多重免疫荧光技术可在单个组织切片中实现多种抗体标记物的序贯标记，从而支持对组织结构和细胞群体的空间分析。本文介绍了一种针对衰老相关、结构及免疫标记物的多重检测工作流程，包括手动和自动化载玻片制备、迭代成像，以及利用数字病理学软件进行单细胞分析。
本文内容
摘要
摘要
多重免疫荧光（IF）染色技术相较于传统的IF成像实现了显著的技术进步，能够在单个组织切片中连续检测多种抗体标记物。该技术有助于更全面地分析多种细胞类型和组织结构，并能够评估它们之间的空间关系，这是使用连续切片所无法实现的。目前尚无单一的、普适性的衰老标志物，且人们已普遍认识到，衰老特征会因细胞类型、衰老诱导因素以及诱导后的时间不同而有所差异。因此，多重免疫荧光所提供的组合分析方法成为一种强大工具，可在单个组织切片中实现无偏倚的衰老细胞检测。
此处采用包含34种人类组织类型芯样的组织微阵列。通过10重检测方法，联合使用结构、免疫和衰老生物标志物进行染色，并利用多重切片扫描仪获取图像。该方法可评估衰老细胞的丰度及其空间分布 在组织中. 通过连续的染色、成像和染料失活循环生成多重数据集，图像使用多重荧光切片扫描系统采集。文中描述了手动制片和使用切片染色机进行自动化处理的实验方案，以及利用数字病理学软件进行单细胞分割和空间分析的方法。 总体而言，这些方法为组织样本中衰老相关生物标志物的染色、成像及空间分析提供了全面的指导 以及多重成像的通用指南。
引言
衰老是一种复杂的终末细胞命运，已被证实参与多种生理和病理过程，包括衰老、癌症、免疫功能以及正常组织稳态。1然而，目前尚未发现普适性的衰老生物标志物，其鉴定依赖于对一系列所谓标志性特征的评估2组织的免疫荧光成像通常局限于单个切片中一至两种生物标志物的检测，导致在同一样本中对多种标志物组合的分析具有挑战性3这一问题因单细胞水平上衰老细胞异质性新特征的显现而加剧4，以及缺乏 体内 衰老特征2，使得在新情境下或使用珍贵样本时难以选择窄范围检测面板5,6.
多重免疫荧光成像旨在通过在单个组织切片中实现多种生物标志物的连续检测，从而克服这一局限性3。该技术可通过使用荧光标记的寡核苷酸报告探针，或使用带有标记的一抗、再通过染料失活过程淬灭其荧光信号来实现7。在这两种情况下，均采用连续成像方式构建出具有空间分辨能力的生物标志物图谱，相较于传统的连续组织染色免疫荧光方法具有优势7。通过对单个组织样本生成此类复杂的表达谱，可检测到更多类型的衰老表型、细胞类型及组织结构，从而能够深入评估它们之间的空间关系与分布特征。
然而，尽管多重免疫荧光成像的复杂性显著高于传统免疫荧光，但由于实际限制，标志物组合通常局限于<100个生物标志物3。这些限制包括每轮染色后可能出现的表位抗原性丧失、信号强度减弱或组织完整性受损，以及优化大量抗体组合的挑战——这些抗体组合必须完全避免交叉反应性8,9。因此，确定每轮抗体的最佳组合是多重抗体 panel 设计中的重要考虑因素。因此，总体“plex”水平低于空间转录组学等技术所达到的水平。然而，鉴于多重免疫荧光检测的是蛋白质水平而非转录本水平，这两种技术可视为互补，并可在大规模“多组学”分析流程中联合使用10。
本研究对包含34种组织类型核心的人体组织微阵列进行了成像。这些组织微阵列通过10重检测方法，联合染色了多种结构、免疫及衰老生物标志物：广谱细胞角蛋白（Pan-cytokeratin, PANCK）、CD31、α-平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin, aSMA）、角蛋白15（keratin 15, K15）、波形蛋白（vimentin）、FOXP3、CD8、Ki67、p16以及层粘连蛋白B1（Lamin B1）。文中提供了载玻片手动制备的详细分步操作流程，以及适配自动化染色仪进行自动化操作的改进方案。代表性实验对比结果显示，后者不仅提升了组织完整性，而且对大多数标志物而言，荧光信号也得到增强11。最后，本文还提供了利用HALO数字病理学软件对多重组织微阵列图像进行分析的分步指南，包括单细胞分割及生物标志物表达的空间分析。代表性结果证明了基于该生物标志物组合 panel 检测和定量衰老细胞在技术上的可行性（而非对衰老分类进行全面的生物学验证）。
总体而言，本方法旨在为衰老生物标志物的多重评估提供指导 体内 以及多重成像的通用指南（图1).
方案
伦理声明
本研究所涉及的组织样本来自英国巴茨健康国民保健服务（Barts Health NHS）档案库中超出诊断需求的剩余样本，样本的获取符合所有相关的机构和监管指南，并经伦理协议 10/H0704/65 和 05/QO605/140 批准。
1. 切片制备、抗原修复与封闭
注意：除非另有说明，所有步骤均在标准实验室条件下于室温（~20–25 °C）进行。
- 初始样本装载
- 为确保最佳的组织保留效果，将福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的组织样本装载到高质量的显微镜载玻片（带正电荷）上，建议使用新开封的载玻片以最大限度减少电荷损失。
- 确保切片厚度不超过 5 µm，最大尺寸为 4 x 2 cm2 ，并居中放置，以确保在无盖玻片载片架 的观察窗口内完全可见。
- 通过脱蜡室手动或通过自动染色机自动进行样本制备。
- 脱蜡室操作
- 将最多 24 张载玻片在 60 °C 下烘烤过夜，组织面朝上。
- 通过依次在二甲苯中孵育 5 分钟（重复两次），以及在浓度递减的乙醇（100%、100%、90%、70%）中完全浸没载玻片，进行脱蜡和再水化处理。
- 将载玻片浸入 PBS 中洗涤 5 分钟（重复两次）。
- 将载玻片完全浸入含 0.3% Triton X-100 的 PBS 溶液中，透化处理 10 分钟。
- 将载玻片浸入 PBS 中洗涤 5 分钟。
- 通过向各个独立区域加入以下试剂，准备脱蜡室：
- 500 mL ddH2O 加入主腔室。
- 250 mL ddH2O 加入金属架篮中央储液位。
- 250 mL pH 6 抗原修复液 1（ARS1）加入金属架篮左侧储液位。
- 250 mL pH 9 抗原修复液 1（ARS2）加入金属架篮右侧储液位（用 ddH2O 将 10 倍浓缩液稀释）。
- 将样本浸入 ARS1 溶液中，并在三个储液位上方覆盖蒸汽条。
- 盖上脱蜡室盖子并旋转锁定至关闭位置，确保压力释放阀平整地置于压力杆上。
- 选择并启动一个升温至预设温度 110 °C 并维持 4 分钟的程序。
- 在加热阶段，当温度指示面板显示 70 °C 时，启动 20 分钟计时器。在此期间，系统将达到设定温度、维持温度并开始减压。
- 使用镊子小心倾斜压力释放阀，完全释放系统压力后打开盖子。检查蒸汽条以确认已达到所需温度。
- 将样本从 ARS1 溶液转移至 ARS2 溶液。将腔室盖重新盖上（但不锁定或重新加压），并启动 20 分钟计时器。
- 将装有载玻片的储液篮移至实验台面。
- 将储液篮在室温下静置 10 分钟。
- 将样本浸入 PBS 中洗涤 5 分钟（重复四次）。
- 将样本浸入含 10% 驴血清和 0.3% BSA 的 PBS 中，封闭 1 小时。
- 将样本浸入 PBS 中洗涤 5 分钟。
- 将样本浸入含 DAPI（1 µg·mL-1）的 PBS 溶液中，复染 15 分钟。
- 将样本浸入 PBS 中洗涤 5 分钟。
- 将载玻片装入无盖玻片载片架中。
- 自动载玻片染色机（例如 Bond RXm）
- 将清洗液、ER1 和 ER2 大容量试剂放入下层抽屉中。
- 开启系统以初始化。
- 确保废液容器为空，且所有其他试剂液位高于最低要求。
- 根据系统提示的所需总体积，向试剂臂的容器位中加入以下试剂，完成试剂臂准备：
- 将装有 PBS 的空白试剂瓶插入试剂臂。
- 将装有含 0.3% Triton X-100 的 PBS 稀释液的试剂瓶插入试剂臂。
- 将装有封闭缓冲液（含 10% 驴血清和 0.3% BSA 的 PBS）的试剂瓶插入试剂臂。
- 将装有 DAPI（1 µg·mL-1）PBS 稀释液的试剂瓶插入试剂臂。
- 将整个试剂臂（含已准备的试剂瓶）插入系统中。
- 根据屏幕提示，构建一个包含以下步骤的自动化染色程序，并设置为过夜运行：
- 60 °C 烘烤 10 小时。
- 用含 0.3% Triton X-100 的 PBS 孵育（10 分钟）。
- 用大容量清洗试剂清洗（预设程序）。
- 用表位修复试剂 1（ER1）大容量试剂孵育（20 分钟，100 °C）。
- 用大容量清洗试剂清洗（预设程序）。
- 用表位修复试剂 2（ER2）大容量试剂孵育（20 分钟，100 °C）。
- 用大容量清洗试剂清洗三次（预设程序）。
- 用封闭缓冲液（含 10% 驴血清和 0.3% BSA 的 PBS）孵育（1 小时）。
- 用 DAPI（PBS 中 1 µg·mL-1）孵育四次，每次 5 分钟。
- 清洗（预设程序）。
- 确保所有加样体积设置为 150 µL，并在下拉菜单中将准备步骤设置为“脱蜡”。
- 输入最多 30 张载玻片的信息并打印条形码标签。
- 取出载玻片托盘，将载玻片正面朝上插入。在每张载玻片上方正面朝上放置覆盖片。将条形码标签贴在载玻片上，确保从上到下可读。
- 将载玻片托盘重新放入自动染色机中，并通过前部托盘按钮锁定。
- 按下当前已装载载玻片的每个试剂臂的启动按钮。
注意：完整程序运行时间约为 15 小时（包括 10 小时烘烤）。可延迟启动时间以节省再水化清洗步骤。 - 程序完成后，将载玻片装入无盖玻片载片架中。
- 装载无盖玻片载片架
- 将载玻片装入无盖玻片载片架中，确保顶部和右侧边缘与金属限位块对齐。
- 同时转动两侧塑料凸轮，将其旋转至闭合锁扣位置，以固定载玻片。
- 检查载玻片是否完全平整贴合，无晃动。
- 用双手捏住侧边条，轻压以控制压力，将无盖玻片载片架的插入室覆盖在载玻片上，防止破损。
- 通过进样口向无盖玻片载片架中加入 2 mL 封片介质，成分为含 50% 甘油的 PBS。
- 在载玻片左侧任意方向贴上条形码标签。
- 进入成像步骤。
2. 多重成像
- 区域选择与自发荧光成像
- 打开多重成像采集软件（例如 Mx workflow (4.2.0.4)），使用协议发布向导创建包含所需循环次数/生物标志物及曝光时间的实验方案。
注意：需预先确定每种抗体在可用通道中的分配。将弱信号标记物（即需要较长曝光时间的标记物）限制在自发荧光最少的 Cy5 和 Cy7 通道。在多重荧光成像系统中，每轮最多可使用 4 种抗体。 - 如需获取虚拟 H&E 图像，则必须采集 Cy3 通道。
- 通过批量创建工具，使用玻片条形码编号将其添加至实验方案中，以建立多重实验工作流程。
- 通过采集软件（4.2.0.4）将玻片载入显微镜，并按照工作流程，对每张玻片依次执行 2x 和 10x 成像步骤以绘制感兴趣区域。选择区域时，确保每个视野至少有两个相邻区域，以避免拼接问题。
- 尽量减少对空白玻片区域的成像，避免采集无组织区域，以防止拼接问题并缩短运行时间。
- 使用步骤 2.1.1 中设定的曝光时间进行 20x 自发荧光成像，并遵循质量控制（QC）向导。目视确认无失焦区域或伪影。若发现此类问题，则判定 QC 失败，并重新成像。
注意：可接受的 QC 严格程度并无统一标准，其成功与否取决于实验所需的读出结果以及样本的珍贵程度。理想情况下，对焦清晰且染色强度足够的组织在视觉上应呈现清晰锐利的图像。常可观察到小范围的组织脱落或降解，此类情况无法通过重复成像改善，只要样本其余部分成像良好即可接受。若观察到大面积明亮伪影（例如灰尘），最佳做法是清洁玻片后重新成像。 - 生成将在后续处理中从最终生物标志物信号中减去的背景图像，该过程将在每一轮多重成像中重复执行。
注意：所有多重成像轮次将通过采集软件自动对齐。
- 打开多重成像采集软件（例如 Mx workflow (4.2.0.4)），使用协议发布向导创建包含所需循环次数/生物标志物及曝光时间的实验方案。
- 机器人板架处理器的使用
- 确保采集软件已关闭。
- 打开机器人集成软件并点击“开始”。
- 将堆叠的无盖玻片支架放入输入堆栈中。
- 确保输出堆栈为空。
- 打开机器人板架控制软件（例如 Harmony 机器人软件 (3.2.0)），并按照向导操作，确保选择正确的板类型和数量。
- 点击“开始”，板架处理器将自动将玻片载入显微镜，显微镜将根据玻片条形码自动识别当前工作流程阶段。
注意：若在下方生物标志物成像步骤中使用机器人加载器，则必须在软件中取消勾选“动态设置曝光时间”选项，并使用预设的曝光时间。
- 连续生物标志物染色、染料失活与多重成像
- 将抗体在室温下以 13,000 × g 离心 1 分钟，以减少伪影产生。
- 在含 0.3% BSA 的 PBS 中配制抗体溶液。
注意：最终抗体浓度因抗体而异，但 1:200 稀释度是新抗体优化的良好起始点。 - 通过无盖玻片支架的端口吸出封片介质，并加入含 0.01% Tween 的 2 mL PBS 洗涤 5 分钟（重复此步骤三次）。
- 吸除 PBS，通过端口加入 350 µL 用 PBS 稀释的抗体溶液进行染色。该体积已优化，可确保染色腔室内样本完全覆盖。
- 在室温下于实验台孵育 1 小时。
- 通过无盖玻片支架端口吸出抗体溶液，并加入含 0.01% Tween 的 2 mL PBS 洗涤 5 分钟（重复此步骤三次）。
- 吸除 PBS，加入 2 mL 封片介质。
- 将无盖玻片支架插入显微镜，启动自动的特定轮次成像步骤。
- 成像完成后，按照屏幕提示通过 QC 步骤以推进工作流程。
- 通过无盖玻片支架端口吸出封片介质，并加入含 0.01% Tween 的 2 mL PBS 洗涤 5 分钟（重复此步骤三次）。
- 现配染料失活溶液：7 mL ddH2O、2 mL 0.5 M NaHCO3 和 1 mL 30% H2O2。该溶液需在使用前立即配制，并尽快应用于玻片。
注意：过氧化氢应使用适当的实验室个人防护装备（PPE）进行操作。 - 在 H2O2 加入工作液后，立即吸除 PBS 并为每张玻片加入 2 mL 染料失活溶液。
- 在室温下于玻片支架中孵育 15 分钟。
- 通过无盖玻片支架端口吸出染料失活溶液，并用含 0.01% Tween 的 2 mL PBS 洗涤 5 分钟。
- 吸除 PBS，加入 2 mL 封片介质。
- 将无盖玻片支架插入显微镜，启动自动的特定轮次 20x 自发荧光成像。
- 成像完成后，按照屏幕提示通过 QC 步骤以推进工作流程。
- 根据需要重复步骤 2.3.1 至 2.3.17，进行多轮标记检测。（制造商已验证该流程最多可进行 10 轮，但实际轮数主要取决于组织完整性）。
3. 通过数字病理学软件进行自动高通量分析
- 加载数据并分割组织芯片（TMA）
- 将多重免疫荧光（IF）图像拖放到数字病理学软件的“studies”选项卡中。
- 虚拟H&E图像必须单独导入。
- 对于组织微阵列（TMA）样本，请使用“TMA module”。该模块支持逐个核心进行标注，使数据追踪比处理整张切片更加简便。
- 要创建TMA块，首先导航至“块操作”并创建新的TMA图谱。
- 可通过手动输入或使用导入向导导入Excel表格完成此操作。
- 在“studies”选项卡中右键单击样本，选择“Segment TMA”以分割TMA。
- 选择核心的尺寸，并通过移动红色框将其与图谱对齐。完成后点击保存。
- 现在可以按核心为单位进行分析和数据导出。
注意：以下流程也可在不使用TMA模块的情况下应用于完整的组织切片。
- 将多重免疫荧光（IF）图像拖放到数字病理学软件的“studies”选项卡中。
- 单靶点分割
- 导航至分析选项卡。
- 在“settings actions”下拉菜单中点击“加载”，并选择HighPlex荧光分析模块。
- 本结果使用的是v5.2.2版本。
- 在染料选择中，手动填写或通过“autofill dyes”功能填写待评估的标记物。
- 在核检测中，选择适合当前HALO版本的分割类型（此处描述的是传统非AI版本）。
- 设置核对比度阈值以识别细胞核（通常范围为0.4–0.6）。
- 设置最低核强度以识别细胞核（通常不低于0.05）。
- 根据DAPI信号强度将最大图像亮度降低至约0.4（由于16位图像的动态范围，从1降低）。
- 根据组织类型进一步调整其他参数，如分割激进程度、填充孔洞和大小过滤器。
- 对膜和胞质检测重复此过程。
- 传统胞质检测中，通常以2至5的 collar 半径作为良好起点。
- 生物标志物阳性阈值选择
- 在染料选择阶段选定的每个生物标志物都将测量其原始强度值。
- 根据染色模式，在核、胞质或膜区室中使用滑块为每个标记物设置二分类（阳性 vs 阴性）或多分类（高、中、低、阴性）阈值。
- 设置二分类阈值时，仅调整下部滑块以确定截断值。
- 通过“Analyze”菜单中的实时调优窗口，并切换分析掩码的显示/隐藏状态，与原始染色水平进行比较，以评估性能。
- 使用“phenotypes”功能创建标记物组合。
- 逻辑门控支持所有标记物的AND/OR正/负组合，可在所有染色间构建无限矩阵。
- 若需要单靶点数据（空间分析所必需），请将“store object data”设置为true。
- 保存协议，并在“studies”选项卡中选中所有待分析切片，右键并选择使用目标协议进行分析。
4. 结果审阅
- 数字病理学软件中的空间评估
- 在数字病理学软件的“结果标签页”中查看所有结果。
- 顶部的汇总表将显示当前图像中所有特征的平均值。
- 若单独打开，则为单个组织芯的结果。
- 下方的表格将显示每个特征的单个目标数据。
- 通过在表格中选择或直接点击图像中的区域，可对单个数据点进行查询。
- 在相应列中筛选表型、标志物阳性率或强度阈值。随后可通过导航至：“对象操作” > “绘图” > “空间图”进行绘图。
- 完成多个不同组别的设置后，即可进行空间分析。
- 点击“空间分析”按钮，并按需选择相应选项：
- 最近邻分析：计算一种特定细胞类型与另一种细胞类型最近观测点之间的距离。
- 邻近性分析：围绕选定的细胞类型测量同心环带，量化其他任何细胞类型的数量及其距离。
- 浸润性分析：测量特定注释层（通过注释工具在图像上标记的区域）内某一特定细胞类型的分布距离。
- 密度热图：生成可视化图像，显示某种细胞类型在整个组织区域内的分布密度。
- 可通过“切片操作”下的“点结果”按钮以及“结果操作”下拉菜单，对所有组织微阵列（TMA）芯进行空间分析。
- 从数字病理学软件导出结果
- 可通过导航至“切片操作” > “导出”，从TMA标签页导出结果。
- 可通过高级标签页导出仅汇总数据或完整的单目标分析数据。
- 生成 .csv 格式的数据文件，随后可在 R 等分析软件中进行处理，以实现跨所有细胞的生物标志物强度的群体水平分析。单个对象特征包括：样本ID、唯一对象ID（每个细胞）、每个标志物的原始强度值、表型分类以及空间坐标。
结果
针对两个采用不同制备方法的载玻片，共生成了覆盖34种人类组织类型的136个组织微阵列核心的10重免疫荧光（IF）图像及配对的虚拟苏木精-伊红（H&E）图像（图2）。这些代表性图像展示了在保持组织形态完整的同时，成功实现了多重染色，并在多个组织微阵列核心中清晰检测到多种生物标志物。其中一个载玻片使用全自动染色仪制备，另一个则采用手动方法进行制备。在基于手动脱蜡室的方法中，组织伪影的发生率更高，包括组织脱落以及核心丢失或移位（图3）。这些伪影会减少每个样本或核心中可用于分析的组织区域，从而影响后续的多重图像分析。上述观察结果证实，该方案能够在多种不同组织类型中实现稳定可靠的多重染色与成像。
成功的多重成像表现为组织形态保存完好、各轮染色之间对齐一致，以及清晰且特异的生物标志物信号检测。相反，成像效果不佳的特征包括组织脱落、信号丢失或成像伪影，这些因素会减少可分析区域并影响后续分析的可靠性。
接下来，比较了包括PANCK（上皮组织）、CD31（内皮组织）、aSMA（间质组织）、角蛋白15（K15；基底上皮细胞）、波形蛋白（间充质细胞）、Ki67（增殖标志物）、CD8（细胞毒性T细胞）和FOXP3（调节性T细胞，TREGs）在内的多种标志物在两种切片制备技术中的染色特征，结果显示手动方法在信号强度上存在轻微的定性（视觉）降低（图4A）。通过在数字病理学软件中应用生物标志物分类阈值，将数据集中约63万个细胞中的每一个样本划分为阳性和阴性群体（图4B）。利用数字病理分析流程获得的强度测量值，对标志物信号进行定量评估。在使用全自动切片染色仪相较于手动方法时，阳性细胞群中8种生物标志物中的5种在群体密度估计（曲线下面积代表100%的细胞群体）和中位强度值上均显示出适度升高（图4C）。
为完善检测面板，将上述标记物与Lamin B1（核膜）和p16（周期蛋白依赖性激酶抑制剂）的其他生物标志物联合使用，从而可在单个样本中可视化全部10种标记物的相对组织丰度与分布情况（图5）。能够同时分析大量生物标志物在衰老研究领域具有特殊价值，因为该领域依赖多种正交标志物的综合评估，以确保准确的分类2。在此，我们分析了p16高表达和低表达细胞群体中Lamin B1信号强度的变化。重要的是，由于这是多重样本，通过与同一组织中其他细胞类型的分布进行比较，可将这些细胞置于空间背景下进行分析（图6A）。利用数字病理学软件的分类阈值功能，对染色结果进行定量分析，显示p16阳性细胞的Lamin B1水平低于其阴性对应细胞（图6B），该特征与先前报道的衰老相关标志物模式一致12。我们还观察到Lamin B1阴性细胞具有更高的p16水平（图6C）。通过数字病理学软件中的表型分析功能（该功能基于单细胞分割及多种标志物的阈值设定对细胞进行分类），结合上述标志物，将同时呈p16阳性且Lamin B1阴性的细胞定义为衰老细胞。随后，定量分析了不同组织类型中所有组织芯内此类细胞所占比例，并对全部10种标记物分别进行单独定量（图6D）。该分析结果支持在多重数据集中对不同组织类型间基于生物标志物定义的细胞群体进行定量比较。尽管分析流程在单细胞水平进行，但当前数据集主要以群体水平的分布形式呈现。由于该数据集中p16阳性细胞的相对丰度较低，可能限制p16与Lamin B1之间逐细胞相关性分析的统计效能，因此对此类关系的解读应谨慎。
图1：多重免疫荧光完整工作流程示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：多重成像概览：（A-B）：基于第1轮DAPI染色和Cy3自发荧光生成的虚拟H&E图像，用于观察使用自动切片染色仪或手动切片制备方法处理的切片组织完整性。（C-D）：所有生物标志物的多重免疫荧光染色。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：伪影类型的示例：主要在切片制备过程中产生的不同类型伪影的代表性实例。部分组织脱落表现为失焦区域，可能导致后续轮次中组织对齐出现问题。核心缺失会降低实验效能，且常在较脆弱的组织类型中不成比例地发生。滑脱或重叠的核心是指核心从组织微阵列（TMA）上的原始位置脱落，但附着于其他区域，导致被遮盖的核心难以分析，从而加剧样本损失。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：BOND 全自动染色机与手工制片方法的荧光信号比较：（A）：结构标志物泛细胞角蛋白（PANCK）、CD31 和 α-平滑肌肌动蛋白（aSMA）的代表性免疫荧光染色结果。三幅图像的合并图像显示于第一列。（B）：数字病理学软件二分类分析掩膜，显示不同细胞类型中标志物阳性检测结果：CD31（红色）、FOXP3（青绿色）、Ki67（黄色）、CD8（白色）、PANCK（绿色）。白色方框表示下方图中数字放大的区域。（C）：按组织制备方法（全自动染色机 = 红色，手工 = 蓝色）和标志物表达状态（深色 = 阴性，浅色 = 阳性）分组的细胞群体中生物标志物强度的定量分析。每个密度图下方的面积代表所分析细胞群体的 100%。AF = 自发荧光。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：完整的多重检测面板：来自阑尾组织的代表性图像，显示 A-B：完整的10重免疫荧光检测面板；C：PANCK（绿色）；D：CD31（红色）；E：aSMA（黄色）；F：K15（粉红色）；G：波形蛋白（Vimentin，白色）；H：核纤层蛋白B1（Lamin B1，青绿色）；I：p16（金色）；J：Ki67（亮黄色）；K：CD8（亮绿色）；以及 L：FOXP3（紫色）。白色方框 = 数字放大（Merge、CD31、aSMA、K15、Vim、LB1、p16）；虚线方框 = 数字放大（Ki67、CD8、FOXP3）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 6：衰老标志物检测：（A）胰腺组织图像的代表性免疫荧光（IF）结果，显示Lamin B1（青绿色）和p16（金色）的染色模式差异，以及与其他标志物PANCK（绿色）、CD31（红色）和Vimentin（白色）的空间关系。（B）在p16阳性与阴性细胞群体中Lamin B1（LB1）核强度的定量分析。（C）在Lamin B1（LB1）阳性与阴性细胞群体中p16细胞强度的定量分析。密度图曲线下面积代表100%的细胞群体。（D）不同组织类型中各生物标志物或衰老表型（p16+/LB1-）核心区域平均阳性百分比的Z分数标准化热图。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
通过自动化平台进行多重免疫荧光成像，有助于在单个组织切片中生成大量生物标志物的精细表达谱13结合数字病理学软件（如 HALO）使用时，可分析不同细胞类型的丰度及其空间分布关系，以及它们在不同组织结构中的分布情况3这有望为衰老研究领域带来重要价值，该领域依赖于多种标志物组合的分析，以实现对衰老细胞的可靠分类。而衰老细胞本身具有显著的异质性，因此需要对单个靶细胞进行分析，这是连续组织切片无法实现的14此外，衰老细胞在不同组织中的负荷存在差异，在衰老过程中可能以不同的速率累积，且目前可靠地评估衰老细胞负担的方法十分有限 体内 衰老标志物，因此在需要更高灵活性的新情境中，能够使用更广泛的生物标志物组合将更具优势5,15,16重要的是，先前的研究表明，衰老细胞的积累及其时间动态具有高度的组织依赖性，在不同器官系统中，其丰度和出现时间存在显著差异，这表明衰老过程在不同组织间并非同步发生。其他空间分析技术，如空间转录组学或成像质谱流式细胞术，可提供互补的分子信息；然而，多重免疫荧光技术可直接检测蛋白质表达，并实现对完整组织切片中细胞表型的高分辨率空间分析。多重免疫荧光的顺序性操作特点也使其适用于迭代式的发现研究流程。
通过与自动切片染色机整合，可在高通量工作流程中进行多重免疫荧光成像。除了在标准化方面具有显著优势外，自动切片制备似乎也比手动依赖脱蜡室的方法产生更少的伪影，因为观察到的组织脱落和组织芯丢失现象更少。然而，这些观察结果基于定性比较，要正式确立不同处理方式在组织损伤方面的差异，还需进一步的定量评估。这一点在皮肤和乳腺等富含脂肪的组织类型中尤为值得关注。此外，无盖玻片载片夹系统可与机器人板式处理器整合，从而实现更高通量，并通过支持包括过夜成像运行在内的工作流程优化，减少操作人员的时间投入。尽管预期自动化将提升通量和标准化水平，但本研究并未对这些改进进行正式的定量基准测试，因此应将其视为实际观察结果，而非经测量验证的结论。当样本以组织微阵列形式制备时，便有可能在相对较少的载玻片上对数百例患者样本进行此类全面分析，这可能有助于未来针对临床组织样本中衰老细胞的研究5，11。
尽管使用自动切片染色机相较于手动切片制备过程在标记强度上略有提升，但这一优势在实际应用中较为微弱，因为弱信号通常可通过延长曝光时间或调整分析阈值来克服。多个关键步骤对实验成功至关重要，包括抗体优化、多重检测面板设计以及成像参数的选择。必须仔细验证抗体的兼容性、信号强度以及对多次染色循环的耐受性，以确保获得可重复且高质量的多重检测数据。更为重要的是生物标志物的轮次优化与通道选择。这些参数需在测试样本中单独及组合评估，以确认抗体之间无交叉反应，并验证在目标轮次中能够实现荧光染料失活和表位检测。建议将信号较弱或丰度较低的标志物使用在通常自发荧光背景较低的Cy5和Cy7通道。最终的检测面板应在目标组织类型中进行测试，因为某些常用的优化组织（如扁桃体）通常所需的抗体浓度和曝光时间低于实验条件，且其特性（如自发荧光）也可能存在差异。然而，当实验组织中细胞类型的存疑时，此类阳性对照组织仍具有参考价值，因为在实验组织中信号缺失难以与靶细胞缺失相区分。在目标组织类型中严谨进行面板优化是确保实验成功最关键的一步，可最大限度减少最终实验运行中生物标志物的丢失。大多数问题源于抗体间的交叉反应、抗体浓度过低导致的信号不足，或FITC/Cy3通道中信噪比过低。此外，抗原在反复的染料失活步骤中的保存效果具有抗体和组织依赖性，因此更需要通过全面的优化步骤来确保为实验样本选择合适的面板/轮次组合。多重免疫荧光工作流程的一个关键局限在于其高度依赖高质量的抗体，以及表位在多次染色和染料失活循环中的稳定性。
总体而言，多重成像与自动化平台的结合，代表了免疫荧光评估技术在复杂性方面的重大进步 体内 组织样本，从而在单细胞水平上对复杂的生物标志物组合进行全面的空间分析。该工作流程的未来应用包括在多种组织类型中大规模分析衰老相关生物标志物，并与新兴的空间组学方法相结合，以进一步解析复杂组织微环境中细胞的异质性。
披露
CLB 曾担任 Senisca、StarkAge 和 AKLRD 的顾问。CLB 的实验室获得了 ValiRx 的资助。
作者贡献：
RW LG 和 CLB 提出了初步构想。RW、FM、MGC、LG 和 CLB 完善了该构想，并共同设计和制定了实验方案。RW、FM、MGC 和 LG 完成了所有实验。RW 和 CLB 撰写了初稿，所有作者均参与了投稿前的稿件修改。所有作者均已阅读并批准最终稿件。
致谢
CLB 承认 BBSRC 为 FM 和 MGC 提供的资金支持（编号分别为 BB/T008709/1 和 BB/W510427/1），以及 Wellcome Trust 为购买 Cell DIVE 提供的资金支持（编号 223803/Z/21/Z）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 30% 过氧化氢 (H2O2) | Merck | H1009 | |
| 抗原修复液 1 (H3300) (ARS1) | Vector Labs. | H-3300 | 配制方法：12.5 ml 抗原修复液 + 237.5 ml 双蒸水 |
| 抗原修复液 2 (ARS2) | Sigma | T6066 / E5134 | 配制 10 倍储存液（12.9 g Trizma 碱，3.7 g EDTA，5 mL Tween 20，995 mL 双蒸水）。 |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Merck | A2153 | |
| 大量脱蜡液 | Leica | AR9222 | |
| 大量表位修复液 1 (ER1) | Leica | AR9961 | |
| 大量 表位修复液 (ER2) | Leica | AR9640 | |
| 大量洗涤液 | Leica | AR9590 | |
| DAPI | Merck | D3571 | |
| 双蒸水 (ddH20) | N/A | N/A | |
| DMSO | Merck | 472301 | |
| 驴血清 | Merck | D9663 | |
| EDTA | Merck | E5134 | |
| 甘油 | Merck | G5516 | |
| NaHCO3 | Merck | S5761 | |
| 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) | Merck | BP399 | |
| 没食子酸丙酯 | Merck | P3130 | |
| 碳酸氢钠 | Merck | S5761 | |
| 吐温 X 100 | Merck | H5141 | |
| Trizma 碱 | Merck | T6066 | |
| 吐温20 | Merck | P1379 | |
| 其他耗材或设备 | |||
| 脱封室 | BioCare | DC2012 | |
| 蒸汽条 | BioCare | 613QC | |
| Bond RXm 自动载玻片染色机 | Leica | HIS2330 | 文中称为自动载玻片染色机 |
| Cell DIVE | Leica | 29429159 | 文中称为多重荧光成像系统 |
| Click Well 载玻片支架 | Leica | 29463259 | 文中称为无盖玻片井式载玻片支架 |
| 抗体列表 | |||
| CD31 (Pecam-1) | Cell Signalling | 61255 | 克隆号：89C2 荧光染料：AF555 稀释比例：1:50 |
| CD8a | BioLegend | 372906 | 克隆号：C8/144B 荧光染料：Alexa 647 稀释比例：1:100 |
| CDKN2A/p16 | Santa Cruz | sc-56330 AF647 | 克隆号：jc8 荧光染料：Alexa 647 稀释比例：1:200 |
| FOXP3 | BioLegend | 320114 | 克隆号：206D 荧光染料：Alexa 647 稀释比例：1:50 |
| 角蛋白 15 | Abcam | ab194065 | 克隆号：EPR1614Y 荧光染料：AF_488 稀释比例：1:200 |
| Ki67 | Abcam | ab215226 | 克隆号：EPR3610 荧光染料：AF555 稀释比例：1:50 |
| 层粘连蛋白 B1 | Abcam | ab194106 | 克隆号：EPR8985(B) 荧光染料：AF_488 稀释比例：1:100 |
| 泛细胞角蛋白_AE1/AE3 | Thermofisher | 53-9003-82 | 克隆号：AE1/AE3 荧光染料：AF_488 稀释比例：1:100 |
| 平滑肌肌动蛋白 (SMA) | R&D systems | IC1420S | 克隆号：1A4 荧光染料：Alexa 750 稀释比例：1:100 |
| 波形蛋白 | Cell Signalling | 69227 | 克隆号：D21H3 荧光染料：Alexa 750 稀释比例：1:100 |
参考文献
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