利用RStudio生成家禽粪便中微生物丰度的交互式三维空间可视化

Summary

这里，我们提出了一种利用基于网格的抽样数据生成家禽围栏微生物计数和pH值交互式三维可视化的协议。

Abstract

传统的家禽粪便微生物学和物理化学组成评估通常依赖静态表格或二维可视化，这些方法可能无法捕捉围栏环境中的空间异质性。该协议描述了交互式三维（3D）可视化，将微生物计数数据和环境参数整合到家禽圈内。采用基于网格的布局来近似笔抽样，并首先生成了模拟数据集以演示工作流程。实验数据集用于评估相对于环境特征的空间梯度，包括水线、喂食器和围栏入口。数据通过 RStudio 使用 plotly 生成交互式三维图。需氧细菌负荷范围为5.9至8.6 log₁₀ CFU/g，水线附近丰度显著提高（P = 0.023），且随着距离越远，计数越低。所得的表面图直观地突出显示了微生物群体在湿润丰富区域的聚集，并展示了该框架在解释家禽粪便中微生物群落空间模式的实用性。尽管在商业家禽条件下还需进一步评估，但当前协议提供了一种可重复的方法，用于可视化和分析家禽粪便数据集中的空间异质性。

Introduction

家禽行业包括产蛋和肉用生产系统，每个系统通过堆积垫料、粪便、饲料颗粒、羽毛、破碎蛋壳和水分^{随时间产生}大量家禽粪便 ^1,2,3。这些落叶可以支持各种微生物群体，来源于鸟类、昆虫、啮齿动物和气溶胶 ^2,3。其中一些微生物可能包括病原体，如沙门氏菌，这些病原体会引起鸟类疾病，并引起公共卫生关注².由于家禽粪便可能作为肥料在陆地上施用，理解微生物分布对环境监测、鸡群健康和食品安全有重要意义。

因此，代表性的家禽粪便采样对于表征微生物群落和检测潜在病原体非常重要。几十年来，家禽粪便采样的方法已被探索，包括拖拽拭子、粪便收集、直接拾取垃圾、一次性鞋套或靴袜 ^6,7。然而，样本采集地点强烈决定了数据对整体家禽窝沟状况的反映程度。由于鸟类在屋内活动，加上饮水器、喂食器、风扇以及冷却或加热垫等环境特征，形成局部环境，家禽粪便中的微生物种群和养分因子分布不均，3,8,9,10。因此，在解读与猫砂相关数据时考虑异质性对于有效管理和维护群体健康至关重要。

空间制图方法已被广泛应用于农学和土壤科学，用于可视化微生物和物理化学的异质性以及局部热点^11,12。然而，当家禽粪便数据在围栏内多个区域收集时，空间趋势难以从^数值8,9中解读。三维（3D）可视化提供了一种实用的方法，将微生物和物理化学测量与空间坐标整合，生成交互式表面模型^13,14。与静态二维模型相比，三维模型支持旋转、缩放和基于深度的采样网格梯度可视化，这可能改善家禽场环境中空间图案的解读。

当前协议描述了一种结构化且可重复的方法，用于生成基于网格布局并由RStudio分析的家禽粪便、微生物和物理化学数据的交互式3D可视化。首先使用模拟的微生物和物理化学数据演示可视化工作流程，随后将该方法应用于实验家禽粪便微生物计数。该方案的目标是提供一个可重复的框架，用于可视化家禽粪便数据集中的空间异质性，并支持微生物分布模式与家禽舍特征的关系解释。

Protocol

该协议使用微生物和pH值的模拟数据集演示可视化工作流程的每一步，随后应用于实验家禽粪便微生物计数，以展示实验数据的应用，并支持对距离相关微生物关联的统计解释。未进行活体动物手术。在家禽圈中采集了未与动物直接接触的窝体样本。因此，无需机构动物护理批准。

1. 采集家禽粪便样本并生成微生物丰度数据

1. 在肉鸡围栏内建立基于网格的采样布局，使用均匀的间距。
   注意：在较小的笔中，可以使用串状网格系统来完成，而较大的笔则可能使用旗标标记每个采样点。网格通常从笔的左下角开始，这里被视为起点。每个采样位置都通过其网格位置进行记录。
2. 在同一网格内，记录每个采样点及环境点（如供水器、水管、加热灯和入口）的X和Y坐标，使用单一位置或代表其位置的线条。
   注意：X方向沿笔长度延伸，Y方向沿宽度方向延伸。
3. 在数据集中加入“Pen”栏，以标识每个抽样地点的笔或处理组（例如“P1”、“P2”）。
   注意：按笔分组确保空间分析是在正确的居住环境中进行的。为此演示，定义了一个结构化的6×10网格，从1支笔中获得60个采样点（n=60）。选择6×10格线是为了实现围圈空间均匀覆盖，布局对称且均匀分布。网格布局示例见 图1。
4. 在每个采样点采集三份落叶样本，用于微生物或物理化学分析。微生物检测时，每次称重10克猫砂，并将其放入90毫升无菌缓冲肽水中，进行首次稀释（10⁻¹）。彻底混合样品以均匀化悬浮液。
5. 将混合落叶样本制成10倍连续稀释液，并将每种稀释液的0.1毫升装板到琼脂平板上。
   注意：根据被测细菌的类别，可以使用不同的培养基。例如，好氧细菌可能被镀在三叶酸大豆琼脂（TSA）上，乳酸菌被镀在MRS琼脂上，肠杆菌科则被镀在麦康基琼脂上。
6. 将平板在37°C下孵育24小时，然后计数可见菌落。计算微生物丰度，以每克落叶形成单位（CFU/g）计，方法如下：
   CFU/g = （稀释因子计入的菌落数× ÷电镀体积
7. 报告各复制次的平均值。
   注意：检测极限由镀层体积（0.1 mL）决定，约对应于镀层悬浮液中的10 CFU/mL，或原始样品中的100 CFU/g子落井。
8. 记录微生物计数结果会以数值格式的电子表格形式进行，以便后续统计分析和可视化。
9. 创建包含以下列的CSV文件：样本ID、X（空间坐标）、Y（空间坐标）、Xnum（X的数值排序顺序，可选）以及微生物计数或物理化学参数（如pH值）。图2展示了模拟表格的示例。
10. 使用正态分布随机值生成模拟微生物丰度值。根据经验测量定义平均值、标准差和范围。应用固定的随机种子以确保可重复性。在网格上引入空间梯度，并添加轻微的随机变化，以避免图案均匀。
    注意：用于数据生成的模拟参数，包括分布类型、范围和空间结构，汇总于 表1。

2. 建立计算环境

1. 安装并加载必要的统计计算软件包。
   install.packages（c（“plotly”））
   图书馆（plotly）
2. 将CSV数据集导入计算环境，并设置工作目录。
   setWD（“path/to/your/folder”）
   数据集 <- read.csv（“path_to_your_file.csv”）
   注意：输入数据集应以电子表格格式（CSV文件）组织，每行代表一个抽样位置。所需的输入数据结构和变量定义总结于表2。

3. 准备和格式化数据

1. 检查CSV文件是否有缺失或数据不一致。
   摘要（数据集）
   any（is.na（dataset））
2. 根据需要清理数据集，去除“NA”值。
   数据集 <- na.omit（dataset）
3. 为了规范化和改善图表的可视化，对数转化微生物计数。
4. 使用一致的基于底划线的符号（例如log10_CFU_A和log10_CFU_B）标准化变量名，以提高可读性和可重复性。
5. 对微生物计数数据应用log10转化，以稳定方差并与标准CFU报告实践保持一致。
   Dataset$Log10_CFU_A <- log10（dataset$OrganismA_counts + 1）
   Dataset$Log10_CFU_B <- log10（dataset$OrganismB_counts + 1）
6. 确保X和Y坐标值为数值。如果数据按字母顺序排列，应转换为数值，以准确对应网格上的采样位置。
   注意：最终数据集应包含笔坐标系内的所有唯一标识符、数值空间坐标和对数转化后的微生物计数。

4. 生成交互式3D可视化

1. 在构建空间矩阵之前，先验证数据集结构，以确保网格能够正确生成。然后，通过组合多个部分（如空间坐标和对数转化的细菌计数）来制备空间数据矩阵，以匹配笔的网格布局。
   注意：代码将Pen、X和Y的观测分组，计算每个网格点的平均值Log10_CFU_A，然后根据数据集中唯一的X和Y坐标将数值重塑为矩阵。
   org1_means <- aggregate（Log10_CFU_A ~ Pen + Y + X，
   数据 = 数据集，
   FUN = mean，
   na.rm = 真）
   org1_P1 <- subset（org1_means， Pen == “P1”）
2. 对点进行排序，使矩阵正确映射
   x_vals <- sort（unique（org1_P1$X））
   y_vals <- sort（unique（org1_P1$Y））
   ncol_grid <- 长度（x_vals）
   nrow_grid <- 长度（y_vals）
   org1_mat_P1 <- matrix（org1_P1$Log10_CFU_A，
   nrow = nrow_grid，
   ncol = ncol_grid，
   BYROW = FALSE）
3. 确保图看起来光滑时没有缺失值。
   for（i in 1：ncol（org1_mat_P1）） {
   org1_mat_P1[is.na（org1_mat_P1[，i]）， i] <- mean（org1_mat_P1[，i]， na.rm=真）
   }
4. 将微生物数量想象为三维空间。
   注意：本图的网格大小反映了数据集的空间布局
   图 <- plot_ly（
   x = x_vals，
   y = y_vals，
   z = org1_mat_P1，
   类型 = “表面”，色阶 = 列表（
   c（0，“深蓝”），
   c（1，“绿色”）
   )
   )
5. 添加环境特征，如水管线，帮助可视化微生物计数或其他垃圾参数到该点的距离，使用户能够看到空间模式。
   图 < - 图 %>%
   add_trace（
   x = c（1， 5），
   y = c（6， 6），
   z = c（8.5， 8.5），
   类型 = “scatter3d”，
   模态 = “线”，
   行 = 列表（color = “#1f77b4”，宽度 = 8），
   名称 = “水线”
   ) %>%
   add_text（
   x = 3，y = 6，z = 8.6，
   文本 = “水线”，
   textfont = list（大小 = 14，color = “darkblue”），
   showlegend = 错误
   ) %>%
   布局（
   标题 = “模拟有机体A”，
   场景 = 列表（
   xaxis = 列表（标题 = “X 坐标”，tickvals = x_vals），
   yaxis = 列表（标题 = “Y 坐标”，tickvals = y_vals），
   zaxis = list（title = “log10 CFU”）
   )
   )
   图
6. 请参阅 补充文件1 ，了解用于可视化家禽围栏pH值的代码。

5. 三维模型在实验家禽粪便微生物计数中的应用

1. 从围栏内定义的网格布局采集家禽粪便样本，并利用空间坐标记录采样位置。
   注：本研究采用定义的网格布局，从威斯康星大学麦迪逊分校的家禽围栏采集样本。样本采用5×7米网格布局采集。
2. 称重每个采样点的定量垃圾，并将其悬浮在磷缓冲盐水（PBS）或等效稀释剂中，准备初步稀释液。
   注意：本研究使用Whirl-Pak袋采集每个地点1克垃圾，并以1：10比例稀释于磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）中。
3. 通过将落叶样本置于合适的培养基上并在适当条件下培养，进行微生物计数。
   注：本研究采用点镀法在含三叶酸大豆琼脂（TSA）上进行双重培养，并在37°C下培养24小时。微生物计数所需的材料列于 材料表中。
4. 以菌落形成单元（CFU）量化微生物丰度，并对数据进行对数₁₀转化以进行分析。
5. 将处理后的微生物数据集成到计算流程中，并根据所需的输入结构进行格式化。
6. 使用上述方法生成三维空间可视化，以表示笔内微生物丰度。
   注：本研究中，可视化图旨在描绘取样笔中需氧细菌的丰度。

6. 统计分析

1. 进行基础统计分析，总结微生物丰度和环境变量的空间模式。
2. 仅对实验性家禽粪便数据集进行统计分析。仅用于可视化演示，不要将其纳入统计检验。
3. 当有重复测量时，计算每个网格位置的平均值。
4. 利用线性回归分析评估微生物丰度与环境地标距离之间的关系。
5. 利用围栏内已知的网格位置计算环境地标之间的距离。把距离当作连续变量来对待。
6. 利用结果探索空间趋势，支持可视化解读，而非建立因果生物学关系。

Results

模拟微生物和物理化学数据，用于展示三维模型
本研究基于模拟数据，提供了可视化微生物（生物A和生物B）丰度及家禽窝栏内猫砂pH值的代码。最终的三维图基于基于网格模型，可视化了微生物计数（图3A，B）和pH值（图3C;关于交互体验，见补充文件3）。模拟的pH值显示笔内空间变化，网格方向的渐变对应于施加的空间梯度。完整代码无文本中断，可在补充文件1中获取。

三维模型在实验家禽粪便微生物计数中的应用
为了展示模型如何与实际生态数据结合，我们绘制了家禽粪便中的需氧细菌计数，并进行了统计分析，以利用线性回归模型（LRM）评估距离环境点（如饲料源和水管线）对细菌丰度的影响。用于分析的实验数据集见 补充文件2。三维可视化显示了围栏内有氧计数的明显差异，表明该方法能够有效显示家禽饲养环境中的真实微生物分布（图4;互动体验见 补充文件3）。这些可视化显示出空间分布异质性，局部细菌丰度较高的区域位于特定环境特征附近。在整个家禽圈内，有氧计数范围为5.9至8.6 log₁₀ CFU/g，水线附近浓度最高，中央喂食器周围及水线远端浓度较低。平均有氧丰度从水线附近的8.0 log₁₀ CFU/g下降到最远记录距离处的7.4 log₁₀ CFU/g。微生物计数代表每个采样点重复测量的平均值。此外，距离水线的距离是有氧细菌负荷的重要预测因子（LRM，P < 0.05），而与饲料源和入口的距离则无（LRM，P > 0.05）。这些定量结果证实了三维表面图中观察到的视觉趋势，显示微生物丰度随着距离水分源的增加而明显下降。最终，这些结果表明基于3D网格的框架为家禽粪便数据集中的空间异质性可视化和分析提供了实用方法。该模型结合模拟和实验数据，捕捉了局部微生物分布模式，并进一步统计了细菌丰度与围栏内环境特征之间的关联。

图1：家禽围栏样本采集网格布局。 基于网格的采样框架示意图，用于定义家禽圈内的空间坐标和采样位置。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：电子表格格式的模拟数据示例布局。 代表性的电子表格结构，显示样本标识符、空间坐标（X和Y）以及用于分析的微生物或物理化学变量。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：家禽圈内微生物计数和pH的模拟空间分布。 （A）模拟生物A计数， （B） 模拟生物B计数， （C） 通过基于网格的三维空间模型可视化的模拟pH值。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4： 需氧细菌数量在家禽围栏内的空间分布。 三维曲面图显示有氧细菌计数（log CFU/g）在不同距离（X–Y坐标）上的变化。 请点击此处查看该图的放大版本。

参数	价值
分布	普通
平均（μ）	8.26
SD（σ）	0.77
分布范围	7.10–9.37
空间模式	线性梯度（Y方向）
噪音	正态（μ=0，方差小）
随机种子	10

表1：用于生成模拟微生物数据集的参数。 分布参数摘要，包括用于生成模拟微生物数据的均值、标准差、数值范围和空间梯度设置。

列名	描述	数据类型	必修
笔	笔或处理组标识符	正文	是的
X	网格上的X坐标位置	数值	是的
Y	网格上的Y坐标位置	数值	是的
Log10_CFU_A	对数转化微生物计数（生物A）	数值	是的
Log10_CFU_B	对数转化微生物计数（生物B）	数值	可选
pH值	测得pH值	数值	可选
地标距离	距离环境特征（例如水线）	数值	可选

表2：空间分析所需的输入数据集结构。 所需变量列表，包括样本标识符、空间坐标、微生物或物理化学测量数据，以及相应的数据格式。

补充文件1：生成模拟微生物和pH空间可视化的代码。用于处理模拟数据集并生成生物A、生物B及家禽圈pH值的3D表面图。请点击这里下载此文件。

补充文件2：实验性家禽粪便微生物数据集。 包含好氧细菌计数及相关空间坐标的电子表格，用于三维可视化和统计分析。请点击这里下载此文件。

补充文件3：交互式3D可视化访问链接和二维码。 二维码及相应网页链接，用于访问模拟和实验数据集的互动3D图。请点击此处下载该文件。

Discussion

本研究中展示的基于模拟的图旨在展示三维空间映射在增强家禽粪便环境中微生物和物理化学分布可视化的潜力（补充文件3）。此外，我们将该方法与微生物计数数据以及围栏内的环境和空间标记结合，评估局部分布模式并识别距离依赖关系（补充文件3）。

当前协议中的关键一步是准确建立基于网格的采样框架。由于三维曲面依赖于可靠的空间坐标，正确指定原点、均匀间距以及精确记录X和Y位置至关重要。该方法中最费工的部分是布局网格，并确认每个样品是否对应其指定的坐标和环境标志，如供料器、水管、入口点或加热区。此阶段的小位置误差可能影响后续分析。在较大或商业环境中，基于激光的测量工具或类似定位辅助工具可能减少劳动力并提高重复性。仔细注释围栏地标也很重要，因为这些特征为理解由鸟类活动、湿度和养^{分分布形成}的落叶环境中微生物梯度提供了生态背景。

当前方案可适应更广泛的农业应用。除了微生物计数和pH值外，它还可用于其他与落叶或地板相关的变量，包括湿度、温度、养分分布、氨相关指标或测序来源的微生物群落特征。实际修改包括按笔分组数据、从记录的数据集动态生成矩阵，以及在绘制前筛查缺失值。常见的问题解决步骤包括将坐标标签转换为数值，平均共享点的重复值，检查是否存在重复或缺失坐标，以及确认矩阵结构是否与原始笔式布局相符。该框架还可以扩展为包括多变量分析和垃圾深度，从而评估水平和垂直的异质性。

还应承认若干局限性。该方法本质上并未提升采样分辨率或生物表现;相反，它提升了数据收集后的空间组织和解读能力。因此，最终模型的质量仍取决于采样设计和现场执行的一致性。网格建设可能体力消耗大且耗时。此外，成功的实施还需要计算机访问和基础数据处理技能。命名模式错误、坐标输入错误或缺失网格单元格可能干扰矩阵生成或产生误导性的可视化效果。总体而言，当前方法应被视为一种探索性、基于可视化的框架，而非形式空间统计或机制推断的替代品。

尽管存在这些局限性，该协议相较于依赖集合样本和孤立点测量的典型方法，具有明显优势，后者能掩盖笔内的细微空间^变化，且能掩盖笔内的细微尺度空间变化。本研究将该框架应用于需氧细菌计数，表明微生物群体可以在家禽垃圾中空间聚集。具体来说，细菌丰度在水线附近较多，向笔中心方向下降，形成了三维表面图中明显的梯度（补充文件3）。这一模式支持了局部环境条件，尤其是湿度，可能强烈影响家禽落砂中微生物分布的解释。其他变量如pH值和养分组成可能进一步澄清这些关系。先前研究同样显示，家禽垃圾的微生物群落和环境条件在不同空间中与pH值、饲料溢出和鸟^{类活动相关}性有所差异。通过将微生物或物理化学测量与动物环境中的定义位置联系起来，这种方法使这些模式更加可见和可解释。它还与土壤和农学科学中使用的空间映射方法相呼应，用于识别梯度、斑块性和局部焦点，同时将这些概念应用于动物生产系统^11、12、13。未来，跨栏、羊群和生产周期的反复空间映射可能支持微生物热点的预测建模以及对高风险生态区的更有针对性管理。

虽然三维可视化无法提升数据的准确性或精度，但它确实增强了对影响家禽粪便微生物模式和趋势的统计相关因素的解读。更易理解的可视化有助于沟通和关于猫砂改良、鸟类健康和垫料更换的明智决策 14,15,16。除了科研应用外，该工具对家禽生产者和学术^{推广人员也有}实际价值。这些3D图块可以作为有效工具，以更易访问和可操作的形式呈现复杂的微生物数据，供农场管理者、利益相关者和小型家禽生产者使用¹⁷。通过二维码在手机上访问这些图块，可能进一步提升其在现场技术支持中的实用性。随着家禽生产在传感器技术和数据生成方面不断进步，这些方法在整合家禽信息学中可能变得越来越有用^18,19。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
分析平衡	费舍尔科学	15997490	用于称重猫砂（例如，10克/样本）
带互联网接入的电脑	任何	无	用于运行 RStudio
孵化器（37 & deg;C)	热力科学	50125590H	24小时细菌生长
微生物培养基（TSA）	BD 迪夫科	236950	需氧菌的计数
磷酸盐缓冲盐水（PBS）	赛莫飞世尔科学	10010023	用于稀释和微生物悬浮液
家禽粪便样本	家禽肉用鸡舍或研究围栏	无	采用网格设计收集的新鲜垃圾
R 包：plotly、dplyr、htmlwidgets	克兰	https://cran.r-project.org	用于3D可视化和数据处理
R 统计计算环境（v4.3 或更高版本）	R项目	https://cran.r-project.org	cran.r-project.org
RStudio （v2024.12.0.467 或更后版本）	假设	https://posit.co/download/rstudio-desktop	posit.co
电子表格软件（Excel，Google Sheets）	Microsoft/Google	https://www.microsoft.com/exce	在导入到 RStudio 之前组织数据
无菌10毫升锥形管	赛莫飞世尔科学	339650	用于运输分量
无菌移液器及提示	费舍尔科学	无	用于精准且无菌的液体处理
无菌旋风袋	纳斯科	B01062	用于样本采集和均质化
涡旋混合器	VWR	10153-838	对于均质样品