可摘局部义齿佩戴者中红系复合体细菌DNA的实时PCR定量与牙周状况

摘要

采用实时聚合酶链式反应（PCR）对可摘局部义齿（RPD）佩戴者中红系复合体细菌DNA进行定量。该研究为这些患者的未来种植义齿治疗策略提供了新思路，考虑到这些细菌在种植体周围炎发生发展中的作用。

摘要

可摘局部义齿（RPDs）在口腔内的佩戴会随着时间推移引起口腔微生物群的变化。然而，目前关于此类患者中红系复合体细菌（RCB）存在情况的研究十分有限。鉴于RCB在牙周炎、种植体周围炎及多种全身性疾病发生中已确立的作用，探讨RPDs对这些细菌的影响至关重要。本研究旨在定量分析牙周袋内RCB的定植负荷牙龈卟啉单胞菌、福赛坦纳菌和齿垢密螺旋体- 采用实时聚合酶链式反应（RT-PCR）检测部分缺牙患者经可摘局部义齿（RPD）修复后基牙中的微生物负荷。次要目标是评估基牙与非基牙的牙周状况，并分析微生物负荷与临床牙周指数之间的相关性。

纳入30名需要佩戴可摘局部义齿（RPD）的参与者。从基牙在佩戴前（T0）和佩戴后3个月（T3）采集的细菌样本中提取脱氧核糖核酸（DNA）。通过实时聚合酶链式反应（RT-PCR）对根管内生物膜（RCB）进行定量，结果以"Lg（基因组当量/样本）"表示。在两个时间点记录基牙和非基牙的临床参数——菌斑指数（PI）、牙龈指数（GI）、探诊深度（PD）和牙齿松动度（TM）。

从T0到T3，所有三种目标菌在基牙上的RCB载量均呈现统计学显著升高：P. gingivalis（1.99 ± 2.01 vs 3.64 ± 2.21，p = 0.00003）、T. forsythia（2.20 ± 2.17 vs 3.56 ± 2.33，p = 0.00009）和 T. denticola （0.82 ± 1.41 vs 2.35 ± 2.21，p = 0.0001）。尽管治疗后基牙的牙周参数高于非基牙，但差异未达到统计学显著性。在各病原菌中，T. forsythia 与牙周指数的相关性最强，呈正相关。

短期使用可摘局部义齿（RPDs）与基牙上牙龈卟啉单胞菌（RCB）定植显著增加相关，提示早期微生物及炎症改变可能先于临床可察觉的牙周组织破坏发生。

引言

口腔内寄居着一个动态的微生物组，其生态平衡对维持牙周健康至关重要¹。由于内源性和外源性因素的影响，这种微生物稳态可能遭到破坏，从而为致病菌（包括牙周致病菌如Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia和Treponema denticola）的生长创造有利条件，这些细菌统称为“红色复合体细菌”（red complex bacteria, RCB）²。这些病原体在牙周炎和种植体周围炎的发病机制中起关键作用，它们协同作用以逃避免疫防御、促进炎症反应，并加速牙周组织的破坏，常导致牙齿脱落^3,4。牙齿缺失会严重影响个体的咀嚼和言语功能，并降低自信心与整体幸福感，因而增加了对义齿修复的需求。在各类常用修复方法中，尤其是考虑到老年人群的各种局部和全身状况，常采用可摘局部义齿（removable partial dentures, RPDs）进行修复治疗。然而，随着时间推移，RPDs⁵可能引发多种问题。

大量证据表明，使用可摘局部义齿（RPDs）可能导致牙菌斑积聚，并引发牙龈及牙周组织的炎症，尤其是基牙部位^6,7,8,9,10。然而，此类口腔疾病的发生也取决于患者对口腔卫生的重视程度以及义齿的护理与维护情况^11,12,13,14。Bassi 等人在其研究中强调了控制牙菌斑的重要性。他们对佩戴 RPDs 长达 6 至 12 年的患者进行了检查，发现对于坚持良好口腔卫生的患者，其基牙的牙周状况与非基牙相似；相反，在不重视复诊及口腔卫生维护的患者群体中，牙周状况则明显恶化¹³。

尽管可摘局部义齿（RPDs）具有功能上的优势，但其在口腔中的佩戴会阻碍唾液的自由流动，从而促使义齿表面形成一层获得性膜，可能导致细菌定植。已在可摘局部义齿（PRPD）患者中鉴定出多种有害细菌¹⁵。近期研究表明，与龋齿相关的致病菌（如Streptococcus mutans¹⁶）以及Staphylococcus aureus¹⁷的水平在义齿佩戴后可能显著升高。除了作为口腔黏膜状态的指标外，使用可摘局部义齿（RPDs）引起的细菌水平变化还可能导致余留牙齿发生牙体牙髓疾病¹⁸。因此，如果患者未能正确维护其可摘局部义齿（RPDs），义齿基托下方可能形成厌氧环境，从而导致致病菌过度增殖。某些类型的牙周致病菌可通过口咽部途径进入全身血液循环，成为多种全身性疾病发展的重要危险因素^19,20。

然而，关于可摘局部义齿（RPDs）患者基牙龈沟内微生物变化的研究仍然较少^21,22,23,24。在为数不多的相关研究中，通常采用传统方法检测牙周致病菌，包括BANA-ZymeTM试验和培养法。考虑到大多数牙周致病菌为兼性厌氧菌，使用这些方法可能在培养上存在困难，因为此类细菌的培养需要高强度还原环境且对氧气具有毒性²⁵。此外，现有的牙科文献尚未充分阐明在这一背景下，这些致病菌与不同牙周指数之间的关系。

因此，为了克服传统微生物培养的局限性并提高诊断准确性，本研究采用实时聚合酶链式反应（RT-PCR）对可摘局部义齿佩戴者基牙中的红色复合体细菌（RCB）负荷量进行定量。同时，使用标准化的临床指数评估基牙与非基牙的牙周状况。研究进一步探讨了细菌负荷量与牙周参数之间的相关性，以更深入阐明义齿使用与微生物失调之间的生物学相互作用。

方案

本研究纳入了2021年9月至2022年3月期间在科索沃大学牙科临床中心牙体修复科寻求修复治疗的30名部分缺牙患者。研究获得机构审查委员会的伦理批准（批准号：378/19），所有操作均遵循《赫尔辛基宣言》原则。所有参与者均签署了书面知情同意书。

样本量基于既往研究确定，已有研究表明，在可摘局部义齿佩戴者中，11至30名参与者足以在微生物和牙周参数方面获得显著结果^21,23。假设采用双尾配对t检验，显著性水平α为0.05，功效分析显示，纳入28名参与者可达到80%的检验效能，以检测出该程度的统计学显著差异。为弥补可能的失访情况，本研究共纳入30名参与者。此外，三个月的随访周期足以观察到这些患者菌负荷的增加²⁴。

纳入的患者为首次使用义齿修复体的个体，且具有相邻及对颌的天然牙列。排除标准包括：探诊深度>4 mm、免疫功能低下（如接受化疗）、过去90天内使用过抗生素、重度吸烟（>25支/天）以及存在认知障碍而无法理解可摘局部义齿（RPD）操作流程的患者。

所有参与者均接受了带有钴铬金属支架和丙烯酸树脂（聚甲基丙烯酸甲酯）的卡环固位可摘局部义齿（RPD）。每件RPD的设计均根据缺牙分类、剩余牙槽嵴质量及生物力学因素进行个性化定制。

样本采集流程

样本采集仅在可摘局部义齿（RPDs）的基牙上于 T0 至 T3 时间点之间进行。首先要求参与者用清水彻底漱口，以清除残留的食物残渣。在采集样本前，使用棉卷隔离选定的基牙，以保持干燥的操作环境。将两根无菌纸尖（35 号；04 锥度）分别插入牙齿颊侧表面近中和远中的龈沟内，并停留 1 分钟。随后将纸尖转移至含有 1.5 mL 生理盐水的无菌微量离心管中，并运送至指定的微生物学实验室。样本在 DNA 提取前储存在 -20°C 环境中。

细菌DNA的制备与扩增：

牙周筛查试验（材料表）被用于鉴定 齿垢密螺旋体、福赛坦纳菌和牙龈卟啉单胞菌 使用实时聚合酶链反应（RT-PCR）²⁶该检测包括：DNA制备；使用特异性试剂进行实时PCR扩增（用于通用细菌扩增的混合液、用于机会性细菌扩增的混合液以及用于人基因组DNA扩增的混合液）；以及扩增结果的记录与解读。

使用DNA提取试剂盒（材料表），按照制造商的说明进行DNA提取，以确保获得高质量的DNA。该检测采用带有石蜡密封的PCR混合液进行实时PCR定性分析。该混合液包含内部对照，用于验证PCR扩增过程的有效性，以及样本摄入对照（SIC），用于评估提取质量并确认有足够的DNA以实现准确扩增。

使用专用的PCR条带和封盖进行PCR扩增，试剂包括Taq聚合酶溶液、石蜡层下的预混液（master mix）、DNA样本和矿物油。PCR程序如下：（i）初始变性80 °C、30秒；（ii）变性94 °C、1分30秒；（iii）5个循环：94 °C变性30秒，64 °C退火与延伸15秒（引物结合与延伸，荧光检测）；（iv）45个循环：94 °C变性10秒，64 °C退火与延伸15秒（引物结合与延伸，荧光检测）；（v）最终变性94 °C、5秒。

荧光检测在 Fam 和 Hex 检测通道上进行，但试管除外 №5，其中含有标记物（在Fam和Rox通道上检测到荧光）。扩增过程使用实时荧光定量PCR仪（real-time thermal cyclers）进行材料表使用仪器配套的RealTime软件（版本7.9）对PCR扩增数据进行自动记录、解读和定量分析，从而实现对病原体载量的精确估算。

微生物负荷以"Lg (基因组当量/样本)"表示。根据细菌负荷水平，每位患者的Parodontoscreen检测报告中将结果分为以下三个范围：P. gingivalis（正常 <5.0；中度 ≥5.0；重度 >6.0）；T. forsythia（正常 <5.0；中度 ≥5.0；重度 >5.5）；以及 T. denticola（正常 <3.5；中度 ≥3.5；重度 >5.0）。

临床检查

临床检查包括在T0和T3时间点对基牙及非基牙的牙周状况进行详细检查。菌斑指数（PI）根据Silness-Loe标准（0-3）使用牙科探针进行评估²⁷。牙龈状况在牙齿表面的六个位点通过牙龈指数（GI）进行评估，评估标准如下：0，无炎症；1，轻度炎症；2，探诊时牙龈出血伴炎症；3，重度炎症，可能伴有自发性牙龈出血²⁸。

使用威廉姆斯探针测量探诊深度（PD），从牙龈缘至临床牙周袋深度的终点²⁹。根据Miller标准³⁰，通过双手触诊法在水平和垂直方向上确定牙齿松动度（TM）。

所有研究参与者在临床检查前均接受了充分的非手术牙周治疗，包括使用超声波洁治去除牙菌斑和牙石。研究人员还指导受试者进行口腔卫生操作，例如刷牙和清洁义齿，并建议其在夜间取下义齿。

统计学分析

数据采用 Microsoft Excel 和 IBM SPSS Statistics for Windows 进行分析。对年龄、微生物负荷以及包括菌斑指数（PI）、牙龈指数（GI）、探诊深度（PD）和牙齿松动度（TM）在内的牙周指数，计算其描述性统计量（均值、标准差和范围）。使用 Wilcoxon 符号秩检验对插入前（T0）与插入后 3 个月（T3）的临床和微生物学参数变化进行评估，以分析配对的非参数数据。采用 Fisher 精确检验（Monte Carlo 模拟，双侧）评估与微生物负荷分类相关的分类数据。使用 Spearman 等级相关系数（ρ）分析微生物负荷与牙周参数之间的关联。所有分析中，p 值 < 0.05 被认为具有统计学显著性。

结果

参与者人口统计学信息

表1展示了人口学参数的分布情况。在30名参与者中，男性16名（53.3%），女性14名（46.7%）。参与者的平均年龄为64.6岁，年龄范围为48至76岁。有关社会人口学特征的更多详细信息见表1。

临床检查

表2展示了牙周指数的检测结果。在基牙中，除TM外，几乎所有指数在可摘局部义齿佩戴3个月后均显著升高。另一方面，非基牙的PI和GI值显著升高，而TM和PD则未观察到显著差异。

基牙与非基牙之间牙周指数的差异

在可摘局部义齿（PRPD）修复前及修复后3个月，基牙与非基牙的牙周指数值差异见表3。在使用可摘局部...

讨论

随着年龄增长，由于免疫反应能力下降以及卡环式可摘局部义齿（RPD）等修复体装置带来的机械性限制，维持最佳口腔卫生变得愈发困难。这些条件有利于致病性生物膜的积聚，尤其是在基牙周围，而基牙作为关键的承力结构，也容易发生牙周组织的退变。本研究旨在通过量化老年患者在佩戴RPD后3个月内红群复合体细菌（RCB）的负荷，并评估相关的牙周变化，以应对上述问题。尽管既往研究已采用菌斑指数（PI）、牙龈指数（GI）和探诊深度（PD）等指标评估RPD对牙周健康的影响，但很少有研究同时利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）所具备的高灵敏度与特异性来分析微生物群落特征。这种双管齐下的方法有助于识别可能使患者易患长期基牙周围炎症及义齿相关并发症的亚临床微生物变化。然而，微生物数量的增加可能是未来组织退变的潜在早期生物标志物，因为这些变化属于在临床疾病出现之前发生的亚临床改变。

根据我们的研究结果，总体而言，使用可摘局部义齿（RPDs）治疗后，菌斑指数（PI）、牙龈指数（GI）和探诊深度（PD）值均有所增加；但在基牙与非基牙之间未观察到显著差异。关于可摘局部义齿对牙周健康的影响，已有不同研究进行探讨。我们的结...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 带安全锁的微量离心管	Biotek	MT1.5/100
牙科镊子	Bader	17/4021-1
DTprime 实时荧光定量PCR仪	DNA-Technology		实时荧光定量PCR仪
IBM SPSS	IBM Corp	Version 21.0
Microsoft Excel	Microsoft Office 2010
纸尖（编号 35；04 锥度）	DiaDent	MP210-602
ParodontoScreen 实时荧光定量PCR检测试剂盒	DNA-Technology	R1-P808-S3/5EU
牙周探针	MEDESY	548/9PT
PREP-GS PLUS	DNA-Technology	P-003/2EU	DNA提取试剂盒
RealTime 软件	DNA-Technology	Version 7.9
0.9% 氯化钠溶液	VIOSER