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利用改良的瑞士卷技术增强小鼠胃肌层的空间定位图谱

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DOI：

10.3791/69673

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2025年11月25日

 ,  ,  ,  , 
1Enteric Neuroscience Program and Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic College of Medicine and Science, 2Gastroenterology Research Unit, Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic College of Medicine and Science, 3Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic College of Medicine and Science

本文内容

摘要

本方案概述了一种改进自“瑞士卷”技术的全胃免疫染色方法，该技术最初是为小鼠肠道开发的。

摘要

空间“组学”技术为在天然组织环境中研究胃神经肌肉装置中单个细胞的生物学特性及其相互作用提供了前所未有的机遇。然而，这些方法的成功应用以及对胃底、胃体和幽门区域之间结构与分子差异的评估，依赖于一致的取样和组织定位。本文报道了一种针对小鼠胃优化的改良“瑞士卷”技术，可将所有主要解剖区域包埋并在单个冷冻切片中实现可视化。该方法强调扁平固定和精细定位，以获得方向一致、质量可重复的切片。本研究还优化了免疫荧光染色条件，以确保细胞标志物的高质量可视化。该方案能够在最小化组织损耗和实验变异的前提下，实现胃不同区域的全面、并行比较。通过提升组织保存效果和空间定位精度，该方法为在生理与病理条件下研究胃生物学的研究人员提供了一种实用且可扩展的工具。

引言

胃是一个复杂的J形器官，连接食管与十二指肠1。它可分为三个主要解剖区域：胃底、胃体和胃窦1。胃壁肌层的每个区域均发挥独特的生理作用，参与胃的关键功能，如容纳、顺应性、食物研磨和排空1,2。研究胃生理学和病理学的变化需要对这些区域及其细胞结构进行详细分析。

为了可视化大范围的组织区域，研究人员通常采用"Swiss roll"技术，该技术最初是为小鼠肠道研究而开发的3,4,5,6。本研究对该Swiss roll技术进行了改良，使其适用于小鼠胃组织，建立了一种新的实验方案。首先将胃分离为不同的解剖区域，并以展平的状态进行固定。随后小心地将组织卷起，并进行冷冻切片处理。不正确的Swiss roll操作可能会损伤脆弱的上皮结构，尤其是在肠道中，从而导致免疫染色所用组织质量下降。保持良好固定、方向正确且细胞结构完整的组织，对于高分辨率成像至关重要。本研究提出了一种新方法，可将所有胃区包含于单个冷冻包埋块中形成Swiss roll。此外，还描述了一种针对胃肌层的优化免疫荧光染色方案，从而实现对胃功能的详细评估。该方案为通过精细的胃组织制备、Swiss roll处理及染色步骤获得高质量免疫荧光图像提供了全面指导。通过保留胃肌层复杂的形态结构，该方法有助于深入理解胃肌层在生理和疾病状态下的结构与功能。

方案

动物实验遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中规定的准则进行。实验方案经梅奥诊所机构动物护理和使用委员会（A48315-15）批准。梅奥诊所的动物护理和使用项目及设施已通过国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）的评审并获得完全认证。材料表中列出了所用的试剂和设备。

1. 用于多聚甲醛（PFA）固定胃组织冷冻切片的瑞士卷技术

  1. 麻醉一只 C57BL/6J 小鼠（8–10 周龄） 通过 二氧化碳（CO₂）₂吸入麻醉至少3分钟，随后进行颈椎脱位以确保安乐死（遵循机构批准的实验动物安乐死操作规程）。
  2. 剪断食管、十二指肠以及腹侧和背侧胃系膜以取出胃组织。
  3. 将胃置于含有冷磷酸盐缓冲液（PBS）的硅胶涂层培养皿中。用针固定食管、胃底、胃体和十二指肠，作为方向参考。图1A切割方向由红色虚线指示 图1A.
  4. 使用圆头剪刀和镊子小心去除附着的脂肪组织。
  5. 沿十二指肠和胃的腹侧系膜剪开，直至体部的固定针处，然后轻轻展平组织图1B).
  6. 使用装有PBS的移液管冲洗胃腔内残留的食物。
  7. 轻轻拉伸打开的胃组织，以获得平坦的形态（图1C).
    注意：避免过度拉伸（即超过原始尺寸的110%），以保持组织结构的完整性。
  8. 将胃组织浸入冷的4% PFA中固定2分钟，以轻微固定组织并便于卷曲。
  9. 短暂固定后，再次将组织平铺并用针固定。
  10. 沿虚线修剪胃组织，以获得适合卷曲的均匀形状（图1C).
  11. 将修剪后的胃组织置于经 PBS 润湿的滤纸上图1D).
  12. 将组织卷成瑞士卷构型，并通过从中心插入牙签加以固定。
    注意：在卷绕过程中，确保黏膜面朝上。一手用镊子夹住十二指肠端，另一手引导牙签，参照已发表方法进行少量修改操作。
  13. 卷好后，插入一支30-G针头以固定其形状，并将其弯曲成90度角。° 角度以固定卷好的胃组织（图1E).
  14. 将卷好的组织在4% PFA中4℃固定6小时。随后轻轻移除用于固定的针。使用一次性底模将组织包埋于最佳切割温度化合物中。 °4°C 下固定 6 小时。
  15. 将固定后的组织转移至含30%蔗糖的PBS溶液中，4℃孵育 °在4°C下孵育12-16小时，以进行冷冻保护并防止冰晶形成。
  16. 轻轻取出固定用的针。
  17. 使用一次性底模将组织包埋于最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂中，随后在干冰上冷冻图1F).
  18. 完全冷冻后，将模具储存在 -80 ℃ °C.
    注意：避免在O.C.T.中产生气泡，尤其是组织周围，因为气泡会干扰切片。组织包埋块可保存于-80℃ °C 至少一年。
  19. 切片前，将样本块在 -20 ℃ 下平衡 °在4°C下固定至少1小时。
  20. 以 5-µ使用冷冻切片机切取 m 厚度的切片。
    注意：厚度为 5-12 µm 通常适用于小鼠胃部切片7,8，并可根据实验需求进行调整。切片可保存在 -20 °C，最长可保存3个月。

2. 胃肌组织的免疫荧光染色

  1. 使用疏水屏障笔在载玻片上的每个组织切片周围绘制防水屏障。
  2. 用预冷的PBS洗涤切片5分钟，以溶解残留的O.C.T.包埋剂。
  3. 用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS在室温（RT；21–23℃）下孵育切片1小时，以阻断非特异性结合。 °C)。
  4. 用吸管吸除1% BSA，随后在室温（21–23℃）下用预冷的PBS洗涤切片，每次10分钟，共洗涤三次。 °C)。
  5. 通过在室温（21–23℃）下用PBS中的鼠抗鼠IgG封闭液孵育切片1小时，进一步阻断非特异性结合。 °C），可减少内源性IgG的结合，从而在使用小鼠抗体IgG时提高特异性。
  6. 吸去封闭液，随后用预冷的 PBS 在室温（21–23 ℃）下洗涤切片，每次 10 分钟，共洗涤三次。 °C）。
  7. 在室温（21–23℃）下重复 BSA 封闭 1 小时 °C)。
  8. 用一抗孵育切片。一抗包括 Anoctamin-1 (ANO1)、KIT 和 β-微管蛋白 III 类 (TUBB3)，用含 0.3% Triton X-100 的冷 1% BSA 溶液稀释。在另一项实验中，使用肌球蛋白重链 11 (MYH11)、E-钙黏蛋白 (E-cadherin) 和 KIT。4 °C 下孵育过夜（12–16 小时）。 °C.
  9. 用柔和的抽吸法移除一抗溶液。在室温（21–23℃）下用冷的 PBS 洗涤切片，每次 10 分钟，共洗涤三次。 °C)
  10. 用二抗孵育切片。Alexa Fluor (AF) 488 标记的抗兔 IgG、AF555 标记的抗小鼠 IgG 和 AF647 标记的抗山羊 IgG（均为 5 µg/mL；1:400）溶于1% BSA，室温（21–23 ℃）孵育1小时 °C)。
  11. 用吸液法去除二抗溶液，随后在室温（21–23℃）下用冷的 PBS 洗涤切片，每次 10 分钟，共洗涤三次。 °C)。
  12. 用4对切片进行染色′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1:300 稀释）在室温（21℃）下孵育 1 小时°-23 °C)。
    注意：神经元细胞核的DAPI信号通常弱于其他胃肠道细胞类型；建议至少孵育1小时以实现最佳可视化。
  13. 用超纯水冲洗切片一次，以去除残留的盐分。
  14. 使用抗荧光淬灭封片剂封片。
  15. 用非荧光指甲油密封盖玻片的四个角。使用轻柔的吸力去除多余的封片剂。然后，密封盖玻片的整个边缘。

3. 使用共聚焦显微镜进行免疫荧光成像

  1. 在共聚焦成像软件中设置多通道Z轴堆栈采集，配置适用于DAPI、AF488、AF555和AF647的激光器和探测器，确保光谱分离并避免信号饱和。
    警告：针对每种荧光染料单独调整激光功率和曝光时间，以防止串扰，并确保所有通道的信号均处于动态范围内（图2A）。
  2. 在共聚焦成像软件中设置曝光参数，以避免像素饱和，并保留高强度区域中的信号细节（图2B）。
    警告：确保所有通道中的信号均处于动态范围内，未达到饱和状态。
  3. 为完整捕获胃部瑞士卷结构，使用较大的图像采集设置（例如6 × 6视野）（图2C）；但该设置应根据卷状组织的整体大小和紧密程度进行相应调整。
  4. 在共聚焦成像软件中使用Z序列采集模式获取三维图像。N维（ND）采集的详细工作流程见图2D。
  5. 选择Z-stack选项以启用Z序列成像。
  6. 通过设定包含整个胃壁全层厚度的顶部和底部焦点位置来定义Z轴范围。
  7. 将胃的上表面调至焦点清晰，点击Top按钮以设定Z轴上限。
  8. 调整焦点至胃肌层底部，点击Bottom按钮以设定Z轴下限。
  9. 将Z轴堆栈步数设为8，以覆盖胃肌层的全部深度。
  10. 点击Run now以启动Z轴堆栈图像采集。
  11. 对单个及合并的荧光通道生成最大强度投影，以在二维图像中可视化三维数据。

结果

采用新方法制备的小鼠胃部瑞士卷切片包含胃的三个主要区域：胃底、胃体和胃窦，同时在一个切片中还包含一小部分食管和十二指肠。将整个胃组织包含在单一切片中，可实现对各区域的全面分析（图1）。对胃瑞士卷全组织图像进行苏木精-伊红（H&E）染色显示，所有区域的胃部结构均得到良好保存，可清晰观察到黏膜层、黏膜下层和肌层（图3）。图4展示了卡哈尔间质细胞（ICC；即产生节律性慢波、介导肠道节律性运动的起搏细胞，通过KIT和ANO1标记识别）、肠神经元（支配胃肠道运动的肠神经系统神经元，通过TUBB3免疫荧光染色识别）以及细胞核（DAPI）的代表性免疫荧光染色结果。在胃黏膜中，KIT亦表达于潘氏细胞和杯状细胞，这与既往报道一致9,10,11。ANO1在胃上皮细胞中亦高度表达，尤其在胃底的柱状上皮细胞中，这与其在氯离子转运和黏膜分泌中的功能相符11。此外，根据人类蛋白质图谱数据库的数据，TUBB3在某些胃内分泌细胞和黏液分泌细胞中也有表达12,13。图5展示了分别以MYH11标记的平滑肌细胞、E-cadherin标记的胃黏膜上皮细胞以及KIT标记的ICC的代表性免疫荧光染色结果。MYH11亦如先前报道，在胃黏膜的肌成纤维细胞中表达14。综上，这些免疫荧光结果证实，本实验方案能够有效保持组织结构的完整性。

显示实验装置中标注的胃部区域和食管的胃肠道解剖示意图。
图1：小鼠胃“瑞士卷”制备用于冷冻切片。（A）取出后立即将完整胃组织置于盛有冷磷酸盐缓冲液（PBS）的黑色硅胶涂层解剖皿中，以保持组织完整性。（B）沿十二指肠中点切开胃。（C）轻轻拉伸胃组织并用针固定于解剖皿中，使其平展但不施加过度张力。沿组织画出红色虚线，指示修剪位置，以便后续卷绕。（D）将打开并固定的胃置于PBS润湿的滤纸上，准备卷成紧凑结构。红色箭头显示胃卷绕的方向。（E）将组织样本包埋于最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂中，并在干冰上冷冻，以备冷冻切片。（F）将冷冻组织块储存于−80 °C，随后进行5-µm厚度的冷冻切片，用于下游分析。请点击此处查看该图的放大版本。

荧光显微镜系统的激光光谱配置；界面展示激发通道、光谱图和采集设置。
图2：Z轴层扫成像过程中的ND采集设置与饱和度可视化。（A）共聚焦成像软件中为多通道光谱成像所配置的激光与探测器设置。使用了四种荧光染料：4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、Alexa Fluor 488（AF488）、Alexa Fluor 555（AF555）和Alexa Fluor 647（AF647），每种均匹配相应的激发激光器和发射光探测器。光谱图显示激发与发射光谱曲线，可进行调整以最小化串扰并优化信号检测。（B）针对每种荧光染料单独调整曝光参数，以避免像素饱和并保留高强度区域的细节。（C）大范围图像采集设置（例如6 × 6视野）可实现对整个胃部瑞士卷组织的可视化；图像视野大小应根据卷状组织的尺寸与致密程度进行调整。（D）ND采集窗口显示Z轴层扫参数设置。Z轴范围通过选择胃肌组织的顶部和底部位置来定义，共设置八个步进，以完整捕获组织深度，用于三维（3D）分析。请点击此处查看该图的放大版本。

消化系统组织切片；标注食管、胃、十二指肠；显微镜图像。
图3：苏木精-伊红染色的小鼠胃Swiss roll切片图像。 拼接扫描显示了对8周龄雌性C57BL/6J小鼠全胃Swiss roll结构进行可视化的能力。图中标识了主要解剖区域，包括食管（红色虚线）、食管下括约肌（紫色虚线）、胃底（黑色虚线）、胃体（蓝色虚线）、幽门（绿色虚线）和十二指肠（橙色虚线）。比例尺：1000 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

免疫荧光检测示意图：ANO1、KIT、TUBB3 在组织切片中的染色及叠加图像。
图 4：小鼠全胃瑞士卷的共聚焦图像：ANO1、KIT、TUBB3。 上排图像：来自一只8周龄雌性C57BL/6J小鼠胃部瑞士卷的代表性拼接共聚焦图像，显示ANO1（绿色）、KIT（青色）、TUBB3（黄色）以及细胞核（蓝色）的免疫染色结果。整个卷绕的胃组织，包括胃底、胃体和胃窦，均清晰可见。比例尺：1000 µm。下排图像：上排图像中白色虚线框所示区域的放大视图，突出显示了卡哈尔间质细胞（ANO1+ 和 KIT+；黄色箭头）和肠神经元（TUBB3⁺；红色箭头）的细胞细节。比例尺：100 µm。 请点击此处查看此图的放大版本。

免疫荧光显微镜：MYH11、KIT、E-钙黏蛋白、叠加图像；细胞蛋白定位。
图5：整只小鼠胃Swiss roll结构的共聚焦图像：MYH11、KIT、E-钙黏蛋白。上排图像：来自一只8周龄雌性C57BL/6J小鼠胃部Swiss roll结构的代表性拼接共聚焦图像，显示MYH11（绿色）、KIT（青色）、E-钙黏蛋白（黄色）以及细胞核（蓝色）的免疫染色结果。整个卷绕的胃组织，包括胃底、胃体和胃窦，均清晰可见。比例尺：1000 µm。下排图像：上排图像中白色虚线框所示区域的放大视图。白色点线标示黏膜上皮层（E-钙黏蛋白）和肌层（MYH11）。白色箭头指示KIT+ Cajal间质细胞（ICC）。比例尺：100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

采用新优化的胃部瑞士卷法，可将胃的三个部分（胃底、胃体和胃窦）以及食管和十二指肠全部包含在同一张切片上。这种全面的包埋方式使研究人员能够分析整个胃部的结构和分子变化，同时减少了切片和染色试剂的成本（图1）。

在免疫染色过程中，将胃的所有区域同时暴露于相同的染色溶液中，可确保染色的一致性并提高准确性。胃组织瑞士卷的免疫染色可清晰显示胃壁的不同层次结构。如图4和图5所示，该方法能够可视化不同胃段之间的形态学差异，并可用于检测ICC细胞（KIT和ANO1）10、神经元（TUBB3）15、平滑肌细胞（MYH11）、黏膜上皮细胞（E-cadherin）以及细胞核。

根据组织状况和研究目的，可进行一些微小调整。例如，去除多余的附着脂肪有助于在固定过程中维持卷状结构的形态。调整切片厚度也可能有助于保持组织结构或提高组织与载玻片的贴附性。另一种可能的优化方法是使用金属模具进行更一致的切割，类似于肠道瑞士卷（intestinal Swiss rolls）所采用的方法16。尽管本方案主要针对冷冻切片，但也可根据需要调整用于石蜡包埋组织。石蜡包埋虽能更好地保持组织结构的完整性，但冷冻切片具有处理速度快、抗原保存效果好的优势，因此更适用于免疫荧光检测。

该方法确实存在局限性。在炎症、肥胖、糖尿病或衰老等情况下，常出现胃部增大、纤维化或钙化，这会使胃的卷绕更加困难，并可能对获得理想的染色效果造成挑战17,18,19,20。尽管存在这一局限性，该技术相较于传统的区域特异性包埋方法仍具有显著优势。将所有胃部区域在相同条件下进行处理，可提高一致性，减少变异性，并节省时间和试剂。

该方法特别适用于特定区域变化的研究。它还支持对多种细胞类型进行空间分析，并可与基于图像的定量分析相结合。总体而言，这种新优化的胃组织瑞士卷法为健康和疾病状态下的胃组织全面分析提供了一个实用且可扩展的平台。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分由美国国立卫生研究院基金资助 R01 DK057061（T.O.）、R01 DK121766（Y.H.）、R01 DK126827（T.O.）、R01 DK131455（T.O.）以及P30 DK084567（表观基因组学与空间生物学核心，梅奥诊所胃肠道细胞信号研究中心）提供支持。资助机构在研究设计、数据分析或稿件撰写过程中未发挥任何作用。本文内容仅由作者负责。我们感谢Darren J. Baker博士及其实验室成员（美国明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所生物化学与分子生物学系）提供实验室资源，并对H&E染色提供技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#5SF 镊子FINE SCIENCE TOOLS11252-00
牛血清白蛋白 SIGMA-ALDRICHA7906
ColdVision MC-LS LED 光源SCHOTTMC-LS
共聚焦软件 尼康尼康 NIS-Elements 成像软件
Cryoseal XYLEpredida9312-4
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚二乳酸盐）赛默飞世尔科技D3571
大型解剖皿生命系统  仪器设备SKU: DD-90
驴抗山羊 AF647 多克隆抗体Life TechnologiesA21447批号：1739289 RRID:AB_2535864
驴抗小鼠 AF555 多克隆抗体Life TechnologiesA31570批号：1774719 RRID:AB_2536180
驴抗兔 AF488 多克隆抗体Life TechnologiesA21206批号：2668665 RRID:AB_2535792
E-cadherin（1:400 稀释）BD生物科学610181货号：25510 RRID:AB_397580
伊红ELITechGroup$SS-071C
环氧树脂涂层镊子FINE SCIENCE TOOLS11210-10
乙醇SIGMA-ALDRICH459828-4L
FLEX TUBE 1.5 mLEppendorf22364111
纱布海绵Fisher Scientific22-362-178
硬化精细剪刀FINE SCIENCE TOOLS14090-09
苏木精Epredia7211
KIT（0.2 µg/mL；1:1000 稀释度R&D SystemsAF1356批号：IEO0217101 RRID: AB_354750
镜头清洁液 1盎司喷雾瓶尼康77013066
显微镜盖玻片Fisher Scientific12541016
显微镜载玻片CardinalHealthM6133A
微型固定针FINE SCIENCE TOOLS26002-20
MYH11（1:400 稀释度）生物医学技术BT-562RRID:AB_10013421
指甲油罪恶色彩7.33855×10¹¹
30 G × 1/2 英寸针头 BD 生物科学305106
多聚甲醛SIGMA-ALDRICH158127-500G
Personna 单刃刀片The Razor Blade Co.76247-652
ReadyProbes Mouse-on-Mouse IgG 阻断溶液（30倍浓缩）赛默飞世尔科技R37621批号：3226230
SlowFade Diamond 抗荧光淬灭封片剂（封片介质）赛默飞世尔科技S36972
StainTray 10 片载玻片染色系统Simport ScientificM918-2
体视显微镜 0.8x-5x尼康SMZ645
蔗糖 SIGMA-ALDRICHS9378-1KG
Surface-Amps X-100（Triton X）赛默飞世尔科技28314
TMEM16A（ANO1：1:400 稀释）Abcamab53212 批号：GP3295656-1 RRID: AB_883075
移液管Falcon357575
TUBB3（1:400 稀释）细胞信号技术4466批号：5 RRID: AB_1904176
二甲苯 Fisher ScientificX3P-1GALLOT 206238

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