本方案描述了奈梅亨止血检测法，该方法能够同时、实时地测量凝血酶和纤溶酶的生成，从而对凝血和纤溶过程进行综合评估。该检测旨在超越传统止血检测的局限，进一步提升在科研和临床环境中对止血平衡状态的表征能力。
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摘要
摘要
凝血酶和纤溶酶在止血过程中均发挥核心作用，分别调控凝血和纤溶。传统的止血检测通常仅关注止血过程的孤立组分或有限阶段；例如，活化部分凝血活酶时间（APTT）和凝血酶原时间（PT）仅评估纤维蛋白形成的启动阶段，而凝血因子活性检测则用于评估单个凝血因子的功能。尽管这些检测具有重要价值，但它们无法全面反映继发性止血和纤溶随时间动态发展的整体过程。奈梅亨止血检测（Nijmegen Hemostasis Assay, NHA）通过在单个微孔板孔中实现凝血酶和纤溶酶生成的同步、时间分辨测量，弥补了这一局限。该检测采用两种具有不同激发和发射光谱且无交叉反应的合成荧光底物，可并行准确量化两种酶的活性。在乏血小板血浆中加入组织因子、钙离子和组织型纤溶酶原激活物以启动止血过程，并在37 °C条件下每30秒记录一次荧光信号，持续70分钟。通过校准标准品生成酶活性曲线，并从中提取滞后时间、凝血酶生成潜力、纤维蛋白溶解时间及纤溶酶峰值高度等参数。 该检测能够可靠地同步捕捉凝血酶和纤溶酶的生成，具有良好的板内和板间重复性，并可检测肝素、活化蛋白C和ε-氨基己酸等效应物对凝血和纤溶的调节作用。在临床样本中，凝血因子缺乏患者的凝血酶生成显著降低，而纤溶障碍患者的纤溶酶生成谱则升高。通过整合凝血酶和纤溶酶生成的测量，NHA提供了超越传统检测的止血平衡全面视角。这种整合方法在科研与临床应用中具有广阔前景，可用于止血表型的表征、出血与血栓风险的评估，以及靶向治疗干预的监测。本方案阐述了NHA的操作流程，旨在增进对止血平衡的理解与评估。
引言
止血是凝血与纤溶之间动态平衡的结果。凝血酶和纤溶酶是驱动这两个过程的关键酶：凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，而纤溶酶则降解纤维蛋白以溶解血凝块。这种平衡的破坏可能导致出血或血栓事件1,2。然而，临床上用于评估止血功能的实验室检测通常仅关注凝血或纤溶的孤立步骤，难以全面反映整体的止血平衡状态。对于疑似有出血倾向的患者，常规筛查试验如凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（aPTT）常用于筛查凝血因子缺乏。然而，这些检测仅测量初始纤维蛋白形成所需的时间，无法捕捉到凝血启动后发生的、具有重要生理意义的凝血酶生成过程1,2,3。因此，在存在轻度凝血因子缺乏的患者中，这些检测结果可能仍显示正常3,4,5,6,7,8。为了识别这些特定的缺乏状态，....
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方案
所有涉及人血浆样本的操作均按照机构指南进行，并经阿纳姆-奈梅亨医学伦理委员会批准。在样本采集前，已从所有供体获得书面知情同意。
1. 缓冲液、试剂和血浆样本的制备
- 配制缓冲液
- 称取 1.2 g Tris（分析纯），溶于 180 mL 0.9% NaCl 溶液中。
- 用 HCl 调节 pH 至 7.4。
- 用 0.9% NaCl 定容至 200 mL，得到 50 mM Tris-150 mM NaCl 缓冲液（TBS）。
- 将 TBS 分装至两个 50 mL 离心管中。
- 用剩余的 100 mL TBS 配制含钙缓冲液。将 7.34 g CaCl2·2H2O 溶于 100 mL TBS 中，得到 Tris-NaCl-CaCl2 缓冲液（TBS-Ca，pH 7.4）。
- 将 TBS-Ca 分装至两个 50 mL 离心管中。
- 将两种缓冲液均于 4 °C 保存，并在一周内使用。
- 配制荧光底物
- 将 53.2 mg 凝血酶底物（Bz-beta-Ala-Gly-Arg-AMC）溶于 4 mL Tris-NaCl 缓冲液中。
注：包装盒内附有分....
- 将 53.2 mg 凝血酶底物（Bz-beta-Ala-Gly-Arg-AMC）溶于 4 mL Tris-NaCl 缓冲液中。
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结果
使用奈梅亨止血分析法（NHA）获得的代表性凝血酶和纤溶酶生成曲线如图3所示。每条曲线的信号强度以相对于同批测定的正常混合血浆（NPP）样本的百分比表示。每次实验均包含一份含有NPP的样本，作为内部对照，用于验证检测的有效性并确保不同批次间的可比性。
图3A、B展示了来自三名健康对照者和正常混合血浆（NPP）的实验结果，显示出具有预期峰高和峰时的可重复凝血酶和纤溶酶曲线。这些曲线可作为正常止血功能的参考图谱，并表明检测性能良好。
图3C、D展示了V因子缺乏症患者的实验数据。纯合子患者（FV活性为3%）未检测到凝血酶生成，这与严重的促凝功能缺陷一致。由于凝血酶是凝血酶激活的纤溶抑制物（TAFI）的重要激活剂，在此情况下预期纤溶酶的生成会增加31
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讨论
Nijmegen止血检测（NHA）是一种双酶荧光检测法，可同时、实时地测量乏血小板血浆中凝血酶和纤溶酶的生成。通过在单个孔中捕获这两个过程，该方法有助于对继发性止血和纤溶过程进行高分辨率的动力学分析。这种双重读数相较于传统检测方法具有显著的方法学优势，已成功应用于凝血因子缺乏、纤溶亢进状态以及其他止血平衡紊乱疾病的研究。
NHA 的可靠性和可重复性取决于多个技术环节。这些环节包括准确的移液操作、试剂制备的一致性，以及在加入底物和激活剂后立即开始荧光检测。在整个检测过程中，将温度控制在 37 °C 对维持酶活性并确保获得有效的动力学读数至关重要。如先前在其他全局性检测中所证实的那样，标准化这些分析前变量并保持试剂操作的一致性，对于最大限度地减少技术变异极为关键34,35,36。此外，通过健康对照样本进行归一化处理，并使用混合正常血浆校正不同检测批次间的变异，可进一步提高不同实验批次及不同实验室之间的.......
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披露
W.L. van Heerde 是 Enzyre BV 的创始人及员工，同时也是 Enzyre 股东 Van Heerde Holding BV 的共同所有人。Enzyre 已从武田制药（Takeda）和诺和诺德（Novo Nordisk）获得合同研究资金。W.L. van Heerde 还曾获得瑞典奥克特制药公司（SOBI）和 CAF-DCF 提供的差旅资助。其余作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本研究遵循欧洲血液网（EuroBloodNet）的目标开展。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>材料 | |||
| 氯化钙二水合物（CaCl₂·2H₂O）2·2H₂O | 默克 | 1.02382 | |
| 脑磷脂（C.K. Prest 5 APTT 试剂盒） | Stago | 00847 | -20℃下可稳定保存6个月 °C. |
| 蒸馏水 | 记录开启日期。首次开启后1天内使用。 | ||
| 二甲基亚砜（DMSO） | 默克 | 1.02950.0500 | |
| 人α-凝血酶 | 酶学研究实验室 | HT 1002a | 盒内含有一份带有分析证书的小册子。所需添加的缓冲液体积取决于指定浓度，应调整至1 µ添加的人凝血酶体积（L）为120 µL试剂产生的终浓度为76 nmol/L。 |
| 人血浆素 | 酶学研究实验室 | HPlas | 盒内含有一份带有分析证书的小册子。所需添加的缓冲液体积取决于指定浓度，应调整至1 µ添加的人源纤溶酶的量为120 L µL试剂的结果为终浓度200 nmol/L。 |
| 正常混合血浆 | 内部制备 | 不适用 | 置于冰上可于解冻后保持稳定3小时。 |
| 患者血浆 | 不适用 | 不适用 | |
| Plasmin 底物（CBZ-L-苯丙氨酰-L-精氨酸酰胺）-罗丹明-吗啉基脲 | Symeres | 在 -80 ℃ 下可稳定保存 6 个月 °C. | |
| 重组人组织因子（TF）：Innovin | Dade Behring | B4212 | 在 -80℃ 下可稳定保存 6 个月 °C. |
| 重组组织型纤溶酶原激活剂（tPA）：阿替普酶/Actilyse | 勃林格殷格翰 | -80℃下可稳定保存12个月 °C. | |
| 三(羟甲基)氨基甲烷（H2NC(CH2OH3) | 默克 | 1.08382.2500 | |
| Tris-NaCl 缓冲液，pH 7.4（TBS） | 内部制备 | 不适用 | |
| Tris-NaCl-CaCl2 缓冲液，pH 7.4（TBS-Ca） | 内部制备 | 不适用 | |
| Bz-β-Ala-Gly-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素（凝血酶底物） | Symeres | 在 -80 下可稳定保存 6 个月 °C. | |
| <强>仪器设备 | |||
| Fluostar Optima 荧光计/酶标仪，配备温度控制和试剂注入器 | BMG Labtech | ||
| 96孔微孔板，聚苯乙烯材质，平底，黑色，中等结合表面（相当于Microlon） | Greiner BIO-ONE | 655076 | |
| 分析天平（上皿式天平） | |||
| 蓝色移液器吸头（适用于 100-1000 μL） µL | |||
| 3 mL 枸橼酸钠抗凝采血管（3.2% 枸橼酸钠） | BD Vacutainer | ||
| 冰桶 | |||
| 制冰机 | |||
| 培养箱/微孔板摇床 | |||
| 磁力搅拌器 | |||
| 微型离心管架 | |||
| 可封闭微型离心管 | |||
| pH计 | |||
| 移液器吸头 0.1-10 µL，非无菌 | |||
| 移液器（2、10、20、100 和 1000） µL | |||
| 螺丝刀（用作探针） | |||
| 试管混匀器 | |||
| 水浴锅 | |||
| 黄色移液器吸头（适用于 20-200 µL |
参考文献
- Chapin, J. C., Hajjar, K. A. Fibrinolysis and the control of blood coagulation. Blood Rev. 29 (1), 17-24 (2015).
- Furie, B. Pathogenesis of thrombosis. Hematology. 2009 (1), 255-258 (2009).
- Teruya, J., et al.
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