建立典型脂肪胰腺肥胖大鼠模型的方法的开发和验证

Summary

本研究提供了一种可重复和标准化的方法，以建立表现出简单肥胖（通常以脂肪胰腺为特征）的肥胖大鼠模型。它还包括胰腺组织取样和免疫组织化学的详细方案。

Abstract

肥胖已成为一种主要的全球健康流行病，目前世界上近一半的人口被归类为超重或肥胖。肥胖个体的一个关键病理特征是非脂肪组织（包括胰腺）中的异位脂质沉积——这种情况称为胰腺脂肪变性或脂肪胰腺。在高脂肪饮食 （HFD） 诱导的啮齿动物模型中，胰腺脂肪变性始终先于肝脂肪变性，这凸显了胰腺对脂质积累的特殊易感性。这种早期参与使胰腺成为了解肥胖代谢失调的关键器官。尽管饮食诱导的肥胖 （DIO） 大鼠概括了人类疾病进展的核心方面，但可靠地表现出这种胰腺表型的特征明确的动物模型在文献中仍然很少。

模拟人类肥胖的一个重要方法学考虑因素是引入 HFD 的时间。许多现有模型在断奶期间启动 HFD，这可能会引入混杂的发育代谢编程效应，这些影响不能完全反映人类肥胖，而人类肥胖主要在发育后发展。相比之下，本研究建立了一个标准化方案，其中在断奶后引入 HFD。这种方法更准确地模仿了肥胖在成年期发病的常见人类轨迹，避免了生命早期的代谢适应，并导致更生理相关的进展为胰腺脂肪变性。

这项研究为生成以突出的脂肪胰腺病理学为特征的肥胖大鼠模型提供了一个详细且可重复的框架。该方法包括 1 周的适应阶段、断奶后开始的 14 周 HFD 诱导期以及系统组织采集。描述了两种组织处理途径：用于分子分析的速冻（例如，蛋白质印迹）和用于形态学评估的多聚甲醛灌注固定（例如，IHC，H&E）。该模型为肥胖相关胰腺代谢功能障碍的机制研究提供了一个强大的平台。

Introduction

单纯性肥胖被定义为独立存在且没有其他合并症的肥胖，主要归因于不健康的生活方式导致的能量失衡，例如饮食模式不当和体力活动不足¹。肥胖显着导致年轻人群非传染性疾病发病率上升，其特点是患病率高、发病早发和多系统并发症，使其成为一项重要的全球公共卫生挑战²。脂肪胰腺是一种以代谢失调期间异位脂质沉积在这种非脂肪器官中为特征的疾病。脂肪胰腺反映了脂肪组织和胰腺病理生理学之间的关键相互作用。过多的胰腺脂肪堆积会取代正常的腺泡和胰岛组织，导致外分泌和内分泌能力的双重功能损害 ^3,4。这种病理过程破坏了α/β细胞比率，促进β细胞去分化，随后胰岛素^{分泌功能丧}失5，并介导对^β细胞的直接脂毒性损伤6。同时，α细胞增殖和胰岛素释放失调会加剧血糖不稳定，加速进展为 2 型糖尿病 （T2DM） 及其相关并发症⁷。

研究脂肪胰腺的发病机制揭示了代谢性疾病进展的新机制⁸.虽然之前的肥胖研究强调肝脂肪变性，但新出现的证据表明胰腺脂质沉积是代谢失调的早期事件⁹。这种范式转变使得构建单纯性肥胖的双器官病理学模型成为可能，整合胰腺和肝脂肪变性¹⁰。研究它们的串扰可能会阐明跨疾病谱的关键途径，包括脂质代谢紊乱、肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病，为疾病机制提供新的见解¹¹。在胰腺的病理过程中，最初的表现是胰腺脂肪的显着沉积，并伴有胰腺脂肪细胞的大量扩张。这主要在胰头、颈部和身体区域的腹侧观察到，主要位于腺泡细胞和胰岛细胞之间的间质区域。同时，存在胰腺的慢性低度炎症，而内分泌和外分泌功能在这个阶段基本保持完整^12,13。广泛的脂肪浸润通过脂毒性进一步损害胰腺β细胞功能并抑制胰岛素活性。在此阶段，腺泡细胞逐渐被脂肪细胞取代，从而促进 T2DM^14,15 的发展。尽管糖尿病不是胰腺癌的独立危险因素，但有急性胰腺炎和糖尿病病史的患者患胰腺癌的风险显着升高¹⁶。

宏观解剖分析量化胰腺脂肪变性的严重程度和浸润模式，而微观水平的 IHC 评估表征腺泡细胞形态、核定位、空泡化频率和细胞群动态¹⁷。这种多模式方法从大体解剖观察到细胞分辨率 IHC，能够对整个疾病进展的胰腺病理学进行全面分期。本研究详细介绍了一个标准化方案，包括成年大鼠 1 周的适应、14 周的肥胖诱导以及用于形态学分析的优化胰腺组织处理，为研究脂肪变性相关的代谢紊乱建立了强大的框架。

Protocol

动物治疗程序已获得南京中医药大学动物伦理委员会（202006A016）的批准，并符合ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南、伦理指南、1986 年《动物（科学程序）法》作指南和相关指南、欧盟指令 2010/63，以保护用于科学目的的动物。所有实验动物在解剖前都按照批准的啮齿动物麻醉程序进行麻醉。该程序分为三个不同的部分。

1.建立肥胖大鼠模型

1. 实验动物和组
   1. 从对高脂肪饮食（HFD）敏感的品系中选择4周龄（80-120g）的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠。
   2. 让所有大鼠适应维持饮食一周，然后将它们随机分为两组：对照组和模型组。
   3. 一周后，模型组用HFD代替维持饮食，同时维持对照组原饮食。保持两组饮食 14 周。HFD组成详见 表1，标准维持饲料配方详见 表2。
2. 饲喂条件及实验参数
   1. 环境参数：温度22±2°C，湿度50±10%，12小时光/暗循环，自由取水和食物。
3. 监测指标
   1. 每周在固定时间记录体重和食物摄入量。
      注意：在晚上进行可以最大限度地减少压力并与昼夜/夜间活动模式保持一致¹⁸.
   2. 使用记录的数据绘制体重增长曲线。
   3. 将成功的肥胖建模定义为体重超过年龄匹配对照组的 20%。

成分	含量（克/千克）	提供的主要营养素
普通粉状饲料	365	碳水化合物、植物蛋白、脂肪、维生素复合物、矿物质等的基本营养供应
猪油	310	饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸
酪蛋白	250	必需氨基酸
胆固醇	10	胆固醇
纤维素和矿物质混合物	60	纤维、钙、磷、钠等
DL-蛋氨酸蛋氨酸/蛋氨酸氨基酸	3	必需氨基酸
酵母	1	B族维生素、β-葡聚糖等
氯化钠	1	氯化钠

表1：用于在大鼠模型中建立DIO的特殊HFD配方。 该表详细介绍了本研究中使用的模型组 HFD 的具体组成，该模型组从适应期结束到组织收集进行给药。

成分	内容	单位
湿气	12.196	%
粗蛋白 （CP%）	18.272	%
消化能量 （DE）	3.186	mcal/公斤
代谢能 （ME）	2.939	mcal/公斤
净能量 （NE）	2.228	mcal/公斤
醚提取物 （EE%）	4.417	%
粗纤维 （CF%）	3.677	%
钙 （Ca%）	0.991	%
Total Phosphorus	0.681	%
（总 P%）
Non-Phytate Phosphorus	0.19	%
盐	0.407	%
赖氨酸	1.118	%
可消化赖氨酸	0.813	%
蛋氨酸	0.53	%
苏氨酸	0.779	%
色氨酸	0.221	%
铜 （Cu）	22.06	毫克/公斤
铁（铁）	173.69	毫克/公斤
锰 （Mn）	102.1176	毫克/公斤
锌 （Zn）	60.3687	毫克/公斤

表2：大鼠标准维持饲料配方。 该表显示了标准维持饲料的配方，该饲料在适应阶段提供给所有大鼠，并在整个研究期间提供给对照组。

2. 组织采集

1. 术前准备
   1. 禁食治疗：安乐死前 12 小时限制食物，以尽量减少肠道内容物对生化分析的干扰。
   2. 麻醉： 通过吸入给予 异氟醚进行深度麻醉（诱导浓度 4%，维持浓度 1.5-2%）。麻醉机配备异氟醚蒸发器，麻醉剂浓度维持在1.5-2。作为制备的参考，在整个过程中，液体异氟醚的物理消耗量约为每只大鼠0.5mL-0.8mL。
   3. 监测麻醉深度：持续跟踪呼吸频率和角膜反射。在整个手术过程中保持持续的麻醉状态，以防止死后胰腺自身溶解。
   4. 管理麻醉不足：如果麻醉深度不足或意识复发，立即腹膜内给予 20% 聚氨酯进行补充麻醉 （50 mg/kg），并在继续之前重新检查生命体征。通过将聚氨酯粉末溶解在盐水中来制备 20% 的聚氨酯溶液。
      注：异氟醚麻醉是符合南京中医药大学实验动物中心伦理要求的方法。对于这种终末手术，腹腔注射 20% 聚氨酯可作为可接受的替代方案。然而，现有证据表明，异氟醚在啮齿动物中可能比氯胺酮具有更高的安全性¹⁹。
2. 新鲜组织采集
   1. 皮肤消毒：将75%乙醇快速喷洒全身（1-2秒），防止毛发污染腹部器官。
   2. 位置固定：将大鼠仰卧放在解剖台上，并用大头销将所有四肢牢固地固定。
   3. 用左手的镊子抓住腹部皮肤，用右手的剪刀沿中线（从剑突到耻骨）切开皮肤。钝地解剖皮下筋膜以分离结缔组织，并沿同一中线切开腹直肌和腹膜。
   4. 胰腺识别：轻轻地将肠道向左移位，以观察胃、脾脏和十二指肠。脾附着在胰腺尾部，胃靠近胰腺。
   5. 快速解剖：用镊子轻轻抬高脾脏，并通过逐渐切断胰腺与脾脏、胃和十二指肠系膜的附着物来隔离胰腺。由于其质地脆弱，避免直接夹紧胰腺实质，并保留胰管/血管以防止组织撕裂。
   6. 组织保存：用冰冷的PBS（1×磷酸盐缓冲盐水，PH 7.4）或生理盐水快速冲洗解剖的胰腺，以去除残留的血液。立即将胰腺转移到2mL冷冻管中，在30秒内浸入液氮中，并在-80°C下长期储存。
   7. 安乐死和尸体处理 组织收集后，通过颈脱位对所有实验大鼠实施安乐死。根据南京中医药大学实验动物中心的规定，动物尸体被列为病理性生物医学废物（废物代号：831-003-01）。所有动物尸体按规定密封在密封袋中，并统一存放在指定的冷冻室中。大学将进行集中、环保的处置。在任何情况下都不应随意丢弃尸体。
      注意：避免室温暴露，以防止生物分子酶促降解^20,21。
3. 灌注组织采集（其余步骤相同）
   1. 暴露心脏：左手提起大鼠的皮肤组织，右手打开胸腔，使心脏充分暴露。
   2. 准备左心室灌注：在左心室做一个小切口（大小与灌注针直径相匹配）并切开右耳廓，让血液流出。
   3. 灌注生理盐水：将灌注针轻轻插入左心室，以10mL/min的流速缓慢灌注100mL生理盐水，直至右心房流出变得清晰。
   4. 灌注固定剂：改用 200 mL 的 4% 多聚甲醛固定剂，流速：5 mL/min。用100mL生理盐水灌注每只大鼠，然后灌注200mL4%多聚甲醛。本研究使用了商业制备的PFA溶液。由于PFA在溶液中的不稳定性，根据制备和新鲜度的不同，具有显着的变异性，因此液体溶液必须避光并在4°C下储存。 及时使用打开的等分试样以确保功效。如果由粉末制备，则溶液应在使用前立即新鲜制作。
      注意：戴上手套、护目镜和实验室外套;在通风橱中进行，因为多聚甲醛有毒。根据南京中医药大学实验动物中心的规定，多聚甲醛废物被归类为化学生物医学废物（废物代号：831-004-01）。使用后，必须将其存放在标有生物危害符号的专用废物容器中。集中处置由大学进行。在任何情况下都不得不当丢弃。
   5. 确认灌注成功：检查肢体僵硬，表明有效固定。
   6. 将胰腺放入含有 30 mL 4% 多聚甲醛溶液的 50 mL 离心管中。通过将管子静止存放在黑暗中 2-4 小时来固定组织。
   7. 将胰腺转移到含有 30 mL 70% 乙醇溶液的新 50 mL 离心管中。保持管子静止并避光约 20-24 小时²²。
   8. 石蜡包埋：将组织包埋在石蜡中。将嵌入的组织储存在4°C或-20°C。
      注意：这项研究使用石蜡切片。冷冻切片是一种有效的替代方案，但必须事先验证特定切片类型的抗体性能，以确保最佳结果。

3.胰腺免疫组化（IHC）染色

1. 切片和安装协议
   1. 石蜡切片：使用切片机切割厚度为 6 μm 的组织切片并安装到载玻片上。
   2. 漂浮法：将切片漂浮在40°C的组织浮选浴上以抚平皱纹。
   3. 组织收集：将切片安装到涂有粘合剂的载玻片上（每张载玻片 2-3 张），并在 80 °C 载玻片加热器上干燥。
   4. 载玻片干燥：切片后将装有切片的载玻片转移到 60 °C 的烘箱中过夜。
2. 脱蜡和再水化方案
   1. 将载玻片放入载玻片架中，按如下方式依次浸泡：二甲苯I，7分钟;二甲苯 II，7 分钟;无水乙醇，5分钟;90% 乙醇，5 分钟;85% 乙醇，5 分钟;75% 乙醇，5 分钟;蒸馏水，5分钟;PBS，5 分钟（三次）。
      注意：戴上手套和护目镜在通风橱中执行二甲苯步骤。按照步骤2.3.4为多聚甲醛指定的相同方案处理二甲苯废物。
3. 抗原修复方案
   1. 柠檬酸钠溶液的制备：制备柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）。我们使用自行制备的柠檬酸钠缓冲溶液，将一包粉末溶解在 1 L 水中。
   2. 依次微波炉加热：将载玻片放入装有柠檬酸钠缓冲溶液的玻璃染色罐中以覆盖载玻片，然后将罐子放入微波炉中。样品按以下顺序进行微波处理：中火（600 W）8 min，然后静置不加热8 min，最后小火（300 W）7 min。
   3. 自然冷却至室温：让容器自然冷却至室温。
   4. PBS：在PBS中冲洗载玻片5分钟两次。
4. 烘箱孵育
   1. H₂O₂：将 3% H₂O₂ 涂抹在组织切片上 10 分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。向每张载玻片涂抹约 50 - 80 μL H₂O₂ 。
   2. PBS：在PBS中洗涤载玻片5分钟3次。
   3. Strept-亲和素-生物素-过氧化物酶复合物 （SABC）：将 SABC 滴加到组织上，并在 37°C 培养箱中染色 30 分钟。向每张载玻片涂抹约 50 - 80 μL SABC。
   4. PBS：在PBS中洗涤载玻片5分钟3次。
5. 显色性
   1. 3,3'-二氨基联苯胺 （DAB）：将 DAB 显色溶液涂抹在组织切片上并监测直至形成棕黄色。对切片进行染色约 1-5 分钟。根据组织特异性和环境温度调整染色持续时间。对于胰腺组织，建议在22°C下染色时间为2分钟。
   2. 冲洗：立即在温和的蒸馏水流下冲洗载玻片以停止反应。
   3. 浸入：将载玻片浸入蒸馏水中 5 分钟以去除残留试剂。
6. 苏木精染色
   1. 苏木精：将载玻片浸入苏木精中 1 分钟。苏木精溶液使用纯水以56mg / mL的比例制备。
   2. 冲洗：在蒸馏水中冲洗载玻片两次（每次冲洗 5 秒）。
   3. 盐酸-醇分化：在盐酸-醇分化溶液中区分载玻片1秒。
   4. 浸入：将载玻片浸入自来水中10分钟，形成稳定的蓝色核染色。
7. 脱水：通过以下溶液依次脱水载玻片：70% 乙醇、80% 乙醇、90% 乙醇、无水乙醇、二甲苯 I 和二甲苯 II，分别在每种溶液中 3 分钟。
   注意：戴上手套和护目镜在通风橱中执行二甲苯步骤。
8. 密封
   1. 用中性香脂安装这些部分：使用橡胶球滴管将中性香脂涂抹在载玻片上。盖上盖玻片。避免用力压缩灯泡，以防止形成气泡。向每张载玻片涂抹约 50 μL 中性香脂。
   2. 风干：将载玻片放入通风橱中过夜，让中性树脂完全干燥。

4. 蛋白质印迹（WB）分析

1. 组织分解
   1. 取200mg大鼠胰腺组织，将其放入含有1mL裂解缓冲液和3个小钢球的2mL研磨管中。裂解缓冲液由完整的蛋白酶抑制剂混合物和RIPA裂解缓冲液组成。混合比例为1片蛋白酶抑制剂：50mL RIPA裂解缓冲液。
   2. 使用具有以下参数的球磨机进行研磨：频率：30/s;时间：30 秒;10-15次。直到肉眼看不到白色颗粒。
   3. 将上层蛋白质上清液转移到1.5mL微量离心管中，不要取任何泡沫。用 16900 x g 离心 30min，4°C。
      注意：用于蛋白质印迹分析的匀浆是从整个胰腺中制备的。
2. 蛋白质定量：根据制造商的说明，使用 Pierce BCA 蛋白质检测试剂盒定量蛋白质浓度。BCA工作溶液的混合比为溶液A：溶液B=50：1。
3. 蛋白质电泳：
   1. 将制备的胰腺蛋白样品（将体积为 6 μL 加载到每个泳道中）加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶-Young PAGE，Bis-Tirs，10 × 8 中进行电泳。
   2. 在 70 V 下运行 0.5 小时，然后使用 Mini-PROTEAN Tetra 系统在 110 V 下运行 1 小时。用纯水将 MOPS 电泳运行缓冲液 20×稀释至 1× 浓度。
4. 膜转移
   1. 使用纯水将转印浓缩液 eBlot L2 5× 稀释至 1× 工作浓度。这种 1× 转印缓冲液最多可重复使用 3 次。使用纯水将平衡浓缩液 eBlot L2 稀释为 5× 至 1×工作浓度。
   2. 将PVDF膜（Immobilon-P转印膜）切割成适当的尺寸（例如，7.5 cm× 5.5 cm）。孔径为0.45 um。
   3. 将大约 30 mL 甲醇倒入装有 90 × 60 × 32 mm 的孵育盒中。将PVDF膜浸入甲醇中5秒以激活它。
   4. 将大约 30 mL 制备的 1x 平衡溶液倒入另一个干净的培养箱中。小心地从电泳板上取出凝胶并将其放入平衡溶液中。
   5. 将活化的PVDF膜从甲醇中转移出来，并将其放入装有平衡溶液的孵育盒中。确保膜位于凝胶下方以正确接触。让两者平衡。
   6. 按照印迹设备制造商的说明，按以下顺序放置转移“三明治”：海绵、凝胶、PVDF 膜、海绵。确保层与层之间没有气泡滞留。将组装好的转印堆栈正确放入印迹装置室中。连接电源并以标准模式运行传输 15 分钟。
5. 块
   1. 准备两个孵育盒，一个装有约 15 mL TBST（Tris 缓冲盐水-Tween20），另一个装有约 15 mL 的 5% BSA 封闭溶液。
   2. TBST溶液的制备：将一袋Tris缓冲盐水粉溶解在2 L纯水中，然后加入2 mL吐温20。
   3. 将PVDF膜放入TBST溶液中，确保与凝胶接触的一侧朝上。
   4. 在室温下以 40 rpm 在摇床上洗涤 PVDF 膜 3-5 分钟。
   5. 将PVDF膜转移到封闭缓冲液中。在室温下以 20 rpm 的速度将其封闭在摇床上 1 小时。
6. 一抗孵育
   1. 在含有TBST的孵育盒中洗涤PVDF膜，在室温下以40 rpm在摇床上洗涤膜3次，每次5分钟。
   2. 在摇床上的另一个抗体孵育盒中，在 4°C（1：40000，纽蛋白多克隆抗体）下与一抗孵育过夜（14-18 小时），速度为 20 rpm。
   3. 确保抗体用5%BSA封闭溶液稀释，按照部分规定的比例制备。
7. 二抗孵育
   1. 将PVDF膜放入装有15mL TBST溶液的孵育盒中。在室温下在摇床上洗涤膜三次，每次5分钟，以40 rpm搅拌。
   2. 通过在5%BSA封闭缓冲液中以1：2000稀释抗兔IgG，HRP连接抗体来制备二抗。
   3. 在室温下以20 rpm的摇床孵育1小时²³。
   4. 按照上述方法，用TBST溶液洗涤PVDF膜3次，每次5分钟。
8. 检波
   1. 通过直接在培养盒中以 1：1 的体积比混合 AccuWest ECL Plus、Raegent A 和 AccuWest ECL Plus、Raegent B，制备工作底物溶液。在避光的情况下执行所有后续步骤。
   2. 将PVDF膜在溶液中孵育5-10秒，然后立即使用增强化学发光（ECL）试剂-Vilber Fusion FX6 MINI检测免疫反应条带。典型的曝光时间范围为 5 至 10 秒。

Results

我们描述了一种可重复的方案，用于建立可靠地表现出脂肪胰腺的简单肥胖模型（图1）。从动物喂养和组织采集到随后的分子验证的整个过程，如图1所示总结。记录模型组（n=5）和对照组（n=5）的每周体重变化，喂食HFD前两组体重差异无统计学意义。虽然模型组在喂养HFD后的同一时期体重明显高于对照组，但自第13周以来体重增加超过20%（图2A）。请注意，图 2 中的 W0 表示从适应性喂养结束开始的时间，而 W14 表示不同日粮喂养的 14 周期。如图所示，初始分组后，两组在0W时体重无统计学意义差异（P = 0.7318）。然而，在14W时，模型组的体重明显高于正常组，表现出统计学上的显着差异（P < 0.0001），证实了模型的成功建立（图2B）。我们主要以体重作为评估肥胖水平的标准...

Discussion

作为代谢综合征的主要驱动因素，单纯性肥胖代表了全身脂质代谢失调的初始表现。如果不进行干预，它可能会发展为 T2DM 和严重的糖尿病并发症，这凸显了早期代谢纠正的必要性³⁰。胰腺脂肪变性（脂肪胰腺）是肥胖症异位脂质沉积的早期标志物，它将胰腺重新定义为非经典脂肪器官，挑战了传统的脂肪-肝轴范式。这种转变为器官间代谢串扰提供了重要的见解，这对于阐明能量失衡机制和预防肥胖相关疾病（例如，T2DM、非酒精性脂肪性肝病[NAFLD]）^至关重要31,32,33。新兴研究提出非酒精性脂肪胰腺疾病 （NAFPD） 是一种新的临床实体，与代谢综合征密切相关³⁴。值得注意的是，儿科 NAFPD 与 NAFLD 加速进展相关，其特征是严重的肝脂肪变性、损伤和纤维化，将 NAFPD 定位为 T2DM、胰腺炎和脂肪肝疾...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<强>材料<强>
1.5毫升微型离心管	Biosharp生物工程有限公司	BS-15-M	华纳兄弟
2毫升冷冻管	实验室选择	CV-002-200-EX	华纳兄弟
2毫升研磨管	武汉服务生物科技有限公司	HT-200-M	华纳兄弟
3% H2O2	助推电子科技有限公司	20A23C	IHC
4% 对甲醛	Biosharp生物工程有限公司	BL539A	灌注胰腺夹层手术
5% BSA溶液	Biofroxx	4240GR100	IHC
50毫升离心管	Biosharp生物工程有限公司	BS-500-M	组织保存
AccuWest ECL Plus，雷根特A	南京基因易生物技术有限公司	Q201220	华纳兄弟
AccuWest ECL Plus，雷根特B	南京基因易生物技术有限公司	Q201220	华纳兄弟
无水乙醇	上海SCR-生物技术有限公司	10009257	IHC
抗兔IgG，HRP连接抗体	细胞信号技术公司，	7074	华纳兄弟
全蛋白酶抑制剂鸡尾酒	霍夫曼-拉罗什有限公司及nbsp;	82256300	华纳兄弟
封面单	CITOTEST 实验室制造有限公司	10212450C	IHC
DAB染色剂溶液	助推电子科技有限公司	AR2017-1	IHC
产钳	深圳后驱生命科学有限公司	SP0007-M	SD鼠的解剖
玻璃幻灯片及nbsp;	CITOTEST 实验室制造有限公司	188105	IHC
玻璃染色罐	上海碧昂泰姆生物技术有限公司	FG010	IHC
血液素	上海碧昂泰姆生物技术有限公司	ST2067-20g	IHC
高脂饮食	苏州双石实验动物饲料技术有限公司	表1	以实验动物为食
盐酸醇	上海碧昂泰姆生物技术有限公司	C0163M	IHC
异氟醚	深圳后驱生命科学有限公司	R510-22-10	麻醉老鼠
甲醇	Biofroxx	67-56-1	华纳兄弟
MOPS 运行缓冲液 20 & 次;	南京Genscript生物技术有限公司及nbsp;	C36842504	华纳兄弟
中性香脂	北京太阳生物科学与科技有限公司	G8590	IHC
中性树脂	上海SCR-生物技术有限公司	G8590	IHC
PBS解决方案	江苏科根生物技术有限公司	KGL2206-500	组织保存
皮尔斯BCA蛋白检测试剂盒	美国沃尔瑟姆的Thermo Fisher Scientific Inc。	ZB382867
皮尔斯BCA蛋白检测试剂盒	Hermo Fisher Scientific Inc，美国沃尔瑟姆	ZB382867	华纳兄弟
蛋白酶抑制剂组合	霍夫曼-拉罗什有限公司及nbsp;	82256300
PVDF膜（Immobilon-P转移膜，Milllipore，0000380346）	默克米利波尔	0000380346	华纳兄弟
RIPA裂解缓冲液	Biosharp生物工程有限公司	BL504A，70096436	华纳兄弟
南非广播公司	助推电子科技有限公司	20C03A	IHC
生理盐水	山西生高动物制药有限公司及nbsp;	270071460	组织保存
SD雄性老鼠	江苏宝石药业有限公司及nbsp;	D000017	老鼠
柠檬酸钠	默克生命科学	S1804	IHC
标准维护供电	苏州双石实验动物饲料技术有限公司	表2	以实验动物为食
平衡浓缩液 eBlot L2 5& 倍;	南京Genscript生物技术有限公司及nbsp;	C97212410	华纳兄弟
转移浓缩物eBlot L2 5×	南京Genscript生物技术有限公司及nbsp;	C97211504	华纳兄弟
Tris缓冲盐水、粉末及nbsp;	Biosharp生物工程有限公司	BL602A	华纳兄弟
二十岁以上	Biofroxx	EZ681A3EA8	华纳兄弟
聚氨酯	西格玛-奥尔德里奇有限公司	U2500-100G	麻醉老鼠
长生素多克隆抗体	蛋白质技术集团，	26520-1-AP	华纳兄弟
二甲苯	南京试剂公司	C0430530223	IHC
年轻的佩奇，比斯-提尔斯，10×8	南京Genscript生物技术有限公司及nbsp;	C33152505	华纳兄弟
<强壮>装备
麻醉机	深圳后驱生命科学有限公司	R5805型号	麻醉老鼠
球磨机与NBSP;	Retsch Technology GmbH - Microtrac	MM400	华纳兄弟
离心机	埃彭多夫东南	5418R	华纳兄弟
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迷你变形四元星系统	生物辐射实验室公司	1658004	华纳兄弟
烤箱	上海景宏科学有限公司	DNP-9082	IHC
纯净水	四川UPT超纯技术有限公司	乌鲁普-特兹	IHC