Staphylococcus spp 菌株中由自动化系统检测的替考拉宁耐药性是否可靠？

摘要

本文介绍了一种通过与肉汤微量稀释法（BMD）进行比较，评估自动化系统（VITEK 2）测定Staphylococcus分离株对替考拉宁敏感性的可靠性的实验方案，可用于确认耐药性并指导合理的抗菌治疗。

摘要

共计 467 金黄色葡萄球菌 (S. aureus）和 66 株凝固酶阴性 金黄色葡萄球菌 2022年6月至2024年12月期间收集的凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）分离株被纳入本研究。替考拉宁敏感性检测采用自动化抗菌药物敏感性检测系统、肉汤微量稀释法（BMD）和梯度扩散法进行。71.7%的分离株检出甲氧西林耐药性 S. aureus 分离株及所有凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）分离株中。本研究中，13 S. aureus 分离株和4株凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）分离株通过自动化药敏试验系统被鉴定为替考拉宁耐药。全部13株 S. aureus 分离株经梯度试验和肉汤微稀释法（BMD）检测均显示对替考拉宁敏感。4株凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）中，梯度试验将其全部鉴定为敏感，而BMD法将其中2株判定为敏感，另2株为耐药。共在4株菌株中检出替考拉宁耐药性。S. capitis （n = 1）和 S. haemolyticus （n = 3）的凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）分离株通过BMD法检测。BMD法鉴定出的4株对替考拉宁耐药的CoNS菌株均分离自血培养；其中3株来自儿科患者，1株来自成人患者。总体而言，耐甲氧西林的 S. aureus 研究中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的检出率相对较高，且所有凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）分离株均对甲氧西林耐药。此外，自动化系统在检测替考拉宁耐药性方面被发现不可靠，被鉴定为耐药的分离株应通过肉汤微稀释法（BMD）进行确认。鉴于替考拉宁是用于治疗MRSA及耐甲氧西林CoNS等病原体的最后手段抗生素，其敏感性应被密切监测。

引言

Staphylococcus aureus (S. aureus) 是临床上最重要的Staphylococcus菌种之一，因其具有多种毒力因子，并可在多种组织和器官中引起严重感染。该菌可导致皮肤和软组织感染、深部组织感染、呼吸道感染、泌尿道感染以及血流感染，至今仍是医院环境中最重要的病原体之一^1,2。特别是耐甲氧西林S. aureus (MRSA)，是全球范围内医疗机构相关感染的主要病因之一，也是术后伤口感染的主要致病因素^2,3。凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）虽为正常皮肤菌群的一部分，但近年来越来越多地被发现与局部及全身性感染相关。这一趋势导致对抗菌药物敏感性检测的需求日益增加，从而也提高了对替考拉宁等糖肽类抗生素耐药性的检出率⁴。

因为 S. aureus 凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）菌株通常对β-内酰胺类抗生素耐药，因此主要使用糖肽类抗生素（尤其是万古霉素和替考拉宁）治疗此类感染5。随着耐药性革兰阳性医院获得性病原菌的流行率不断上升，糖肽类抗生素的使用范围随之扩大，这也导致细菌对这些药物的敏感性逐渐下降。^5,6万古霉素和替考拉宁具有相似的抗菌疗效；然而，多项研究表明，替考拉宁的不良反应较少，尤其是肾毒性较低^7,8因此，对于中性粒细胞减少症、菌血症或肾功能受损等特定患者群体，替考拉宁常被视为万古霉素的合适替代药物^9,10.

快速且准确地测定糖肽类抗生素的敏感性至关重要，因为这类药物广泛用于耐甲氧西林Staphylococcus感染的治疗，且近年来关于糖肽类耐药菌株的报道日益增多¹¹。目前已有多种实验室方法可用于评估Staphylococcus菌种对糖肽类抗生素的敏感性，包括琼脂稀释法、梯度扩散试验、肉汤微量稀释法（BMD）以及自动化抗菌药物敏感性检测系统⁵。既往研究报道，在检测Staphylococcus菌种对糖肽类（尤其是替考拉宁）的敏感性降低或耐药性方面，自动化系统与参考方法之间存在结果差异^4,11。

本研究旨在评估自动化抗菌药物敏感性试验系统在测定Staphylococcus（葡萄球菌）分离株对替考拉宁敏感性方面的可靠性，并以肉汤微量稀释法（参考标准方法）作为对照。对自动化系统性能特征的评估，有助于临床实验室判断其在临床实践中常规检测糖肽类药物敏感性的适用性。

方案

本研究于2025年1月27日获得当地伦理委员会批准（方案编号：HRU/25.02.03）。研究遵循赫尔辛基宣言的原则进行。

1. 研究设计

本回顾性研究评估了自动化抗菌药物敏感性试验系统在测定Staphylococcus属细菌对替考拉宁敏感性方面的性能，并将结果与肉汤微量稀释（BMD）参考方法及梯度试验方法进行了比较。

2. 分离株的筛选

1. 临床分离株的收集
   1. 共计包括 467 S. aureus 和66株凝固酶阴性 金黄色葡萄球菌 2022年6月至2024年12月期间从不同临床标本中分离的凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）菌株。
   2. 按照诊断实验室的常规微生物学操作程序处理所有临床标本。
   3. 分析时每个患者仅纳入一个分离株。排除同一患者从不同标本中获得的重复分离株。
2. 初步鉴定与筛选
   1. 使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF MS）对所有分离株进行种水平鉴定。
   2. 测试 S. aureus 使用VITEK 2 AST-P664药敏卡和自动化药敏试验系统检测凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）分离株对甲氧西林的耐药性及对替考拉宁的敏感性。
   3. 记录自动化药敏试验系统生成的最低抑菌浓度（MIC）值，以供后续比较。
3. 分离物保存与传代培养
   1. 在完成自动化药敏试验系统检测后，将分离株储存于添加了20%甘油的胰蛋白胨大豆肉汤中，置于−80 °C保存。
   2. 在进行参考检测之前，将分离株在室温下解冻，并在5%羊血琼脂培养基上连续传代培养两次。
   3. 每次传代后，将培养板在37 °C孵育24小时，以确保纯度和细胞活力。

3. 抗微生物药物敏感性试验

1. 肉汤微量稀释法（BMD）
   1. 替考拉宁溶液的制备
      1. 将替考拉宁粉末溶于阳离子调节的 Mueller-Hinton 肉汤（CAMHB）中，配制成浓度为 2560 mg/L 的储备液。
   2. 肉汤微量稀释操作步骤
      1. 使用无菌的96孔U型底微量培养板进行肉汤微量稀释试验。
      2. 向每孔中加入100 µL CAMHB。将替考拉宁储备液进行10倍稀释后，取100 µL加入第一孔。
      3. 在第1至第10孔中进行2倍系列稀释，获得终浓度范围为64至0.125 µg/mL的抗生素梯度。
      4. 第11孔设为生长对照，含CAMHB和细菌接种物；第12孔设为阴性对照，仅含CAMHB¹²。
   3. 接种物制备与培养
      1. 将纯培养的细菌菌落悬浮于无菌生理盐水中，调整菌液浊度至相当于0.5麦氏标准。
      2. 在CAMHB中进行1:100稀释，取100 µL菌悬液加入第1至第11孔，使终末接种浓度约为5 × 10⁵ CFU/mL。
      3. 将微量培养板置于37 °C条件下，在普通大气环境中培养24小时¹²。
   4. 最低抑菌浓度（MIC）的测定与判读
      1. 将最低抑菌浓度（MIC）定义为在培养后完全抑制可见细菌生长的最低替考拉宁浓度。
      2. 根据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）第14.0版指南对MIC值进行判读¹³。

4. 质量控制

1. 使用金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus ATCC 29213 作为质控菌株，其替考拉宁 MIC 参考范围为 0.25–1 mg/L。

5. 统计学分析

1. 方法比较
   1. 将使用自动化药敏试验系统获得的替考拉宁最小抑菌浓度（MIC）结果与使用BMD参考方法获得的结果进行比较。
   2. 将分类一致性（CA）定义为两种方法在敏感或耐药结果上的一致。
2. 误差分类
   1. 将极重大误差（VME）定义为自动化药敏试验系统判定为敏感但BMD方法判定为耐药的菌株。
   2. 将重大误差（ME）定义为自动化药敏试验系统判定为耐药但BMD方法判定为敏感的菌株。
3. 性能标准
   1. 根据已发表的评价标准^14,15，当分类一致性≥90%，且极重大误差和重大误差的发生率均≤3%时，认为方法性能可接受。

结果

在为期2.5年的时间内，共收集了533株从临床样本中分离的菌株用于分析。所有耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（MR-CoNS）分离株以及71.7%的S. aureus分离株均被发现具有甲氧西林耐药性。伤口拭子样本是分离出S. aureus分离株最常见的临床标本，而MR-CoNS分离株则最常从血培养中获得（图1）。

图1：分离出Staphylococcus菌种的临床样本数量。本图...

讨论

抗菌素耐药性是全球公共卫生面临的最严重威胁之一，可导致医疗成本增加、治疗失败和死亡率上升³。由金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）引起的社区和医院感染的发生率在全国和全球范围内持续上升。其中，甲氧西林耐药性与更高的发病率和死亡率相关，因此，全球范围内常规监测其耐药谱¹⁶。

根据2023年澳大利亚血流感染监测报告，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的检出率为16.1%¹⁷土耳其开展的研究报告的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）检出率范围为9.6%至62.3%^{2,15,16,18,19}，而2021年欧洲...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
阳离子调节的穆勒-欣顿肉汤	Sigma-Aldrich，德国达姆施塔特	CM0405B	肉汤微量稀释法中的细菌生长
MALDI-TOF 质谱	VITEK MS，BioMé里厄，法国	410893	用于细菌鉴定
麦氏比浊标准	bioMé里厄，法国	95060-958	细菌接种物的标准化
培养皿	RTA, Tü中国台湾	2102	用于培养基制备和细菌培养
20 - 200 微升移液器吸头 μL	Sigma-Aldrich，德国达姆施塔特	Z740105	用于阳离子调节的穆勒-欣顿肉汤的分布–Hinton 肉汤（CAMHB）加入 U 型底微量孔板及系列稀释液的制备
羊血琼脂	RTA, Tü土耳其	2001	微生物的分离与培养
金黄色葡萄球菌	美国典型培养物保藏中心	29213	本研究中使用的参考菌株
替考拉宁粉末	Sigma-Aldrich，德国达姆施塔特	T0578	抗生素
胰蛋白胨大豆肉汤	德国默克公司	1,054,590,500	微生物的分离与培养
U型底孔板	赛默飞世尔科技	163320	采用肉汤微量稀释法进行抗菌药物敏感性试验
VITEK 2 AST-P664 卡片	bioMé里厄，法国	414197	用于抗菌药物敏感性试验
VITEK2 Compact	bioMé里厄，法国	4700030	用于抗菌药物敏感性试验