基酸等小分子代谢物。然而，该膜对多种具有重要生物学意义的大分子物质，如细胞因子、趋化因子、生长因子和细胞外酶，则存在持续采样不足或完全无法采集的问题。临床与方法学综述指出，标准的20 kDa导管适用于采集小分子亲水性代谢物，但对蛋白质和炎症介质的回收率较低29。因此，准确测定细胞因子浓度需要采用更高分子量截留值（例如100 kDa）的膜或替代采样策略30,31。基于此，我们课题组后续的研究将采用更大截留分子量的膜，以表征外周组织间液中的大分子组成。本研究中透析液是在全身麻醉条件下采集的。微透析技术此前已在清醒、自由活动的动物模型中得到验证，且已有多种"开放式流动"微灌注技术被成功应用于清醒动物模型32。然而，将我们的探针设计和植入方案应用于清醒动物，仍需解决与束缚、动物应激、探针稳定性、运动伪影以及长期通畅性相关的一系列挑战。目前，我们正在研发一种轻量化的束缚滑环系统，并计划在后续研究中开展清醒状态下的采样实验。

披露

不存在需要披露的经济利益冲突。

致谢

本工作由国家重点研发计划项目（2025YFC3507601） 和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（编号：ZZ-YC2023007）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
心电图监测系统AD Instruments, AustraliaPowerLab设备
镊子F.S.T (Fine Science Tools), Germany11252-00手术器械
肝素钠Sigma-Aldrich, USA9041-08-1材料
高效液相色谱串联质谱仪 (HPLC-MS/MS)SCIEX, USAExionLC-20AC设备
IRIS 标准剪刀F.S.T (Fine Science Tools), Germany14060-09手术器械
异氟烷RWD Life Science, PRCR510-22-10材料
低流量麻醉系统Kent Scientific, USASomnoSuite设备
微透析灌流液 T1CMA Microdialysis, SwedenP000034材料
微透析探针，20 EliteCMA Microdialysis, Sweden8010436材料
1 mL 气密型微透析注射器CMA Microdialysis, Sweden8309020材料
制冷式组分收集器CMA Microdialysis, Sweden470设备
CMA 20 探针用分路管CMA Microdialysis, Sweden8309019材料
体视显微镜Olympus, JapanSZ61设备
注射泵CMA MD AB, Sweden800310设备

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