方法文章

生产鸡胚系嵌合体的逐步操作流程 通过 原始生殖细胞移植

778 次观看

⸱

DOI：

10.3791/69704

⸱

2025年12月5日

 ,  , 
1Department of Agricultural Biotechnology and Research Institute of Agriculture and Life Sciences, Seoul National University, 2Department of International Agricultural Technology & Institute of Green Bioscience and Technology, Seoul National University

本文内容

摘要

通过将原始生殖细胞（PGCs）移植到受体胚胎中生成的禽类生殖系嵌合体，可用于转基因、基因编辑以及物种保护等应用。本方案详细描述了PGCs的分离步骤， 体外 扩增、显微注射和供体验证，为生产生殖系嵌合体并推动禽类生物技术发展提供了可靠的平台。

摘要

鸡胚系嵌合体的制备 通过 原始生殖细胞（PGCs）移植为禽类转基因、基因组编辑和物种保护提供了稳定且可重复的技术平台。传统的基于EGK X期胚胎胚盘细胞的方法由于早期细胞谱系分离，导致种系传递效率较低，应用受到限制。相比之下，基于PGCs的策略利用了这些单能细胞固有的种系发育潜能，可实现其在受体性腺中的稳定整合。本文介绍了一种从HH 26–28期胚胎中分离原始生殖细胞，并进行体外维持与扩增的分步实验方案 体外并将它们移植到HH 14-17期受体胚胎的背主动脉中。短期定植可通过PKH26等荧光标记进行监测，而长期生殖系嵌合则通过受体性腺的PCR分析加以确认。该方法可稳定生成生殖系嵌合体，同时保持供体原始生殖细胞（PGCs）的活力和功能完整性。此外，该技术与CRISPR/Cas9及基于转座子的载体等基因组编辑工具兼容，可用于构建转基因和基因编辑的禽类模型。除基础研究外，该策略还可通过种间生殖系传递和遗传资源保存支持物种保护工作。总体而言，本方案为禽类生殖系操作提供了全面且可靠的框架，为家禽生物技术领域的基础与应用研究提供了多功能平台。

引言

原始生殖细胞（PGC）介导的生殖系传递是将遗传信息传递给鸟类下一代的最有效方法1,2,3。生殖系嵌合体是指同时携带供体和宿主来源生殖细胞的个体，能够将供体的遗传物质传递给后代，在转基因技术、功能基因组学以及濒危物种保护等方面具有重要应用价值4,5,6,7,8。与依赖胚盘细胞的方法相比，PGC介导的策略具有更高的生殖系传递效率和可重复性，因此更适用于精确的遗传操作。

在鸟类中，原始生殖细胞（PGCs）起源于Eyal-Giladi和Kochav（EGK）X期胚盘的中央透明区9 随后迁移至Hamburger和Hamilton（HH）4期的生殖新月区10在HH 9至12期之间，原始生殖细胞（PGCs）循环流动 通过 在定居于生殖嵴之前，胚胎期的血管11,12,13这些独特的迁移模式使得能够在多个发育阶段分离原始生殖细胞（PGCs），包括生殖新月区、循环血液和性腺14值得注意的是，从 HH 26-28 期性腺中分离并移植至 HH 14-17 期受体胚胎的 PGCs 已被证实具有最佳的生殖系定植能力和移植效率，为本方案的标准化应用提供了实用框架。

原始生殖细胞可被维持和扩增 体外 在保持种系身份和传递能力的同时，实现稳定的遗传修饰。通过原始生殖细胞介导的种系嵌合体制备技术，已用于创制表达重组蛋白的转基因鸟类，示踪种系谱系，操控性别决定通路，以及赋予对传染性疾病的抗性6,15,16,17,18,19此外，原始生殖细胞移植有助于实现物种间的生殖系传递以及濒危鸟类生殖资源的保育7,8,20,21,22,23，且PGC冷冻保存可实现遗传资源的长期保存24,25.

尽管其他类型的干细胞，包括胚胎干细胞（ESCs）26,27,28,29、诱导性多能干细胞（iPSCs）30,31,32以及精原干细胞（SSCs）33,34，已被用于禽类生殖系改造研究，但其生殖系传递效率仍低于基于原始生殖细胞（PGC）的系统。目前，PGC系统被认为是获得具有生殖系传递能力细胞的最可靠来源。

在生殖系嵌合体研究中，供体品系的选择对于区分供体来源的生殖细胞与宿主来源的细胞至关重要。韩国乌骨鸡（KOC）具有隐性的 i/i 等位基因，导致其皮肤和羽毛呈黑色，可明显区别于携带显性 I/I 等位基因的白来航鸡品系35,36。这种可见的表型差异使得在生殖系传递分析过程中能够明确识别供体来源的后代，同时也因KOC所具有的本土遗传价值而有助于生物多样性保护。

总体而言，通过原始生殖细胞介导的生殖系嵌合体制备为禽类生物技术提供了一个可靠的平台（图1）。通过确定最佳供体（HH26-28）和受体（HH14-17）发育阶段，并结合明确的培养与验证步骤，本方案可实现高效的生殖系传递，为转基因和基因组编辑禽类的制备以及珍贵禽类遗传资源的保存提供了切实可行的框架。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有涉及鸡的实验程序均由中国韩国首尔大学实验室动物资源研究所批准（IACUC批准编号：SNU-250226-4）。动物饲养于受控且卫生的环境中，并提供灭菌的水和饲料。此外，实验过程中产生的所有化学和生物废弃物（包括胰蛋白酶/EDTA溶液、PKH26标记的细胞以及胚胎或性腺组织）均按照首尔大学的生物安全和危险废物管理指南进行处理和处置。本实验方案中使用的所有试剂和设备均列于材料表中。用于供体胚胎性腺取样和细胞培养的原始生殖细胞（PGC）培养基及试剂必须无菌。

1. 鸡原始生殖细胞的分离

  1. 将新鲜受精的鸡卵在 Eyal-Giladi 和 Kochav (EGK) X 期于 37 °C 培养 5.5 天，直至胚胎发育至 HH 26–28 期。
    注意：保持湿度在 60%–65%，以确保胚胎正常发育。
  2. 使用无菌镊子小心地从 HH 26–28 期的鸡卵中分离出胚胎。
  3. 用 1× PBS 清洗胚胎，然后将胚胎置于炭粉板上，并用昆虫针固定。在体视显微镜下，使用锋利的镊子小心分离成对的胚胎性腺。
    注意：操作组织时应轻柔，以避免损伤，并确保性腺的准确分离。由于在 HH 26–28 期性腺与中肾紧密相邻，可能会无意中带入少量肾组织；但通过体视显微镜下的精细解剖和选择性培养条件，可确保仅有原始生殖细胞（PGCs）增殖，从而维持细胞纯度。
  4. 将来自三个胚胎的成对性腺转移至含有 500 µL 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 的 1.5 mL 离心管中，于 37 °C 孵育 5 分钟，以解离细胞。
  5. 加入 50 µL 胎牛血清（FBS）以灭活胰蛋白酶。
  6. 在室温（约 20–25 °C）下以 200 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。
  7. 将解离的性腺细胞重悬于 1 mL 1× PBS 中。

2. 体外 鸡原始生殖细胞的增殖

  1. 准备PGC培养基（KO-DMEM，添加20%胎牛血清、2%鸡血清、核苷、GlutaMAX、MEM非必需氨基酸、2-巯基乙醇、10 mM丙酮酸钠、抗生素-抗真菌剂和10 ng/mL bFGF），并将培养基预热至37 °C。
  2. 将从三个HH 26-28期胚胎（每个胚胎约100-150个PGC37,38）收集的解离性性腺细胞加入到每孔1 mL预热的培养基中，并接种至12孔培养板中。
  3. 轻轻摇动培养板，确保细胞均匀分布。
  4. 在37 °C、5% CO₂条件下培养PGC，每日观察细胞形态和密度。PGC呈圆形、折光性强，通常为悬浮状态，而体细胞则贴壁生长（图2A）。
    注意：该培养条件可选择性支持PGC增殖，使PGC扩增的同时，体细胞逐渐被清除。
  5. 在12孔板中培养的PGC，需每3-4天更换一次培养基，以维持最佳增殖活性和细胞存活率（图2B）。
  6. 可选：使用PGC特异性标记物（如CVH, DAZL, NANOG和POUV）验证细胞纯度，并通过PCR进行性别鉴定（表1）。
    1. 根据试剂盒说明书，使用RNA微量提取系统制备PGC样本用于RNA提取。
    2. 按照标准实验流程进行RT-PCR（如CVH, DAZL, NANOG和POUV）或使用PGC特异性标记物（SSEA1和DAZL）进行免疫染色39（图2C,D）。
    3. 按照标准实验流程进行性别鉴定PCR分析40（图2E）。

3. 使用PKH26标记法验证培养的原始生殖细胞的种系发育能力

  1. 当原始生殖细胞（PGCs）达到对数生长期时进行收集，通常在12孔板中每孔细胞密度约为1-5 × 105个细胞。
  2. 在室温（约20-25 °C）下以200 × g离心5分钟使细胞沉淀，用1× PBS重悬，并用台盼蓝检测细胞活力。
  3. 从PKH26红色荧光细胞连接试剂盒中配制稀释液C，用于常规细胞膜标记，并将其平衡至室温（约20-25 °C）。
  4. 将PKH26染料溶解，并用稀释液C配制成终浓度约为1-2 µM的工作液。
  5. 将PGC沉淀重悬于1 mL稀释液C中，迅速加入1 mL PKH26溶液（1:1比例），轻轻混匀，在室温（约20-25 °C）孵育2-5分钟。
  6. 向细胞悬液中迅速加入1 mL PKH26工作液（1:1比例），用移液器轻轻混匀，在室温（约20-25 °C）孵育2-5分钟。
    注意：孵育时间不得超过推荐时长。
  7. 通过加入FBS或含1%-5% BSA的PBS，体积为染色反应体系的2-4倍，以终止染色反应。
  8. 在室温（约20-25 °C）下以200 × g离心5分钟，用PGC培养基或含0.1% BSA的1× PBS洗涤三次。
  9. 将细胞重悬于注射缓冲液（PGC培养基或含0.1% BSA的1× PBS）中，浓度为1-5 × 104 至1 × 105 个细胞/µL。短暂置于冰上以维持细胞活性。
  10. 注射前在荧光显微镜下验证标记效果（图3A）。
  11. 将经台盼蓝计数确认的3,000个以上活细胞注入HH 14-17期的胚胎中，并继续孵育至第6天（图3B）。
  12. 在第6天确认供体PGCs对受体性腺的定植情况（图3C）。

4. 将供体原始生殖细胞移植到受体胚胎血管中

  1. 将受体卵在37 °C、60-70%湿度、每小时45°摇动的条件下孵育至HH 14-17期。
  2. 使用硼硅酸盐玻璃管（外径1.0 mm，内径0.5-0.75 mm）制备玻璃毛细移液管。用显微拉针仪拉制毛细管，并将尖端抛光至内径约为10-20 µm。
  3. 在卵的尖端开一个约0.5 cm × 0.5 cm的小窗，以便进行显微注射，同时尽量减少对胚胎的干扰。
    注意：在打开窗口前，需用70%乙醇对蛋壳表面进行消毒，以防止污染。
  4. 在体视显微镜下，将2 µL含有超过3,000个PGC的1× PBS或HBSS悬浮液注入背主动脉。
    注意：应在体视显微镜下进行注射，避免损伤胚胎或血管，并小心操作显微注射针，防止造成伤害。
  5. 用石蜡膜密封蛋壳上的窗口，将蛋尖端朝下放置，并在37.5 °C、60-70%湿度、每小时45°摇动的条件下继续孵育直至孵化。
    注意：应维持适当的温度和湿度，以确保胚胎的存活和正常发育。

5. 种系嵌合体的验证

  1. 采集孵化后 G0 代雏鸡的睾丸或卵巢。
  2. 从采集的性腺组织中提取基因组 DNA，以确认生殖系嵌合体的形成。按以下步骤进行基因组 DNA 提取：
    1. 采集睾丸或卵巢组织，加入含 1.5 µL 蛋白酶 K 的 300 µl 裂解缓冲液（2 mM Tris-HCl (pH 8.0)，10 mM EDTA，1% SDS）中匀浆，并在 60 °C 下孵育 h，以确保完全裂解。
    2. 加入 100 µL 蛋白沉淀液（7 M 醋酸铵），充分混匀后，在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。
    3. 将上清液（水相）转移至新管中，加入 500 µL 异丙醇以沉淀 DNA，然后在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。
    4. 弃去上清液，加入 1 mL 70% 乙醇，在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。
    5. 去除乙醇，在室温下将 DNA 沉淀空气干燥 10 分钟。
    6. 用 50 µL 无 RNase 水溶解 DNA，并使用分光光度计测定 DNA 浓度和纯度（A260/A280 ≈ 1.8）。
    7. 将 DNA 调整至每 PCR 反应含 10–5 ng。
  3. 使用设计的物种特异性引物（表 1）在以下条件下进行 PCR 扩增：94 °C 预变性 3 分钟，随后进行 35 个循环（94 °C 变性 30 秒，68 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 30 秒），最后在 72 °C 延伸 5 分钟（图 4A）。
  4. 采集性成熟 G0 雄性个体的精液，采用相同方案提取精子 DNA，并使用物种特异性引物进行 PCR 扩增（图 4B）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

体外鸡原始生殖细胞的增殖与鉴定
从HH 26-28期胚胎中分离含有原始生殖细胞（PGC）的完整性腺细胞，并在特定的PGC培养条件下进行培养。随着时间推移，性腺间质细胞要么贴附于培养表面，要么发生降解，而PGC则保持悬浮状态并开始活跃增殖（图2A）。经过约两周的培养，PGC群体扩增至超过1 × 105个细胞，表明在此特定条件下PGC能够有效增殖并实现选择性富集（图2B）。

为确认培养细胞的生殖细胞身份，采用生殖细胞特异性标记物进行RT-PCR分析，并开展免疫细胞化学检测。RT-PCR结果表明，细胞表达 DAZL、CVH、NANOG 和 POUV 培养中的 PGC 中的基因（图2C）。一致地，免疫染色显示SSEA-1和DAZL蛋白呈阳性表达，证实增殖细胞保留了...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

将体外培养的原始生殖细胞（PGCs）移植到受体胚胎中，为在鸡中产生生殖系嵌合体提供了一种可靠的方法。该方案利用了PGCs固有的生殖系发育潜能，相较于传统的基于胚盘的系统，提高了实验的一致性，后者容易出现嵌合现象和发育变异。该方法的一个关键优势在于其选择性 体外 在明确的培养条件下扩增原始生殖细胞（PGCs），以维持其生殖系特性。在整个培养过程中，PGCs保持典型的形态特征，表现出高增殖率，并表达生殖细胞特异性标志物（如CVH和DAZL），证实其处于未分化状态。

精确控制胚胎发育阶段对于成功移植至关重要。HH 14-17 期是最佳阶段，因为此时背主动脉完全可及，且生殖嵴易于接受细胞定植。若在该时间窗外进行胚胎注射，供体细胞可能无法高效到达生殖嵴微环境，导致生殖系嵌合率降低。因此，应通过形态学标志而非仅依靠孵化时间来确认发育阶段。建议同步各枚鸡蛋的孵化起始时间，以尽量减少发育阶段的差异。

注射技术是另一个关键因素。注射针位置不当或压力过大可能导致胚胎死亡或供体细胞丢失。为避免此类问题，我们建议使用内径经过校准的斜...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由韩国国家研究基金会（NRF）资助，该基金会由韩国政府（科技信息通信部）提供资金支持 [RS-2024-00418297]，以及韩国农村振兴厅农业科学技术发展合作研究项目 [RS-2025-02213489] 资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1x PBS HycloneSH30256
2-巯基乙醇Gibco21985023
抗生素-抗真菌素溶液（100倍浓缩）Gibco15240062
抗DAZL抗体Abcamab215718
无菌鸡血清RocklandD102-00-0500
牛胰脱氧核糖核酸酶ISigma Aldrich9003-98-9
Drummond Microcaps 一次性微量移液管 Drummond Scientific Company1-000-0500
EmbryoMax 核苷（100倍浓缩）MerckES-008-D
FBS（胎牛血清，经鉴定，美国来源，500 ml）HycloneSH30919
GlutaMAX 添加剂Gibco35050061
KnockOut DMEM 培养基Gibco10829018
MEM 非必需氨基酸溶液Gibco11140050
Parafilm M 实验室封口膜AmcorPM996 
PKH26 红色荧光细胞连接试剂盒（用于通用细胞膜标记）Sigma AldrichPKH26GL-1KT
纯化抗小鼠/人CD15（SSEA-1）抗体Biolegend125602
重组人FGF basic/FGF2/bFGF（146个氨基酸）蛋白 R&D Systems 233-FB
ReliaPrep RNA 小量提取系统PromegaZ6011
丙酮酸钠（100 mM）Gibco11360070
台盼蓝溶液SigmaT8154-100ML
胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红Gibco™15400054

参考文献

  1. van de Lavoir, M. C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
  2. Macdonald, J., Glover, J. D., Taylor, L., Sang, H. M., McGrew, M. J. Characterisation and germline transmission of cultured avian primordial germ cells. PLoS One. 5 (11), e15518(2010).
  3. Choi, J. W., et al. Basic fibroblast growth factor activates MEK/ERK cell signaling pathway and stimulates the proliferation of chicken primordial germ cells. PLoS One. 5 (9), e12968(2010).
  4. Macdonald, J., et al. Efficient genetic modification and germline transmission of primordial germ cells using piggyBac and Tol2 transposons. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (23), E1466-E1472 (2012).
  5. Park, T. S., Han, J. Y. PiggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9337-9341 (2012).
  6. Lee, H. J., et al. DMRT1 gene disruption alone induces incomplete gonad feminization in chicken. FASEB J. 35 (9), e21876(2021).
  7. Kang, S. J., et al. Reproduction of wild birds via interspecies germ cell transplantation. Biol Reprod. 79 (5), 931-937 (2008).
  8. Wernery, U., et al. Primordial germ cell-mediated chimera technology produces viable pure-line Houbara bustard offspring: potential for repopulating an endangered species. PLoS One. 5 (12), e15824(2010).
  9. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: A complementary normal table and a new look at the first stages of the development of the chick. I. General morphology. Dev Biol. 49 (2), 321-337 (1976).
  10. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).
  11. Ukeshima, A., Yoshinaga, K., Fujimoto, T. Scanning and transmission electron microscopic observations of chick primordial germ cells with special reference to the extravasation in their migration course. J Electron Microsc (Tokyo). 40 (2), 124-128 (1991).
  12. Fujimoto, T., Ukeshima, A., Kiyofuji, R. The origin, migration and morphology of the primordial germ cells in the chick embryo. Anat Rec. 185 (2), 139-145 (1976).
  13. Meyer, D. B. The migration of primordial germ cells in the chick embryo. Dev Biol. 10, 154-190 (1964).
  14. Kim, Y. M., Han, J. Y. The early development of germ cells in chicken. Int J Dev Biol. 62 (1-2-3), 145-152 (2018).
  15. Park, T. S., et al. Deposition of bioactive human epidermal growth factor in the egg white of transgenic hens using an oviduct-specific minisynthetic promoter. FASEB J. 29 (6), 2386-2396 (2015).
  16. Kim, Y. M., et al. The transgenic chicken derived anti-CD20 monoclonal antibodies exhibits greater anti-cancer therapeutic potential with enhanced Fc effector functions. Biomaterials. 167, 58-68 (2018).
  17. Rengaraj, D., et al. Dissecting chicken germ cell dynamics by combining a germ cell tracing transgenic chicken model with single-cell RNA sequencing. Comput Struct Biotechnol J. 20, 1654-1669 (2022).
  18. Park, J. S., et al. Production of recombinant human IgG1 Fc with beneficial N-glycosylation pattern for anti-inflammatory activity using genome-edited chickens. Commun Biol. 6 (1), 589(2023).
  19. Idoko-Akoh, A., et al. Creating resistance to avian influenza infection through genome editing of the ANP32 gene family. Nat Commun. 14 (1), 6136(2023).
  20. Ono, T., Yokoi, R., Aoyama, H. Transfer of male or female primordial germ cells of quail into chick embryonic gonads. Exp Anim. 45 (4), 347-352 (1996).
  21. Reynaud, G. The transfer of turkey primordial germ cells to chick embryos by intravascular injection. J Embryol Exp Morphol. 21 (3), 485-507 (1969).
  22. Liu, C., et al. Production of chicken progeny (Gallus gallus domesticus) from interspecies germline chimeric duck (Anas domesticus) by primordial germ cell transfer. Biol Reprod. 86 (4), 101(2012).
  23. van de Lavoir, M. C., et al. Interspecific germline transmission of cultured primordial germ cells. PLoS One. 7 (5), e35664(2012).
  24. Naito, M., Tajima, A., Tagami, T., Yasuda, Y., Kuwana, T. Preservation of chick primordial germ cells in liquid nitrogen and subsequent production of viable offspring. J Reprod Fertil. 102 (2), 321-325 (1994).
  25. Tajima, A., Naito, M., Yasuda, Y., Kuwana, T. Production of germline chimeras by transfer of cryopreserved gonadal primordial germ cells (gPGCs) in chicken. J Exp Zool. 280 (3), 265-267 (1998).
  26. Carsience, R. S., Clark, M. E., Verrinder Gibbins, A. M., Etches, R. J. Germline chimeric chickens from dispersed donor blastodermal cells and compromised recipient embryos. Development. 117 (2), 669-675 (1993).
  27. Petitte, J. N., Liu, G., Yang, Z. Avian pluripotent stem cells. Mech Dev. 121 (9), 1159-1168 (2004).
  28. Petitte, J. N., Clark, M. E., Liu, G., Verrinder Gibbins, A. M., Etches, R. J. Production of somatic and germline chimeras in the chicken by transfer of early blastodermal cells. Development. 108 (1), 185-189 (1990).
  29. Pain, B., et al. Long-term in vitro culture and characterisation of avian embryonic stem cells with multiple morphogenetic potentialities. Development. 122 (8), 2339-2348 (1996).
  30. Rossello, R. A., et al. Mammalian genes induce partially reprogrammed pluripotent stem cells in non-mammalian vertebrate and invertebrate species. Elife. 2, e00036(2013).
  31. Lu, Y., et al. Avian-induced pluripotent stem cells derived using human reprogramming factors. Stem Cells Dev. 21 (3), 394-403 (2012).
  32. Kim, Y. M., Park, Y. H., Lim, J. M., Jung, H., Han, J. Y. Technical note: Induction of pluripotent stem cell-like cells from chicken feather follicle cells. J Anim Sci. 95 (8), 3479-3486 (2017).
  33. Han, J. Y., et al. Production of quail (Coturnix japonica) germline chimeras by transfer of Ficoll-enriched spermatogonial stem cells. Theriogenology. 154, 223-231 (2020).
  34. Pramod, R. K., et al. Isolation, characterization, and in vitro culturing of spermatogonial stem cells in Japanese Quail (Coturnix japonica). Stem Cells Dev. 26 (1), 60-70 (2017).
  35. Park, T. S., et al. Improved germline transmission in chicken chimeras produced by transplantation of gonadal primordial germ cells into recipient embryos. Biol Reprod. 68 (5), 1657-1662 (2003).
  36. Chang, I. K., et al. Production of germline chimeric chickens by transfer of cultured primordial germ cells. Cell Biol Int. 21 (8), 495-499 (1997).
  37. Nakamura, Y., et al. Migration and proliferation of primordial germ cells in the early chicken embryo. Poult Sci. 86 (10), 2182-2193 (2007).
  38. Kuwana, T. Migration of Avian Primordial Germ Cells toward the Gonadal Anlage: (avian/PGC/migration/presumptive gonad/chimera). Dev Growth Differ. 35 (3), 237-243 (1993).
  39. Jung, K. M., Kim, Y. M., Ono, T., Han, J. Y. Size-dependent isolation of primordial germ cells from avian species. Mol Reprod Dev. 84 (6), 508-516 (2017).
  40. Ogawa, A., et al. Molecular characterization and cytological mapping of a non-repetitive DNA sequence region from the W chromosome of chicken and its use as a universal probe for sexing carinatae birds. Chromosome Res. 5 (2), 93-101 (1997).
  41. Park, K. J., et al. Gamma-irradiation depletes endogenous germ cells and increases donor cell distribution in chimeric chickens. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (10), 828-833 (2010).
  42. Nakamura, Y., et al. Germline replacement by transfer of primordial germ cells into partially sterilized embryos in the chicken. Biol Reprod. 83 (1), 130-137 (2010).
  43. Song, Y., D'Costa, S., Pardue, S. L., Petitte, J. N. Production of germline chimeric chickens following the administration of a busulfan emulsion. Mol Reprod Dev. 70 (4), 438-444 (2005).
  44. Lee, H., et al. Compensatory proliferation of endogenous chicken primordial germ cells after elimination by busulfan treatment. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 136(2013).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

PGC CRISPR Cas9 PCR

相关文章