生产鸡胚系嵌合体的逐步操作流程 通过 原始生殖细胞移植

摘要

通过将原始生殖细胞（PGCs）移植到受体胚胎中生成的禽类生殖系嵌合体，可用于转基因、基因编辑以及物种保护等应用。本方案详细描述了PGCs的分离步骤， 体外 扩增、显微注射和供体验证，为生产生殖系嵌合体并推动禽类生物技术发展提供了可靠的平台。

摘要

鸡胚系嵌合体的制备 通过 原始生殖细胞（PGCs）移植为禽类转基因、基因组编辑和物种保护提供了稳定且可重复的技术平台。传统的基于EGK X期胚胎胚盘细胞的方法由于早期细胞谱系分离，导致种系传递效率较低，应用受到限制。相比之下，基于PGCs的策略利用了这些单能细胞固有的种系发育潜能，可实现其在受体性腺中的稳定整合。本文介绍了一种从HH 26–28期胚胎中分离原始生殖细胞，并进行体外维持与扩增的分步实验方案 体外并将它们移植到HH 14-17期受体胚胎的背主动脉中。短期定植可通过PKH26等荧光标记进行监测，而长期生殖系嵌合则通过受体性腺的PCR分析加以确认。该方法可稳定生成生殖系嵌合体，同时保持供体原始生殖细胞（PGCs）的活力和功能完整性。此外，该技术与CRISPR/Cas9及基于转座子的载体等基因组编辑工具兼容，可用于构建转基因和基因编辑的禽类模型。除基础研究外，该策略还可通过种间生殖系传递和遗传资源保存支持物种保护工作。总体而言，本方案为禽类生殖系操作提供了全面且可靠的框架，为家禽生物技术领域的基础与应用研究提供了多功能平台。

引言

原始生殖细胞（PGC）介导的生殖系传递是将遗传信息传递给鸟类下一代的最有效方法^1,2,3。生殖系嵌合体是指同时携带供体和宿主来源生殖细胞的个体，能够将供体的遗传物质传递给后代，在转基因技术、功能基因组学以及濒危物种保护等方面具有重要应用价值^4,5,6,7,8。与依赖胚盘细胞的方法相比，PGC介导的策略具有更高的生殖系传递效率和可重复性，因此更适用于精确的遗传操作。

在鸟类中，原始生殖细胞（PGCs）起源于Eyal-Giladi和Kochav（EGK）X期胚盘的中央透明区⁹ 随后迁移至Hamburger和Hamilton（HH）4期的生殖新月区¹⁰在HH 9至12期之间，原始生殖细胞（PGCs）循环流动 通过 在定居于生殖嵴之前，胚胎期的血管

方案

所有涉及鸡的实验程序均由中国韩国首尔大学实验室动物资源研究所批准（IACUC批准编号：SNU-250226-4）。动物饲养于受控且卫生的环境中，并提供灭菌的水和饲料。此外，实验过程中产生的所有化学和生物废弃物（包括胰蛋白酶/EDTA溶液、PKH26标记的细胞以及胚胎或性腺组织）均按照首尔大学的生物安全和危险废物管理指南进行处理和处置。本实验方案中使用的所有试剂和设备均列于材料表中。用于供体胚胎性腺取样和细胞培养的原始生殖细胞（PGC）培养基及试剂必须无菌。

1. 鸡原始生殖细胞的分离

1. 将新鲜受精的鸡卵在 Eyal-Giladi 和 Kochav (EGK) X 期于 37 °C 培养 5.5 天，直至胚胎发育至 HH 26–28 期。
   注意：保持湿度在 60%–65%，以确保胚胎正常发育。
2. 使用无菌镊子小心地从 HH 26–28 期的鸡卵中分离出胚胎。
3. 用 1× PBS 清洗胚胎，然后将胚胎置于炭粉板上，并用昆虫针固定。在体视显微镜下，使用锋利的镊子小心分离成对的胚胎性腺。
   注意：操作组织时应轻柔，以避免损伤，并确保性腺的准确分离。由于在 HH 26–28 期性腺与中肾紧密相邻，可能会无意中带入少量肾组织；但通过体视显微镜下的精细解剖和选择性培养条件，可确保仅有原始生殖细胞（PGCs）增殖，从而维持细胞纯度。
....

结果

体外鸡原始生殖细胞的增殖与鉴定
从HH 26-28期胚胎中分离含有原始生殖细胞（PGC）的完整性腺细胞，并在特定的PGC培养条件下进行培养。随着时间推移，性腺间质细胞要么贴附于培养表面，要么发生降解，而PGC则保持悬浮状态并开始活跃增殖（图2A）。经过约两周的培养，PGC群体扩增至超过1 × 10⁵个细胞，表明在此特定条件下PGC能够有效增殖并实现选择性富集（图2B）。

为确认培养细胞的生殖细胞身份，采用生殖细胞特异性标记物进行RT-PCR分析，并开展免疫细胞化学检测。RT-PCR结果表明，细胞表达 DAZL、CVH、NANOG 和 POUV 培养中的 PGC 中的基因（图2C）。一致地，免疫染色显示SSEA-1和DAZL蛋白呈阳性表达，证实增殖细胞保留了.......

讨论

将体外培养的原始生殖细胞（PGCs）移植到受体胚胎中，为在鸡中产生生殖系嵌合体提供了一种可靠的方法。该方案利用了PGCs固有的生殖系发育潜能，相较于传统的基于胚盘的系统，提高了实验的一致性，后者容易出现嵌合现象和发育变异。该方法的一个关键优势在于其选择性 体外 在明确的培养条件下扩增原始生殖细胞（PGCs），以维持其生殖系特性。在整个培养过程中，PGCs保持典型的形态特征，表现出高增殖率，并表达生殖细胞特异性标志物（如CVH和DAZL），证实其处于未分化状态。

精确控制胚胎发育阶段对于成功移植至关重要。HH 14-17 期是最佳阶段，因为此时背主动脉完全可及，且生殖嵴易于接受细胞定植。若在该时间窗外进行胚胎注射，供体细胞可能无法高效到达生殖嵴微环境，导致生殖系嵌合率降低。因此，应通过形态学标志而非仅依靠孵化时间来确认发育阶段。建议同步各枚鸡蛋的孵化起始时间，以尽量减少发育阶段的差异。

注射技术是另一个关键因素。注射针位置不当或压力过大可能导致胚胎死亡或供体细胞丢失。为避免此类问题，我们建议使用内径经过校准的斜.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x PBS	Hyclone	SH30256
2-巯基乙醇	Gibco	21985023
抗生素-抗真菌素溶液（100倍浓缩）	Gibco	15240062
抗DAZL抗体	Abcam	ab215718
无菌鸡血清	Rockland	D102-00-0500
牛胰脱氧核糖核酸酶I	Sigma Aldrich	9003-98-9
Drummond Microcaps 一次性微量移液管	Drummond Scientific Company	1-000-0500
EmbryoMax 核苷（100倍浓缩）	Merck	ES-008-D
FBS（胎牛血清，经鉴定，美国来源，500 ml）	Hyclone	SH30919
GlutaMAX 添加剂	Gibco	35050061
KnockOut DMEM 培养基	Gibco	10829018
MEM 非必需氨基酸溶液	Gibco	11140050
Parafilm M 实验室封口膜	Amcor	PM996
PKH26 红色荧光细胞连接试剂盒（用于通用细胞膜标记）	Sigma Aldrich	PKH26GL-1KT
纯化抗小鼠/人CD15（SSEA-1）抗体	Biolegend	125602
重组人FGF basic/FGF2/bFGF（146个氨基酸）蛋白	R&D Systems	233-FB
ReliaPrep RNA 小量提取系统	Promega	Z6011
丙酮酸钠（100 mM）	Gibco	11360070
台盼蓝溶液	Sigma	T8154-100ML
胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红	Gibco™	15400054