使用改良的瑞士滚转技术增强小鼠胃肌层空间映射

摘要

该方案概述了一种基于最初为小鼠肠道开发的“瑞士卷”技术改进的全胃免疫染色方法。

摘要

空间“组学”技术为研究胃神经肌肉器官单个细胞在其原生组织环境中的生物学及相互作用提供了前所未有的机会。然而，成功应用这些方法以及评估眼底、体和窦的结构和分子差异，需要持续的采样和组织定向。这里，我们报告了一种针对小鼠胃部的改良版“瑞士卷”技术，使所有主要解剖区域都能在一次冷冻切割中被嵌入并可视化。这种方法强调平面固定和精确定位，以生成具有可重复方向和质量的切片。本研究还优化了免疫荧光染色条件，以确保细胞标志物的高质量可视化。该方案实现了胃区域的全面并排比较，同时最大限度地减少组织损失和实验变异性。通过增强组织保存和空间定位，该方法为研究胃生物学的生理和病理学研究者提供了实用且可扩展的工具。

引言

胃是一个复杂的J形器官，连接食管与十二指肠¹。它分为三个主要解剖区域：眼底、窦和窦¹。胃被膜肌肉的每个区域都发挥着不同的生理作用，参与调节、顺从、食物排空和排空等关键胃功能 ^1,2。研究胃部生理和病理的变化需要对这些区域及其细胞结构进行详细分析。

为了可视化大面积组织，研究人员常采用“瑞士卷”技术，该技术最初为小鼠肠道3,4,5,6开发。本研究修改了瑞士卷技术，用于小鼠胃，建立了新的实验方案。胃首先被分为解剖区域，并以平坦的姿势固定。组织随后被仔细卷起并处理，进行冷冻切割。不当的瑞士滚筒会损伤脆弱的上皮结构，尤其是在肠道内，导致免疫染色的组织质量较差。保存固定良好、方向正确且细胞结构完整的组织对于高分辨率成像至关重要。这项工作提出了一种生成瑞士卷的新方法，将所有胃部区域纳入单一冷冻块。此外，还描述了针对胃被膜肌瘤优化的免疫荧光染色方案，从而实现对胃功能的详细评估。本方案为通过精心准备胃组织、瑞士卷处理和染色，获得高质量免疫荧光图像提供了全面指南。通过保留肌腱胃束的复杂形态，这种方法有助于更深入地理解其结构及其在健康和疾病中的功能。

方案

动物实验按照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》中的指导方针进行。这些方案已获得梅奥诊所机构动物护理与使用委员会（A48315-15）批准。梅奥诊所的动物护理及使用项目及设施已经过国际实验动物护理评估与认证协会（AAALAC）的审查并获得全面认证。试剂和所用设备列于 材料表中。

1. 瑞士卷法用于对甲醛（PFA）固定胃冷冻切割

1. 对C57BL/6J小鼠（8-10周龄） 进行 至少3分钟的吸入麻醉，随后进行宫颈脱臼以确保安乐死（遵循机构批准的方案）。
2. 切除食管、十二指肠以及腹侧和背侧间间，切除胃。
3. 将胃放入含有冷磷缓冲生理盐水（PBS）的硅胶涂层皿中。将食管、眼底、体和十二指肠固定为方向参考（见图1A）。切割方向在 图1A中用红色虚线表示。
4. 用木销剪刀和产钳小心去除附着的脂肪。
5. 沿十二指肠腹侧肠系膜和胃切至小体针，然后轻柔地将组织压平（见图1B）。
6. 使用装有PBS的转移移液器冲洗胃腔内残留的食物。
7. 轻轻拉伸张开的腹部，使其保持平坦（见图1C）。
   注意：避免过度拉伸（即超过原始尺寸的110%）以保护组织结构。
8. 将胃浸泡在冷的4%PFA中2分钟，轻微固定组织并方便翻滚。
9. 短暂固定后，再次将组织压平。
10. 沿虚线轮廓修剪腹部，形成适合滚动的均匀形状（见图1C）。
11. 将修剪好的胃组织放在浸有PBS的滤纸上（图1D）。
12. 将纸巾卷成瑞士卷状，并用牙签插入中心固定。
    注意：滚动过程中确保黏膜一侧朝上。一手用镊子握住十二指肠端，另一手引导牙签，遵循已发表方法的细微修改。
13. 卷好后，插入一根30克针以固定其形状，并以90°角弯曲以稳定卷起的胃（见图1E）。
14. 将卷起的组织固定在4%PFA中，4°C，固定6小时。
15. 将固定组织转移到30%蔗糖中PBS，并在4°C下培养12-16小时，以实现低温保护并防止冰晶形成。
16. 轻轻取出稳定针。
17. 将组织嵌入最佳切割温度（O.C.T.）的混合物中，使用一次性基模，然后在干冰上冷冻（见图1F）。
18. 完全冷冻后，将模具保存在-80°C。
    注意：避免在O.C.T.内，尤其是组织周围，使用气泡，因为它们会干扰切片。组织块可在-80°C下保存至少一年。
19. 切片前，在-20°C下平衡块体至少1小时。
20. 使用低温容器切片至5微米厚度。
    注意：5-12微米的厚度通常适合小鼠胃切面^7,8，并可根据实验需求进行调整。切片可在-20°C下保存长达3个月。

2. 胃肌组织的免疫荧光染色

1. 使用疏水屏障笔，在显微镜载玻片的每个组织切片周围绘制防水屏障。
2. 用冷的PBS清洗切片5分钟，以溶解残留的O.C.T.化合物。
3. 通过在室温（RT;21-23°C）下，用1%牛血清白蛋白（BSA）在PBS中培养切片1小时，阻断非特异性结合。
4. 用吸力去除1%的BSA，然后用冷PBS在RT（21-23°C）下清洗三次各10分钟。
5. 进一步通过在TT（21-23°C）下用小鼠对小鼠IgG阻断液在PBS中培养切片1小时，从而阻断非特异性结合，这样可以减少内源性IgG的结合并提高小鼠抗体IgG的特异性。
6. 用吸力去除阻塞液，然后用冷PBS在RT（21-23°C）下清洗切片三次，每次10分钟。
7. 在RT（21-23°C）重复BSA阻断1小时。
8. 用原版抗体培养切片。阳毒胺素-1（ANO1），KIT，β-微管蛋白III类（TUBB3），冷稀释于1% BSA和0.3% Triton X-100中。在另一个实验中，使用肌球蛋白重链11（MYH11）、E-钙粘蛋白和KIT。在4°C下孵育一夜（12-16小时）。
9. 用轻柔吸力去除初级抗体溶液。用冷PBS清洗这些部位三次，每次10分钟，温度在RT（21-23°C）下。
10. 用二级抗体培养切片。Alexa Fluor（AF）488抗兔IgG、AF555抗小鼠IgG和AF647抗山羊IgG（均为5 μg/mL;1：400），在1% BSA中，RT（21-23°C）下1小时。
11. 用吸力取出二级抗体溶液，然后用冷PBS在RT（21-23°C）下清洗切片三次，每次10分钟。
12. 用4′，6-二酰胺-2-苯吲哆酮（DAPI，稀释1：300）在RT（21°-23°C）下染色1小时。
    注意：神经元核通常表现出比其他胃肠细胞类型的DAPI信号更弱;建议至少潜伏1小时以获得最佳观察。
13. 用超纯水冲洗一次切片，去除残留的盐分。
14. 使用防褪色套装安装套。
15. 用非荧光漆封住封面的角落。用轻柔吸力去除多余的安装介质。然后，封闭封面的整个周边。

3. 利用共焦显微镜进行免疫荧光成像

1. 通过配置DAPI、AF488、AF555和AF647的激光和探测器，在共焦成像软件中建立多通道Z栈采集，确保光谱分离并避免信号饱和。
   注意：分别调整每个荧光团的激光功率和曝光时间，以防止串扰并保持信号在所有通道的动态范围内（见图2A）。
2. 在共軛焦成像软件中设置曝光参数，以避免像素饱和，并在高强度区域保持信号细节（见图2B）。
   注意：确保所有声道的信号都保持在动态范围内，且不达到饱和。
3. 要捕捉整个胃瑞士卷，使用大型图像采集设置（例如6×6场）（见图2C）;不过，这个设置应根据卷组织的整体大小和紧致度进行调整。
4. 在共焦成像软件中使用Z系列采集技术获取3D图像。N维（ND）采集的详细工作流程如 图2D所示。
5. 选择 Z堆栈 选项以启用Z系列成像。
6. 通过设置涵盖整个胃部全厚的上下焦点位置来定义Z范围。
7. 将腹部顶部聚焦，点击 顶部 按钮设定Z极限上限。
8. 将焦点调整到胃肌底部，点击 “底部 ”按钮设置下限Z。
9. 将Z叠加步数设为8步，以覆盖胃肌的全部深度。
10. 点击 立即运行 以启动Z栈图像采集。
11. 为单个和合并的荧光通道生成最大强度投影，以可视化二维图像中的三维数据。

结果

采用新方法，小鼠胃瑞士卷包括胃的三个主要区域：胃底、窦和窦，以及食管和十二指肠的一小部分。将整个胃纳入一个切片可以进行全面的区域分析（见图1）。对胃瑞士卷整体图像进行血液素和伊松（H&E）染色，显示所有区域的胃结构保存良好，使得黏膜、黏膜下层和肌肉层的清晰可见（见图3）。图4展示了Cajal间质细胞（ICC;产生节奏缓慢波的起搏细胞;通过KIT和ANO1识别）、肠神经元（协调肠胃肠道运动的神经元;通过TUBB3免疫染色识别）和细胞核（DAPI）间质细胞的代表性免疫荧光染色。在胃黏膜中，KIT也在Paneth和高脚细胞中表达，如先前报道的^9,10,11。ANO1在胃上皮中表达较高，尤其是在眼底柱状上皮细胞中，这与其在氯离子运输和黏膜分泌中的作用相符¹¹。此外，根据《人类蛋白图谱^》12,13号数据，TUBB3在某些胃内分泌细胞和分泌黏液细胞中也有表达。图5展示了MYH11标记的平滑肌细胞、E-cadherin标记的胃黏膜上皮细胞和KT标记的ICC的代表性免疫荧光染色。MYH11也在胃黏膜的肌纤维母细胞中表达，^此前已有报道。这些免疫荧光结果共同证实了我们的方案能够保留组织结构。

图1：用于冷冻切割的“瑞士卷”小鼠胃 。（A）取出后立即将整个胃放入黑色硅胶涂层解剖皿中，内含冷磷缓冲生理盐水（PBS），以保持组织完整性。（B）胃在十二指肠中点开口。（C）轻柔拉伸并固定腹部，使其平放且不施加过大张力。组织上会用一条红色虚线勾勒，指示应修剪的位置以便滚动。（D） 打开且固定的胃置于浸润PBS的滤纸纸上，准备卷成紧凑型态。红色箭头显示胃部翻滚的方向。（E）组织片段嵌入最佳切割温度（O.C.T.）化合物中，并冷冻在干冰上，准备冷冻切割。（F）冷冻块储存在−80°C，并以5微米厚度冷冻切开进行后续分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：Z栈成像过程中的ND采集设置和饱和可视化。 （A）共聚焦成像软件中配置的激光和探测器设置，用于多通道光谱成像。使用四种荧光团：4′，6-二酰胺-2-苯哆酮（DAPI）、Alexa Fluor 488（AF488）、Alexa Fluor 555（AF555）和Alexa Fluor 647（AF647），每个都配有相应的激发激光器和发射探测器。谱图显示激发和发射曲线，允许调整以最小化串扰并优化信号检测。（B）针对每个荧光团单独调整曝光设置，以避免像素饱和，并在高强度区域保持细节。（C） 大图像采集设置（例如6×6场）可视化整个胃瑞士翻滚;图像场大小应根据卷成组织的大小和紧凑度进行调整。（D） ND 获取窗口显示 Z 栈参数设置。Z区间通过选择胃肌的上下位置定义，设有八个步骤，以捕捉组织的全部深度以便进行三维（3D）分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：涂有血藻素和伊丝素的小鼠胃卷图像。 瓷砖扫描展示了能够可视化一只8周大的雌性C57BL/6J小鼠的整个胃部瑞士卷。主要解剖区域包括食管（红色虚线）、下食管括约肌（紫色虚线）、眼底（黑色虚线）、体（蓝色虚线）、窦（绿色虚线）和十二指肠（橙色虚线）。比例尺：1000微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：整颗小鼠胃的瑞士卷轴对焦图像：ANO1、KIT、TUBB3。 顶部面板：代表性缝合共聚焦图像，取自一只8周大的雌性C57BL/6J小鼠胃部瑞士卷，显示ANO1（绿色）、KIT（青色）、TUBB3（黄色）和细胞核（蓝色）的免疫染色。整个滚动的胃，包括眼底、窦和窦，都被可视化。比例条：1000微米。 底部面板：顶部白色虚线框勾勒出区域的放大视图，突出显示卡哈尔间质细胞（ANO1⁺ 和KIT⁺;黄色箭头）及肠神经元（TUBB3⁺;红色箭头）的细胞细节。比例条：100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：瑞士卷轴拍摄的全鼠胃共焦点图像：MYH11，KIT，E-钙卡赫林。 顶部面板：代表性缝合的共聚焦图像，取自一只8周大的雌性C57BL/6J小鼠的胃卷，显示MYH11（绿色）、KIT（青色）、E-钙粘蛋白（黄色）和核（蓝色）的免疫染色。整个滚动的胃，包括眼底、窦和窦，都被可视化。比例条：1000微米。 底部面板：由顶部面板白色虚线框框勾勒出的区域放大视图。白色虚线划分黏膜上皮（E-卡德蛋白）和肌肉层（MYH11）。白色箭头表示卡哈尔的KIT⁺ 间质细胞（ICC）。比例条：100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

通过新优化的胃卷法，胃的三个节段（眼底、窦和窦）以及食管和十二指肠均包含在一张切片中。这种全面的嵌入使研究人员能够分析整个胃的结构和分子变化，并降低试剂切片和染色的成本（见图1）。

在免疫染色过程中，将所有胃区同时暴露于相同的染色溶液中，可以确保一致性并提高准确性。对胃卷的免疫染色清楚显示了胃壁的不同层次。如 图4 和 图5所示，该方法能够可视化胃节段间的形态差异，并可检测ICC（KIT和ANO1）¹⁰、神经元（TUBB3）¹⁵、平滑肌细胞（MYH11）、黏膜上皮细胞（E-cadherin）和细胞核。

根据组织状况和研究目的，可能会做一些小的修改。例如，去除多余的附着脂肪有助于在固定时保持卷子的形状。调整切片厚度还可能有助于保护组织结构或改善对载玻片的粘连。另一种可能的改进是使用金属模具以实现更均匀的切割，就像肠道瑞士卷¹⁶那样。虽然该方案主要针对冷冻切割，但也可能适用于石蜡嵌入组织。石蜡嵌入保留组织结构完整性，而冷冻切割则能加快处理速度和更好的抗原保存，使其更适合免疫荧光。

这种方法确实存在局限性。肿大、纤维化或钙化的胃，常见于炎症、肥胖、糖尿病或衰老等疾病，更容易翻滚，且可能带来最佳染色（^17,18,19,20）的挑战。尽管存在这些限制，该技术相较于传统区域特定嵌入具有显著优势。在相同条件下处理所有胃区可以提高一致性，减少变异性，同时节省时间和试剂。

这种方法对于研究区域特异性变化尤为有用。它还支持对多种细胞类型的空间分析，并可与基于图像的定量结合使用。总体而言，这一新优化的胃Swiss-roll方法为健康和疾病领域的全面胃组织分析提供了实用且可扩展的平台。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#5SF 钳	精细科学工具	11252-00
牛血清白蛋白	西格玛-奥尔德里奇	A7906
ColdVision MC-LS LED 光源	肖特	MC-LS
共焦软件	尼康	尼康NIS-Elements成像软件
冷封XYL	斑点	9312-4
DAPI（4英尺，6-二酰胺-2-苯吲哆，地乳酸）	赛莫飞世尔科学	D3571
解剖盘，大型	生命系统 配器	SKU：DD-90
驴子反山羊 AF647 pAb	生命科技	A21447	Lot：1739289 RRID：AB_2535864
驴鼠防鼠 AF555 pAb	生命科技	A31570	批次：1774719 RRID：AB_2536180
驴子反兔子 AF488 pAb	生命科技	A21206	地块：2668665 RRID：AB_2535792
E-卡达林（1：400稀释）	生物科学学士	610181	地块：25510 RRID：AB_397580
伊欧辛	ELITech集团	$SS-071C
环氧涂层产钳	精细科学工具	11210-10
乙醇	西格玛-奥尔德里奇	459828-4L
软管 1.5 毫升	埃彭多夫	22364111
纱布海绵	渔业科学	22-362-178
硬化细剪刀	精细科学工具	14090-09
血液素	埃普雷迪亚	7211
KIT（0.2 和微型;g/mL;1：1000稀释）	R&D系统	AF1356	地块：IEO0217101 RRID：AB_354750
镜头清洁液 1盎司喷雾瓶	尼康	77013066
显微镜盖玻璃	费舍尔科学	12541016
显微镜载玻片	CardinalHealth	M6133A
民兵别针	精细科学工具	26002-20
MYH11（1：400稀释）	生物医学技术	BT-562	RRID：AB_10013421
指甲油	罪恶的色彩	7.33855E+11
针 30 克 x 1/2英寸 & nbsp;	生物科学学士	305106
对甲醛	西格玛-奥尔德里奇	158127-500G
Personna单刃刀	剃须刀片公司	76247-652
ReadyProbes鼠标对小鼠IgG阻断溶液（30倍）	赛莫飞世尔科学	R37621	Lot：3226230
SlowFade Diamond 防褪色装粉（装裟介质）	赛莫飞世尔科学	S36972
StainTray 10滑套染色系统	Simport 科学	M918-2
立体显微镜 0.8x-5x	尼康	SMZ645
蔗糖	西格玛-奥尔德里奇	S9378-1KG
Surface-Amps X-100（特里顿X）	赛莫飞世尔科学	28314
TMEM16A（ANO1：1：400稀释）	阿布卡姆	ab53212	拍品：GP3295656-1 RRID：AB_883075
转移移液器	猎鹰	357575
TUBB3（1：400稀释）	细胞信号传导技术	4466	拍品：5 RRID：AB_1904176
二甲苯	费舍尔科学	X3P-1GAL	很多206238