方法文章

哺乳动物中的大量排卵：Lagostomus maximus 自然自发性多排卵与诱导性多排卵的分析技术

DOI：

10.3791/69653

⸱

2026年2月6日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Estudios Biomédicos Básicos, Aplicados y Desarrollo (CEBBAD), Universidad Maimónides, 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了分析美洲大兔鼠（Lagostomus maximus）自然及诱导排卵的方法，包括在自发排卵、激素诱导排卵或精浆诱导排卵后获取卵母细胞的技术。该方案为研究一种高度多排卵哺乳动物模型的卵巢反应性及生殖生理学提供了全面的框架。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

南美洲平原刺豚鼠Lagostomus maximus被认为是哺乳动物中排卵率最高的物种，其排卵数量可高达300枚卵母细胞。这一显著的多排卵现象可通过多种方法学途径进行研究，以反映其独特的生殖生理特征。自然排卵通过在繁殖季节观察卵母细胞的释放来评估，这有助于了解该物种的自发性排卵机制，卵母细胞可通过冲洗输卵管和子宫角获得。此外，使用外源性激素（如促性腺激素）进行排卵的实验性诱导，可对卵巢反应性进行可控评估，并为理解豪猪型啮齿类动物的内分泌调控提供有价值的模型。第三种方法涉及使用同源精浆作为排卵的生理性触发因素，突显了该物种中诱导性与自发性排卵机制的共存。这些技术共同不仅阐明了卵泡募集和卵母细胞释放的动态过程，而且确立了L. maximus作为生殖生物学的比较模型，对理解哺乳动物排卵调控具有潜在的转化意义。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

南美洲平原刺豚鼠（Lagostomus maximus）是一种豪猪型啮齿动物，以其独特的生殖生理特征而著称，其排卵率极高，每个周期排出的卵母细胞数量可超过300个1,2。这一显著特征使L. maximus成为研究哺乳动物卵巢功能和排卵调控机制的天然模型3,4,5,6,7,8,9,10,11。

与典型的自发排卵动物不同，L. maximus 同时具有自发性和诱导性排卵机制2。这种双重特性，加上显著的卵泡生长和异步排卵现象，对仅依赖内分泌或组织学终点的传统研究方法提出了挑战4,12,13,14。因此，必须采用直接且定量的技术，以准确确定卵母细胞释放的时间和数量。

成年雌性美洲兔鼠来自阿根廷布宜诺斯艾利斯省贝拉泽圭市帕拉瓜伊罗拉公园内野生物种繁育站（ECAS）所维持的自然栖息种群（南纬34°49′57″，西经58°06′12″）。我们承认自然资源的主权权利专属于布宜诺斯艾利斯省。捕获动物的数量已获得布宜诺斯艾利斯省农业部的批准。雌性个体通过在洞穴入口处设置活体陷阱，在一年中不同时间点进行捕获。

根据 Llanos & Crespo15 确定的物种自然繁殖周期，并结合我们野外工作的经验7,8,10,14，对采样时段进行了选择。该物种存在一个主要繁殖期，从夏末（3月）持续至次年9月下旬春季初期16,17,18，此外还有一个次级繁殖期，出现在10月份，尤其多见于失去幼崽的雌性个体15。据此确定了以下工作分组：a）第一组（N=27）：2月下旬至4月上旬（非妊娠期，主繁殖期开始阶段）；b）第二组（N=26）：9月中旬至10月下旬（非妊娠期，哺乳后期发情）；第三组（N=35）：12月至1月（非妊娠期，激素诱导排卵）；第四组（N=7）：12月至1月（非妊娠期，精浆诱导排卵）。

本研究提出并验证了分析大西洋狼鱼（L. maximus）排卵的多种方法学途径：（1）通过直接回收卵母细胞评估自然排卵；（2）使用外源性促性腺激素诱导排卵；（3）利用自体精浆诱导排卵。每种技术均可为卵泡动态、卵母细胞成熟以及调控排卵的机制提供互补性见解。

冲洗输卵管和子宫角可直接回收卵母细胞，并对排卵进行准确定量，从而能够与卵泡发育和卵母细胞形态建立关联19,20,21。采用外源性促性腺激素进行激素刺激，该方案借鉴自实验啮齿类动物所用的方案22，可实现对卵巢反应性及卵母细胞释放时间的可控性评估。同时，使用自体精浆作为排卵的生理性触发因素——此前已在诱导排卵动物（如兔和骆驼科动物）中有所报道23,24,25——为探索参与排卵过程的内分泌和旁分泌因子提供了一种创新手段。

通过整合这些互补的方法，本研究为探究排卵机制提供了一个可重复的框架 L. maximus自然模型与诱导模型的结合可区分自发性卵泡募集、排卵效率以及精浆介导的反应。此外，这些方法还能揭示诸如自发性孤雌激活卵母细胞以及共存现象 "有缺陷的" 和 "排卵性" 卵母细胞，有助于深入理解卵泡选择和卵母细胞发育潜能2.

除了其物种特异性的意义之外，美洲栗鼠模型在比较生殖生物学中具有更广泛的参考价值。其混合排卵策略兼具诱导排卵和自发排卵物种的特征，为其他哺乳动物（包括家畜和人类）的生殖过程提供了有价值的参照7,14,26,27。

本文所述的方法学方案旨在确保实验的可重复性，并促进其在涉及卵泡动态、排卵调控及激素干预等不同实验环境中的应用与调整。

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方案

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本文所述实验方案已通过马伊蒙尼德斯大学实验动物使用与护理机构委员会（CICUAE，Universidad Maimónides，方案编号 #6184）的审查与批准。捕获、操作及安乐死操作均由经过培训的技术人员执行，符合所有地方、州和联邦关于实验动物护理与使用的法规。动物饲养遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》28 以及哺乳动物学会（ASM）关于在研究中使用野生哺乳动物的指南29。所有实验均符合 ARRIVE 2.0 指南30。已尽一切努力减少所用动物的数量。南美洲平原刺鼠（Lagostomus maximus）不被视为濒危物种31。

1. 激素诱导排卵

​注意：本部分介绍对捕获的非妊娠雌性美洲兔鼠进行激素诱导排卵的方法。讨论了三种不同的方案选择。

  1. 方案A：
    1. 在0小时和24小时时，分别肌肉注射200 IU马绒毛膜促性腺激素（eCG），随后在48小时时注射500 IU人绒毛膜促性腺激素（hCG）。
    2. 注射后让雌性动物休息，直至实施安乐死。
    3. 在注射hCG后60–132小时实施安乐死（见第3节）。
  2. 方案B：
    1. 在0小时和24小时时，分别肌肉注射200 IU马绒毛膜促性腺激素（eCG），随后在72小时时注射1,000 IU人绒毛膜促性腺激素（hCG）。
    2. 注射后让雌性动物休息，直至实施安乐死。
    3. 在注射hCG后60–132小时实施安乐死（见第3节）。
  3. 方案C：
    1. 在0小时、24小时和48小时时，分别肌肉注射250 IU马绒毛膜促性腺激素（eCG），随后在72小时时注射2 mg猪黄体生成素（pLH）。
    2. 注射后让雌性动物休息，直至实施安乐死。
    3. 在注射pLH后60–132小时实施安乐死（见第3节和表1）。
      注：每组动物在不同时间点被实施安乐死（范围为注射hCG后60至132小时）。这种时间上的分布对于确认该物种排卵期延长的特性至关重要。具体而言，在旨在 exclusively 收集成熟卵母细胞的实验中，安乐死均在注射hCG后120小时进行。

2. 精浆诱导排卵

注意：通过肌肉注射法，在经激素预处理的雌性个体中检测精浆诱导排卵的能力。

  1. 精液采集与制备
    1. 采用电刺激射精法从具有生殖活性的雄性个体采集精液，具体方法参照Giacchino32的描述。
    2. 在室温下以200 × g离心10分钟，沉淀精子细胞及细胞碎片。
    3. 向 supernatants（精浆）中添加青霉素和链霉素，于-20 °C保存备用。
  2. 利用精浆诱导未妊娠雌性个体排卵
    1. 对每只雌性个体在0 h和24 h时分别肌肉注射200 IU的eCG。
    2. 在最后一次注射eCG后48 h，肌肉注射精浆。
    3. 注射后让雌性个体静养直至实施安乐死。
    4. 在注射精浆72 h后实施安乐死（见第3节）。
      注：应设置对照组雌性个体，以生理盐水替代精浆进行注射。

3. 麻醉、安乐死与生殖道采集

注意：使用麻醉和人道安乐死方法获取完整的生殖道，用于卵母细胞和组织学分析。

  1. 根据制造商的建议和既定的机构方案，通过单次计算剂量的肌肉注射给予13.5 mg/kg盐酸氯胺酮和0.6 mg/kg盐酸赛拉嗪，诱导安乐死。
  2. 通过检测对疼痛无反应（足底反射）确认深度麻醉状态。
  3. 将动物置于仰卧位，并对腹部进行消毒。
  4. 外科手术打开腹腔，充分暴露所有腹腔器官。
  5. 进行总体检查以评估动物的整体状况，并通过观察排卵斑痕的存在确认自然或激素诱导的排卵。
  6. 通过直接穿刺上腔静脉采集血液样本，用于血清学检测。
  7. 通过心内注射0.5 mL/kg戊巴比妥钠对动物实施安乐死。
  8. 仔细解剖并取出卵巢、输卵管和子宫角，注意避免损伤其结构。
  9. 将组织置于冰冻的磷酸盐缓冲液（PBS）中，直至处理（≤15分钟）。

4. 卵母细胞回收

注意：通过轻柔冲洗输卵管和子宫角回收卵母细胞，以确保完全收集释放的配子，同时尽量减少组织损伤。

  1. 将一支钝化的26号针头连接到装有0.9% NaCl的1 mL注射器上，NaCl中添加4 mg/mL BSA、100 µg/mL青霉素G和100 IU/mL链霉素，以制备灌注装置。
  2. 将针头轻轻插入每侧输卵管的漏斗部，并缓慢注入灌注液。
  3. 将远端输卵管和子宫角流出的液体收集至无菌培养皿中。
  4. 重复灌注操作，直至回收的液体变得澄清，且无可见卵母细胞或细胞碎片。
  5. 将卵母细胞转移至含有4 mg/mL BSA和抗生素的M2培养基液滴（100 µL）中，并覆盖石蜡油。
  6. 在体视显微镜下检查液滴以确认回收成功；应观察到无卵丘细胞包裹、游离分散于液体中的卵母细胞。
  7. 继续灌注，直至流出液清晰且在体视显微镜下未见新增卵母细胞（通常每侧输卵管需灌注3–5次）。
    注意：回收的卵母细胞在低倍镜下应呈球形且半透明。
  8. 根据第6节所述的形态完整性标准对卵母细胞进行分类。

5. 卵母细胞形态学评估

注意：根据卵母细胞的胞质形态、透明带均匀性以及核成熟阶段来评估回收卵母细胞的质量。

  1. 若卵母细胞呈球形、透明带均匀、胞质均一透明，并可见生发泡或第一极体，则判定为正常。
  2. 若胞质呈暗色、颗粒状或碎片化，或透明带不规则，则判定为异常。
  3. 记录核成熟阶段为生发泡期（GV）、生发泡破裂期（GVBD）或第二次减数分裂中期（MII）。

6. 卵母细胞核成熟及减数分裂纺锤体完整性的评估

注意：通过α-微管蛋白免疫荧光染色及染色质复染来评估核成熟和纺锤体形态。

  1. 用 2% 多聚甲醛（PFA）固定卵母细胞 20 分钟。
  2. 在含 0.2% Triton X-100 的 PBS 中透化处理 40 分钟。
  3. 再次用 2% PFA 固定 20 分钟，并用 PBS 洗涤三次（每次 30 分钟）。
  4. 用含 2% 山羊血清、2% BSA、2% 脱脂奶粉、0.1 M 甘氨酸和 0.01% Triton X-100 的 PBS 溶液封闭，时间不少于 1 小时。
  5. 在 4 °C 条件下，用小鼠抗 α-微管蛋白抗体（1:200）孵育卵母细胞过夜。
  6. 用 PBS 洗涤 30 分钟，然后在避光条件下用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体（1:1000）室温孵育 1 小时。
  7. 用 10 µg/mL Hoechst 33324 染色 10 分钟，随后在含 2% BSA 的 PBS 中洗涤。
  8. 将卵母细胞置于抗荧光淬灭封片剂中，使用共聚焦显微镜进行成像。
  9. 使用 EZ-C1 软件（EZ-C1 版本 3.90）采集和处理图像；根据需要在图像处理软件中调整对比度和亮度。
    注意：染色成功的表现为可见清晰的绿色荧光信号（显示减数分裂纺锤体，FITC 标记），以及 Hoechst 33324 染色的蓝色细胞核复染信号。

7. 统计分析

注意：分析定量数据，以比较不同实验组之间的排卵反应和卵母细胞质量。

  1. 以均值 ± 标准差表示数据。
  2. 两组比较采用学生 t 检验。
  3. 多组比较采用单因素方差分析，随后进行 Bonferroni 事后检验。
  4. 认为 p < 0.05 具有统计学显著性。

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结果

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自然排卵

在27只从2月下旬至4月中旬（对应主要交配季节）捕获的雌性个体（I组）中，有12只被观察到处于排卵状态；而在次要交配季节（9月/10月）（II组）捕获的26只雌性中，有10只表现出排卵。两个捕获时期的排卵雌性比例均约为40%，成功率相似。所有个体均未观察到输卵管壶腹部区域出现肿胀，且无论是否存在排卵斑痕，均可从雌性个体中获取卵母细胞（图1A，B）。所获取的卵母细胞呈裸露状态，即未被颗粒细胞包裹（图1C，表2）。

每只雌性个体平均获得154个（± 87）卵母细胞，范围为29至326个，组I（198 ± 92［均值 + 标准差］，范围33–326）与组II（均值116 ± 66，范围29–204）之间未发现统计学显著差异（表2）

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讨论

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本文介绍的用于研究平原刺鼠排卵的实验方案，为评估自然发生及实验诱导的排卵事件提供了一个可重复的框架。该方案的主要优势在于能够直接定量并表征平原刺鼠所释放的极大量卵母细胞，这一特征在其他哺乳动物模型中无与伦比。与基于激素谱或组织学切片的间接方法不同，输卵管和子宫冲洗法可直接获得完整的卵母细胞，从而实现定量与定性分析。该方法还能保持卵丘-卵母细胞复合体（COCs）的完整性，这对于评估受精潜力和形态学质量至关重要。

另一个优势是其提供的方法学灵活性。通过将自然排卵与激素诱导或精浆诱导的排卵相结合，该方案能够在同一物种内对不同的排卵触发因素进行比较分析。这种多样性使研究人员能够解析内分泌、机械性以及精液因素在排卵过程中的相对作用，而这一点在传统的实验室模型中难以实现。

该方案具有优势，因为灌流技术在不干扰正常排卵过程及器官的情况下即可获得卵母细胞。此外，由于卵母细胞的采集避免了穿刺操作，卵巢结构得以保留，从而可在同一实验设计中整合形态学、组织学和分子水平的分析。

该操作流程中的多...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在可能被视为影响所报告研究公正性的利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作得到了阿根廷迈蒙尼德斯大学校内财政资助以及阿根廷FONCYT-AMPCYT机构（项目编号PICT-2018-04619，授予NPL）的支持。作者特别感谢阿根廷布宜诺斯艾利斯省政府农业部门授权动物捕获工作；感谢布宜诺斯艾利斯省野生动物繁育站（ECAS）工作人员在动物诱捕与处理过程中提供的宝贵帮助；并感谢迈蒙尼德斯大学兽医临床中心（CCV-Universidad Maimónides）的兽医学博士Sergio Ferraris和兽医学博士Fernando Lange在麻醉和手术操作期间给予的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Adobe PhotoshopAdobe Systems Inc., USAN/A图像处理
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-Aldrich, USAA9647用于冲洗液和封闭缓冲液
离心机（用于精液处理）Eppendorf, Germany5417R精浆制备
共聚焦显微镜（C1 Eclipse E800）Nikon Ltd., JapanN/A卵母细胞成像
电射精器实验室自行设计；由家养哺乳动物用设备改装，适用于硬毛鼠科啮齿类动物N/A精液采集
Euthanyl（戊巴比妥钠，苯妥英钠）Brouwer S.A., 阿根廷N/A安乐死
FITC标记的山羊抗小鼠IgG（AP124F）Chemicon, USAAP124F二抗
苏木精-伊红染色试剂盒Sigma-Aldrich, USAVarious组织学
Hoechst 33324Thermo Fisher Scientific, USAH3570细胞核染色
盐酸氯胺酮Holliday Scott S.A., 阿根廷N/A麻醉
超净工作台Thermo Scientific, USAN/A无菌操作
光学显微镜Olympus, JapanBX51组织学
Lutropin-V（pLH）Bioniche Animal Health Care, 加拿大N/A激素诱导
M2培养基Sigma-Aldrich, USAM7167卵母细胞回收
矿物油Sigma-Aldrich, USAM8410卵母细胞培养
Novormon 5000（eCG）Syntex S.A., 阿根廷N/A激素诱导
Ovusyn（hCG）Syntex S.A., 阿根廷N/A激素诱导
多聚甲醛（PFA，2% 和 4%）Sigma-Aldrich, USA158127固定
青霉素GSigma-Aldrich, USAP3032培养基用抗生素
体视显微镜Leica Microsystems, GermanyM80卵母细胞识别
链霉素Gibco, Thermo Fisher Scientific, USA11860038培养基用抗生素
带钝头针头的注射器（1 mL）BD Biosciences, USA305219输卵管/子宫冲洗
Triton X-100Sigma-Aldrich, USAT8787透化处理
VectaShield封片剂Vector Laboratories, USAH-1000荧光封片
盐酸赛拉嗪Richmond Laboratories, 阿根廷N/A麻醉
二甲苯Sigma-Aldrich, USA534056脱蜡石蜡切片
α-微管蛋白单克隆抗体（小鼠抗α-微管蛋白，sc-5286 B7）Santa Cruz Biotechnology, USAsc-5286 B7用于减数分裂纺锤体免疫染色

参考文献

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