建立典型脂肪胰腺肥胖大鼠模型的方法学开发与验证

摘要

本研究提供了一种可重复且标准化的方法，用于建立表现为单纯性肥胖（通常伴有脂肪性胰腺）的肥胖大鼠模型。同时包括胰腺组织取样和免疫组织化学的详细实验方案。

摘要

肥胖已成为全球主要的公共卫生流行问题，全球近一半人口被归类为超重或肥胖。肥胖个体的一个关键病理特征是脂质在非脂肪组织（包括胰腺）中的异位沉积，这种情况被称为胰腺脂肪变性或脂肪胰腺。在高脂饮食（HFD）诱导的啮齿类动物模型中，胰腺脂肪变性始终早于肝脏脂肪变性，突显了胰腺对脂质积聚的特殊易感性。这种早期受累使胰腺成为理解肥胖相关代谢紊乱的关键器官。尽管饮食诱导的肥胖（DIO）大鼠模型能够再现人类疾病进展的核心特征，但目前文献中仍缺乏对这一胰腺表型特征明确且可重复的动物模型。

在建立人类肥胖模型时，一个重要的方法学考虑因素是高脂饮食（HFD）引入的时间。许多现有模型在断奶期即开始给予HFD，这可能会引入混杂的发育期代谢编程效应，而这些效应并不能充分反映主要在发育完成后才发生的的人类肥胖。相比之下，本研究建立了一种标准化的实验方案，在断奶后才引入HFD。该方法更准确地模拟了人类成年后发生肥胖的常见轨迹，避免了生命早期的代谢适应，并导致更符合生理实际情况的胰腺脂肪变性进展过程。

本研究提供了一个详细且可重复的框架，用于构建以显著脂肪性胰腺病变为特征的肥胖大鼠模型。该方法包括1周的适应期、断奶后开始的14周高脂饮食诱导期，以及系统的组织采集。文中描述了两种组织处理途径：速冻处理用于分子分析（如蛋白质印迹），以及经多聚甲醛灌注固定用于形态学评估（如免疫组化、H&E染色）。该模型为深入研究与肥胖相关的胰腺代谢功能障碍机制提供了可靠的平台。

引言

单纯性肥胖是指在无其他合并症情况下独立存在的肥胖，主要归因于不健康的生活方式（如不合理的饮食模式和体力活动不足）所导致的能量失衡¹。肥胖显著推动了年轻人群中非传染性疾病发病率的上升，其特征为高患病率、发病年龄提前以及多系统并发症，已成为一项严峻的全球公共卫生挑战²。脂肪胰是一种在代谢紊乱过程中脂肪异位沉积于这一非脂肪器官的病理状态。脂肪胰反映了脂肪组织与胰腺生理病理之间的关键相互作用。过量的胰腺脂肪积聚会取代正常的腺泡和胰岛组织，导致外分泌和内分泌功能双重受损^3,4。这一病理过程会破坏α/β细胞比例，促进β细胞去分化，进而丧失胰岛素分泌功能⁵，并介导脂肪对β细胞的直接脂毒性损伤⁶。同时，α细胞增生及胰岛素释放失调会加剧血糖波动，加速向2型糖尿病（T2DM）及其相关并发症的进展⁷。

研究脂肪胰腺的发病机制揭示了代谢性疾病进展背后的新机制⁸。尽管以往的肥胖研究主要关注肝脏脂肪变性，但新近证据表明，胰腺脂质沉积是代谢紊乱中更早发生的事件⁹

方案

动物处理程序已获得南京中医药大学动物伦理委员会批准（编号：202006A016），并符合ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南、伦理准则、《1986年动物（科学程序）法》操作指南及相关指南，以及欧盟用于科学目的动物保护指令2010/63。所有实验动物在解剖前均按照批准的啮齿类动物麻醉程序进行麻醉。该程序分为三个独立部分。

1. 建立肥胖大鼠模型

1. 实验动物与分组
   1. 选取4周龄（80–120 g）对高脂饮食（HFD）敏感的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠作为实验动物。
   2. 所有大鼠先以维持饲料适应性喂养1周，随后随机分为两组：对照组和模型组。
   3. 1周后，模型组更换为HFD喂养，对照组继续维持原饲料喂养，两组均持续喂养14周。HFD配方详见表1，标准维持饲料配方见表2。
2. 饲养条件与实验参数
   1. 环境参数：温度22 ± 2 °C，湿度50 ± 10%，12 h光照/黑暗循环，自由饮水与进食。
3. 监测指标
   1. 每周固定时间记录体重和摄食量。
      注：傍晚测量可最大限度减少应激反应，并与昼夜节律活动模式保持一致^....

结果

我们描述了一种可重复的实验方案，用于建立一种能够稳定呈现脂肪性胰腺的简单肥胖模型（图1）。从动物喂养、组织采集到后续分子验证的整个流程在图1中以示意图形式进行了总结。记录了模型组（n = 5）和对照组（n = 5）的每周体重变化，在高脂饮食（HFD）喂养前，两组之间的体重无显著差异。而在喂食HFD后的相同时间段内，模型组的体重显著高于对照组，自第13周起体重增加超过20%（图2A）。请注意，图2中的W0表示适应性喂养结束后的起始时间点，W14则代表不同饮食喂养持续14周的时间段。如图所示，在初次分组后的0W时，两组间体重无统计学意义上的差异（P = 0.7318）。然而，在14W时，模型组的体重显著高于正常组，差异具有统计学意义（P < 0.0001），证实了模型建立成功（图2B）。我们主要以体重作为评估肥胖程度的标准。高脂血症和高血压.......

讨论

作为代谢综合征的主要驱动因素，单纯性肥胖是系统性脂质代谢紊乱的最初表现。若不进行干预，其可能进展为2型糖尿病（T2DM）及严重的糖尿病并发症，凸显了早期代谢纠正的必要性³⁰。胰腺脂肪变性（脂肪胰腺）是肥胖中异位脂质沉积的早期标志，它重新定义了胰腺为一种非经典的脂肪器官，挑战了传统的脂肪-肝脏轴心学说。这一转变对于阐明器官间代谢交互作用具有重要意义，有助于揭示能量失衡机制，并预防肥胖相关疾病（如T2DM、非酒精性脂肪性肝病[NAFLD]）^31,32,33。新兴研究提出非酒精性脂肪性胰腺病（NAFPD）作为一种新的临床实体，与代谢综合征密切相关³⁴。值得注意的是，儿童NAFPD与NAFLD的加速进展相关，表现为严重的肝脂肪变性、肝损伤和肝纤维化，因此NAFPD被视为T2DM、胰腺炎及脂肪肝疾病早期诊断和干预的战略性生物标志物^3.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>材料
1.5 mL 微型离心管	博奥森生物科技有限公司	BS-15-M	WB
2 ml 冻存管	LABSELECT	CV-002-200-EX	WB
2ml 研磨管	武汉赛维尔生物科技有限公司	HT-200-M	WB
3% H2O2	Booster Electronics Technology Co., Ltd.	20A23C	免疫组织化学
4% 多聚甲醛	百奥舍生物工程有限公司	BL539A	灌注胰腺解剖手术
5% BSA 溶液	Biofroxx	4240GR100	免疫组织化学
50 mL 离心管	博硕生物科技有限公司	BS-500-M	组织保存
AccuWest ECL Plus，Raegent A	南京基因易生物科技有限公司	Q201220	WB
AccuWest ECL Plus，Raegent B	南京基因易生物科技有限公司	Q201220	WB
无水乙醇	上海 SCR-生物技术有限公司	10009257	免疫组织化学
抗兔 IgG，HRP 标记抗体	Cell Signaling Technology, Inc.	7074	WB
cOmplete蛋白酶抑制剂混合物	罗氏有限公司	82256300	WB
盖玻片	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD	10212450C	免疫组织化学
DAB显色液	Booster Electronics Technology Co., Ltd.	AR2017-1	免疫组织化学
镊子	深圳瑞沃德生命科学有限公司	SP0007-M	SD大鼠解剖
载玻片	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD	188105	免疫组织化学
玻璃染色缸	上海碧云天生物技术有限公司	FG010	免疫组织化学
苏木精	上海碧云天生物技术有限公司	ST2067-20g	免疫组织化学
高脂饮食	苏州双实实验动物饲料科技有限公司	表1	实验动物饲喂
盐酸酒精	上海碧云天生物技术有限公司	C0163M	免疫组织化学
异氟烷	深圳瑞沃德生命科学有限公司	R510-22-10	麻醉的大鼠
甲醇	Biofroxx	67-56-1	WB
MOPS 电泳缓冲液 液体 20×	南京金斯瑞生物科技有限公司	C36842504	WB
中性树胶	北京索莱宝科技有限公司 &科技有限公司	G8590	免疫组织化学
中性树脂	上海 SCR-生物技术有限公司	G8590	免疫组织化学
PBS 溶液	江苏凯基生物技术股份有限公司	KGL2206-500	组织保存
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	ZB382867
Pierce BCA 蛋白质定量检测试剂盒	赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	ZB382867	WB
蛋白酶抑制剂混合物	罗氏有限公司	82256300
PVDF膜（Immobilon-P Transfer Membrane，Millipore，0000380346）	默克密理博	0000380346	WB
RIPA裂解缓冲液	百奥锐生物工程有限公司	BL504A, 70096436	WB
SABC	Booster Electronics Technology Co., Ltd.	20C03A	免疫组织化学
生理盐水	山西晟高动物药业有限公司	270071460	组织保存
SD雄性大鼠	江苏集萃药康生物科技股份有限公司	D000017	大鼠
柠檬酸钠	默克生命科学	S1804	免疫组织化学
标准维持饲料	苏州双实实验动物饲料科技有限公司	表2	实验动物喂养
eBlot L2 平衡浓缩液 5×	南京金斯瑞生物科技有限公司	C97212410	WB
eBlot L2 转移浓缩液 5×	南京金斯瑞生物科技有限公司	C97211504	WB
Tris缓冲盐溶液，粉末	百奥锐生物工程有限公司	BL602A	WB
Tween 20	Biofroxx	EZ681A3EA8	WB
urethane	Sigma-Aldrich 公司	U2500-100G	麻醉大鼠
Vinculin 多克隆抗体	Proteintech Group, Inc	26520-1-AP	WB
二甲苯	南京试剂有限公司	C0430530223	免疫组织化学
Young PAGE，Bis-Tris，10×8	南京金斯瑞生物科技有限公司	C33152505	WB
<强>仪器设备
麻醉机	深圳瑞沃德生命科学有限公司	Model R5805	麻醉的大鼠
球磨机	Retsch Technology GmbH - Microtrac	MM400	WB
离心机	Eppendorf SE	5418R	WB
计算机化生物组织干燥仪	浙江金华科迪仪器有限公司	SC2013-G-KIT	免疫组织化学
增强型化学发光（ECL）试剂	VILBER 生物成像	00170961	WB
切片机	赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	HM325	免疫组织化学
微波	上海博迅实业有限公司	97000	免疫组织化学
Mini-PROTEAN Tetra 系统	伯乐生命科学公司	1658004	WB
烤箱	上海晶鸿科学有限公司	DNP-9082	免疫组织化学
纯水	四川优普超纯科技有限公司	ULUP-TEZ	免疫组织化学