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方法文章

一种新型大鼠桡骨骨折内固定模型的建立：骨折愈合评估与背根神经节分离

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DOI：

10.3791/69707

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2026年3月13日

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1Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, 2School of Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, 3School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, 4Nantong Tongzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, 5Institute of Modern Biology, Nanjing University

通讯作者： Qifeng Zhang <zhangqf126@126.com>, Lin Xie <xielin@njucm.edu.cn>, Linlin Chen <chenlinlin@njucm.edu.cn>

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

该研究创新性地结合缝合线与钛针，在大鼠桡骨骨折模型中实现稳定的内固定。通过微型计算机断层扫描（micro-CT）评估骨折愈合情况，并分离培养原代背根神经节（DRG）神经元以进行后续研究。

摘要

大鼠桡骨骨折模型在骨科研究中具有重要意义，尤其适用于骨折愈合机制、药物筛选以及生物材料评价的研究。尽管存在某些局限性，该模型在科学研究中的作用仍不可替代。由于大鼠桡骨相对较细，临床上常用的钢板和螺钉并不适用于大鼠桡骨骨折的治疗。为克服这一限制，本研究创新性地采用缝线联合钛针固定的内固定方法，构建了一种针对桡骨骨折的内固定动物模型，可提供相对稳定的固定效果，为研究此类骨折的内固定治疗建立了可靠的动物模型。通过活体小动物微计算机断层扫描（micro-CT）系统对Sprague-Dawley（SD）大鼠桡骨骨折愈合情况进行在体成像检测。大鼠背根神经节（DRG）的提取与应用是神经科学研究中的重要步骤，广泛应用于神经科学、病理学和细胞生物学等领域。本实验方案适用于桡骨骨折大鼠背根神经节神经元的原代培养，可用于研究骨折后神经损伤与修复的机制，例如神经元凋亡和神经递质释放等过程。

引言

桡骨骨折是临床上最常见的骨折之一，全球发病率较高，在四肢长骨骨折中居于首位1,2,3。人群研究表明，桡骨骨折的年龄分布呈双峰模式，通常在儿童和老年人群中达到高峰4。治疗延迟常导致前臂旋转功能障碍，严重影响日常生活活动能力（ADLs）5,6。桡骨骨折的治疗仍存在争议，主要集中在骨折分类系统和治疗方式的选择上7,8。临床证据表明，切开复位内固定术（ORIF）可显著改善肘关节或腕关节的活动范围（ROM）及肌力恢复9；然而，该方法与较高的术后感染率以及与内固定相关的并发症发生率相关10,11。

背根神经节（DRG）在周围神经系统与中枢神经系统（CNS）之间的感觉信息传递中起着关键的解剖学和功能桥梁作用。除了收集和传递周围感觉信号（如触觉、温度觉）这一主要功能外，DRG还积极参与异常感觉（如疼痛）的调控，因此成为正常感觉功能及临床疼痛管理的关键结构12,13,14。DRG的病理改变，如损伤、炎症或神经退行性病变，可引发感觉异常（如麻木、刺痛）或慢性疼痛，使其成为神经科学与疼痛医学研究的焦点。

此处选用约8周龄、体重约200 g的雄性SD大鼠，用于构建（1）大鼠桡骨横断骨折内固定模型及愈合后评估，以及（2）分离与 体外 采用桡骨骨折内固定模型大鼠的背根神经节（DRG）培养。本方案旨在促进针对骨折愈合机制、DRG介导的感觉改变以及骨折后疼痛或功能障碍潜在治疗靶点的研究中可重复的实验操作。

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方案

所有动物实验均经南京中医药大学动物伦理委员会批准（编号：202508A046）。后续实验所用大鼠均饲养于特定病原体阴性（SPF）环境中。实验方案示意图见图1。

1. 建立大鼠桡骨骨折内固定模型

注意：在手术前，将大鼠适应于安静且具有柔和漫射光线的环境，避免暴露于噪音和强烈光照。在操作过程中，应以轻柔的手法固定大鼠的腹部和胸部，提供支撑，避免抓握尾巴；已知抓尾会引起疼痛和应激，并增加因挣扎带来的不适。

  1. 按 图2 所示准备手术器械。手术器械包括手术刀片、手术刀柄、手术剪、持针器、止血钳和有齿组织钳。雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠约8周龄，体重约200 g。
  2. 使用异氟烷气体麻醉机对大鼠进行麻醉。诱导时使用4%异氟烷，并在整个手术过程中通过鼻罩维持2%异氟烷的呼吸麻醉。保持手术室温度约为28 °C。
    注意：通过检查生命体征（如呼吸和心率）、角膜反射（无反应表示麻醉有效）、眨眼反射（消失）以及脚趾收缩反应（刺激后无回缩）来判断麻醉是否成功。
  3. 将大鼠置于侧卧位，暴露右侧前肢，使用电动剃毛器剃除局部毛发。铺无菌巾，并在右侧前肢近端缠绕止血带以减少术中出血。
  4. 使用酒精和聚维酮碘溶液交替擦拭皮肤三次，进行皮肤准备。
  5. 在右侧前臂桡背侧做一条长约1.5 cm的纵行切口，如 图3 所示。分离肌间隙，充分暴露右侧前肢桡骨。
    注意：通过钝性分离肌间隙暴露桡骨。仅暴露桡骨背侧肌肉，不完全剥离周围肌肉组织。
  6. 使用手术剪横向剪断桡骨，造成横行骨折。手术剪应与桡骨呈90度角（图4）。
  7. 取一根直径0.8 mm、长10 mm的钛针，沿其纵轴方向插入桡骨骨折端（图5）。使用缝线（4-0 [1.5公制] 编织丝线，不可吸收）将桡骨与钛针固定，如 图6 所示。
  8. 打三个连续结，通过四针间断缝合将钛针牢固固定于桡骨上。
    注意：骨折近端和远端各固定两次。
  9. 使用缝线（4-0 [1.5公制] 编织丝线，不可吸收）缝合皮肤，剪除多余缝线，关闭伤口。用聚维酮碘溶液擦拭皮肤进行消毒。
  10. 用无菌纱布覆盖伤口，并用绷带固定。将大鼠放入笼中，直至其从麻醉中恢复意识。
  11. 术后疼痛管理：
    1. 若动物出现疼痛迹象、拒食和/或后肢行走迟疑，应咨询兽医人员并给予额外镇痛药物。
      注意：头孢呋辛钠用于治疗细菌感染。盐酸曲马多用于镇痛治疗。

2. 微型CT成像

  1. 使用异氟烷气体（诱导剂量 4%）麻醉机对大鼠进行麻醉。
  2. 将大鼠俯卧位置于扫描腔内，调整四肢和头部位置，使目标扫描区域位于视野中心，并在整个过程中持续维持通气和麻醉（2% 异氟烷）。
  3. 将固定好的动物床推入扫描腔，并关闭腔室门。
  4. 设置微型 CT 扫描参数如下：扫描模式：标准；曝光时间：2 分钟；视野：72 mm；体素尺寸：144 µm；电压：90 kV；电流：88 µA；滤波器：3D-软滤波。
    注意：扫描数据将自动传输至软件，并生成三维 CT 图像。
  5. 分离目标组织。
    1. 从原始微型 CT 图像中分析选定的骨组织区域。移动传递函数线，将骨组织与肌肉组织分离，避免包含过多肌肉组织。对分割后的骨组织区域进行高分辨率重建，生成三维模型。
  6. 导出处理后的图像。
    1. 图像处理完成后，找到并点击 结束 按钮，以完成当前工作流程。
    2. 弹出窗口将出现，首先选择 静态 ，以确认您要导出的是静态图像（而非动态序列）。
    3. 从可用选项中选择 jpeg 作为输出文件格式。
    4. 选择 大尺寸，以确保导出的图像保留足够高的分辨率，适用于分析或存档。
    5. 点击 确定 完成导出过程。

3. 桡骨骨折大鼠背根神经节的分离与培养

注意：采用4%异氟烷吸入麻醉后，迅速进行颈椎脱位以处死动物。在建立桡骨骨折模型20天后提取背根神经节（DRGs）。

  1. 切断脊柱，取出 C1-C7 椎体。沿颈椎的前正中线和后正中线切开，将颈椎分为左右两半。必要时切除棘突，以方便操作。
  2. 轻轻清除椎间孔内的脊髓组织和神经纤维。用装有 PBS 的注射器冲洗椎间孔，去除血液，暴露侧隐窝。
    注意：背根神经节（DRG）位于侧隐窝内，呈浅黄色结节状，两端有神经纤维相连。
  3. 使用齿状组织镊夹住 DRG，轻轻提起，然后用手术剪剪断两端的神经纤维。
  4. 将提取的 DRG 转移至含有提取液的 1.5 mL 离心管中，置于冰上。
    注意：提取液的配制方法为在 α-最低必需培养基（α-MEM）中加入 2% 胎牛血清（FBS）。DRG 在提取液中孵育约 30 分钟后，再进行下一步操作。
  5. 缓慢吸除并弃去提取液。加入 1 mL 混合消化酶工作液，在 37 °C 水浴中消化 60–70 分钟。
    注意：混合消化酶工作液的配制方法为将 100 mg I 型胶原酶和 100 mg 中性蛋白酶（dispase）溶于 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。使用时将其稀释成 5 mg/mL 的工作液，并置于冰上保存。
  6. 用移液器吸取适量纤连蛋白工作液加入培养皿中进行包被，然后在 37 °C 孵育 1 小时。
    注意：人血浆纤连蛋白工作液（Fibronectin working solution）通过将 1 mg/mL 的纤连蛋白储备液用 ddH₂O 稀释至 0.02 mg/mL 制得。
  7. 消化完成后，吸除并弃去混合消化酶工作液。加入 1 mL 完全培养基，轻轻吹打 DRG 组织数次。
    注意：完全培养基的配制方法为将 45 mL MEM-α 培养基、4.5 mL FBS 和 0.5 mL 青霉素-链霉素（PS）溶液混合，经 0.22 µm 滤膜过滤除菌。
  8. 收集滤液，在 25 °C 下以 75 × g 离心 8.5 分钟。
  9. 离心后，吸除并弃去离心管中的上清液，加入 1 mL 完全培养基重悬沉淀。
  10. 取出培养皿，弃去纤连蛋白工作液，用 PBS 洗涤两次。
  11. 将细胞接种至包被好的培养皿中，加入 1 mL 完全培养基，在 37 °C、5% CO₂ 的恒温培养箱中孵育 8–12 小时。
  12. 孵育 8–12 小时后，将完全培养基更换为换液培养基，之后每 2–3 天更换一半体积的新鲜换液培养基。
    注意：换液培养基的配制方法为将 44.5 mL MEM-α 培养基、4.5 mL FBS、0.5 mL 青霉素-链霉素（PS）溶液和 0.5 mL 脱氧尿苷混合，经 0.22 µm 滤膜过滤除菌。

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结果

显微CT图像证实了图7中大鼠桡骨骨折模型的成功建立，以及图8中大鼠桡骨骨折内固定模型的构建。显微CT图像分别在建立骨折内固定模型当天和建模后20天进行对比。建模20天后，对骨折模型组SD大鼠进行的显微CT分析显示预后良好。图像显示建模区域的骨折线模糊，提示骨折部位的骨组织已基本愈合。在骨折断端之间可见骨痂形成，骨痂逐渐融合并进一步掩盖了骨折线——符合骨性愈合的中期至晚期表现。值得注意的是，骨折部位周围还可见明显的骨痂形成：作为愈合过程中新生的骨组织，骨痂起到稳定骨折断端并为最终愈合奠定基础的作用（图8）。本研究共使用10只大鼠建立桡骨骨折内固定模型，所有大鼠在骨折手术后均存活，且肢体活动自如。每组随机选取2只大鼠进行显微CT成像检测，仅对这2只大鼠在建模后0天和20天进行显微CT检查。本研究未对骨折愈合过程进行定量统计分析。

如图8所示，骨痂表现...

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讨论

桡骨骨折是临床实践中最常见的长骨骨折之一。其愈合过程涉及骨组织修复与神经调控之间的复杂相互作用（例如背根神经节释放的神经肽和神经营养因子对成骨细胞/破骨细胞的调控）15,16,17,18。大鼠因其清晰的遗传背景和较短的繁殖周期，是研究骨折愈合机制的经典模型。然而，其桡骨直径仅为约1.0–1.5 mm的解剖特点，导致无法匹配临床标准的内固定装置（如1.5 mm螺钉和接骨板），这严重限制了其在神经-骨愈合研究中的应用。简单的髓内针固定易发生旋转不稳定，钢丝固定可能切割骨皮质，而外固定则会增加创伤并干扰局部神经微环境19,20,21,22

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披露

所有作者均声明不存在潜在的利益冲突。

致谢

本工作得到了江苏省中医药学会科研项目（XYLD2024038）和南通市卫生健康委员会科研项目（QNZ2023115）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5-氟-2'脱氧尿苷sigmaF0503
头孢呋辛钠 中国山东润泽制药有限公司国药准字 H20205058
DAPI染色液BiyotimeC1005
Dispase上海源叶生物科技有限公司S25046
胎牛血清（FBS）赛默飞世尔科技16000-044
止血钳 上海医疗器械（集团）有限公司 J31070
人血浆纤连蛋白（Human Fibronectin） sigmaF0895
异氟烷真实世界数据R510-22-10 
活体动物微型CT成像系统美国珀金埃尔默Quantum GX 
MEM-ALPHA 培养基 生物信息学C3060
持针器 上海医疗器械（集团）有限公司 200622
手术剪 上海医疗器械（集团）有限公司 J21130
青霉素Solarbio140051251
青霉素-链霉素溶液 NovaCellsN-PSS125
聚维酮碘美仑生物MB1313800g
手术刀片上海医疗器械（集团）有限公司RYY070
手术刀柄上海医疗器械（集团）有限公司 J11010
缝合线 Johnson &强生医疗（中国）有限公司 SA84G
缝合针上海小鱼医疗器械有限公司 Δ3/8 ·3×6
钛针天津玉通医疗器械 2-0X250 
有齿组织镊 上海医疗器械（集团）有限公司 J41055
盐酸曲马多江苏九旭药业有限公司，中国CYHB2201997
Tubulin beta-IIIsigmaCBL412X
I型胶原酶 赛默飞世尔科技17100-017
蔡司Axio Vert A1倒置荧光显微镜ZeissAxio Vert A1

参考文献

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