NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 轴调控脓毒症模型中巨噬细胞极化与炎症反应

摘要

本方案结合临床样本、培养的巨噬细胞以及盲肠结扎穿刺（CLP）小鼠模型，研究NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1轴在脓毒症中对巨噬细胞极化和炎症反应的调控作用，提供了可适用于其他lncRNA介导的免疫通路的分步操作指南。

摘要

脓毒症的特征是宿主免疫反应失调，至今仍是全球死亡的主要原因之一。长链非编码RNA NEAT1已被发现参与多种炎症性疾病，但其在脓毒症期间巨噬细胞极化中的具体作用尚未完全明确。本文通过临床样本、体外培养的巨噬细胞以及CLP小鼠模型，系统研究了NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1调控轴。采用定量PCR、蛋白质印迹、双荧光素酶报告基因检测和RNA下拉实验，验证了NEAT1、miR-181a-5p与HMGB1之间的竞争性内源RNA（ceRNA）相互作用。通过免疫荧光、Transwell迁移实验以及末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色等功能实验，评估巨噬细胞的极化、迁移和凋亡情况。在体实验中，结合CLP模型、ELISA和组织病理学分析，验证了NEAT1敲低对细胞因子谱和器官损伤的影响。在脓毒症患者及脂多糖刺激的巨噬细胞中，NEAT1和HMGB1表达上调，而miR-181a-5p表达下调。沉默NEAT1可通过miR-181a-5p/HMGB1轴促进M2型巨噬细胞极化，减少促炎性细胞因子，抑制巨噬细胞迁移，并减轻脓毒症小鼠的组织损伤。据我们所知，这是首次整合临床样本、体外和体内实验方法，系统表征脓毒症中lncRNA-微小RNA-HMGB1调控回路的综合实验方案。本研究为靶向NEAT1相关ceRNA网络作为潜在治疗策略提供了方法学框架。

引言

脓毒症被定义为由宿主对感染的失调反应所导致的危及生命的器官功能障碍¹。尽管临床管理水平不断进步，其病死率仍然较高，且免疫失衡背后的分子机制尚未完全阐明^2,3。在免疫调节因子中，长链非编码RNA（lncRNA）已被证实是炎症信号通路和巨噬细胞功能的重要调控分子^4,5。NEAT1是一种在细胞核中富集的高丰度转录本，是副斑点（paraspeckles）的结构组分，已被发现与免疫反应及组织损伤反应相关^6,7。既往研究已将NEAT1与肠道炎症、缺血/再灌注损伤以及急性呼吸窘迫综合征联系起来^8,9,10。

在脓毒症背景下，越来越多的证据表明长链非编码RNA（lncRNA）可调控巨噬细胞极化和炎症信号通路，从而影响疾病的进展和结局^11,12。例如，lncRNA KCNQ1OT1 和 SNHG1 已被报道通过介导微小RNA的途径调节脓毒症诱导的心肌损伤^13,14。然而，NEAT1 是否通过 miR-181a-5p/HMGB1 轴调控巨噬细胞极化在脓毒症中尚未得到系统阐明。为填补这一空白，我们建立了一种结合患者血液样本、脂多糖刺激的 RAW264.7 巨噬细胞以及盲肠结扎穿刺小鼠模型的研究方案，以探究 NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 轴的作用机制^15,16。通过定量PCR、蛋白质印迹、双荧光素酶报告基因检测、RNA下拉实验以及巨噬细胞M1/M2极化、迁移和凋亡等功能检测，该方案提供了一个可重复的实验框架，用于明确NEAT1在脓毒症中作为巨噬细胞功能调控因子的作用，并为靶向lncRNA的治疗策略开发提供支持^17,18。

方案

所有涉及人类受试者的实验程序均经河北大学附属医院伦理审查委员会批准（批准号：HDFY-LL-2021-232）。已从所有受试者或其法定代理人（如适用）处获得书面知情同意。所有动物实验均按照机构指南和国家法规进行，并经同一伦理委员会批准。批准的实验方案中明确规定了盲肠结扎穿刺（CLP）操作、腺病毒给药、麻醉方案以及人道终点的具体细节。

患者样本采集

于2022年2月至2024年7月期间，河北大学附属医院前瞻性地招募了脓毒症患者。共有50例患者符合纳入标准，包括26名男性和24名女性，年龄为24–69岁（平均52.4 ± 10.2岁）。根据脓毒症-3（Sepsis-3）诊断标准，脓毒症的诊断需满足疑似或确诊感染，并且序贯器官衰竭评估（Sequential Organ Failure Assessment, SOFA）评分较基线升高≥2分。对每位患者，记录其主要感染来源（如肺部、腹腔、尿路或血流感染）和疾病严重程度（脓毒症或脓毒性休克），并汇总SOFA评分的分布情况以评估疾病负担。作为对照组，纳入39名无感染或全身性炎症性疾病临床证据的健康个体（20名男性和19名女性，年龄26–70岁，平均50.7 ± 11.0岁）。两组在年龄和性别构成上无显著差异。

在可行的情况下，于启动脓毒症特异性治疗前采集脓毒症患者的外周静脉血。采集血液（通常为5-10 mL）至含乙二胺四乙酸（EDTA）涂层的试管中，并轻轻颠倒混匀数次，以充分混合抗凝剂。样本在采集后约1小时内进行处理。在室温下以1,500 ×g离心10分钟获取血浆，分装至带标签的微量管中，并于-80 °C保存，用于后续细胞因子检测。对于RNA和蛋白质提取，根据制造商说明书，采用密度梯度分离介质从部分相同样本中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。随后用PBS洗涤细胞两次，计数后以细胞沉淀形式在-80 °C保存。

细胞培养与转染

RAW264.7 小鼠巨噬细胞在含 10% 热灭活胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的 RPMI-1640 培养基中培养，置于 37 °C、5% CO₂ 的湿化培养箱中。为维持稳定的细胞表型，细胞在达到过度融合前使用细胞刮进行传代。

进行转染时，将 RAW264.7 细胞以每孔 5 × 10⁵ 个细胞的密度接种于 6 孔板中，每孔加入 2 mL 完全培养基，于试剂处理前约 24 小时进行培养。当细胞培养至 70–90% 汇合度时，按照生产商说明书，将核酸（如 NEAT1 或 HMGB1 表达质粒、短发夹结构、miR-181a-5p 模拟物或抑制剂及其相应的对照）与脂质转染试剂在无血清培养基中形成复合物。通常将 2–3 µg 质粒 DNA 或 50–100 pmol 小 RNA 与推荐体积的转染试剂混合，在室温下孵育 10–15 分钟以形成复合物，随后逐滴加入不含抗生素的培养基中。转染 4–6 小时后，更换为新鲜的完全培养基，继续培养 24–48 小时，然后进行后续实验分析。

巨噬细胞极化的诱导

为诱导炎症性巨噬细胞极化，将RAW264.7细胞在完全培养基中置于6孔板内贴壁培养至少4小时。随后更换为含100 ng/mL脂多糖（LPS）的DMEM培养基，在37 °C、5% CO₂条件下孵育6小时。刺激结束后，根据实验设计，立即对细胞进行RNA和蛋白质提取、免疫荧光染色、迁移实验或凋亡分析。

定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）

使用基于苯酚-硫氰胍的单相试剂，按照标准操作从培养的细胞、外周血单个核细胞（PBMCs）或小鼠组织中提取总RNA。简言之，每10⁶个细胞或50–100 mg组织加入1 mL试剂进行裂解，室温孵育5分钟，随后每1 mL试剂加入0.2 mL氯仿剧烈混匀。孵育2–3分钟后，于4 °C以12,000 × g离心15分钟以分离各相。将水相转移至新离心管中，加入等体积异丙醇沉淀RNA。混合物室温静置约10分钟后，再次于4 °C以12,000 × g离心10分钟。所得沉淀用75%乙醇洗涤，于4 °C以7,500 × g离心5分钟，短暂空气干燥后溶于无RNase的水中。采用紫外分光光度法测定RNA浓度和纯度，A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.8–2.0之间的样品用于后续分析。必要时，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

互补DNA（cDNA）以总RNA为模板，使用市售的逆转录试剂盒，按照制造商说明书进行合成。针对miR-181a-5p，采用推荐的基因特异性或茎环引物。定量实时PCR在实时PCR系统上进行，使用合适的预混液（如基于SYBR Green或探针的化学体系），总反应体积为20 µL，包含cDNA模板及每种引物0.2–0.4 µM。典型的扩增循环条件包括：95 °C初始变性3 min，随后进行40个循环，每个循环为95 °C变性10 s，60 °C退火/延伸30 s，并在必要时进行熔解曲线分析以确认扩增产物的特异性。NEAT1和HMGB1的表达水平以GAPDH为内参进行标准化，miR-181a-5p的表达则以U6核小RNA为内参进行标准化。相对表达量采用2−ΔΔCt法计算，并以相对于对照组的倍数变化表示。引物序列及扩增片段大小汇总于单独的电子表格中，随稿件一并提交 补充表1.

蛋白质印迹法

进行蛋白质印迹实验时，细胞用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，然后加入含有蛋白酶抑制剂的适当放射免疫沉淀法（RIPA）裂解缓冲液进行裂解。裂解物在冰上孵育15–30分钟，期间偶尔轻柔混匀，并在4 °C下以12,000 × g离心15分钟以去除细胞碎片。收集上清液，采用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白浓度。

将等量的蛋白质（通常每泳道40 µg）与上样缓冲液混合，在95 °C下煮沸5-10分钟以使蛋白质变性，然后在适当丙烯酰胺浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶上进行分离（例如，HMGB1使用10-12%的凝胶）。采用湿转或半干转系统，按照目标分子量范围推荐的条件，将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用含0.1% Tween-20的Tris缓冲盐水（TBST）配制的5%脱脂牛奶或牛血清白蛋白（BSA）溶液于室温封闭膜1小时，随后在4 °C下与一抗（HMGB1抗体，例如1:500稀释；GAPDH抗体，例如1:1,000稀释）在封闭缓冲液中孵育过夜。在TBST中洗涤三次后，膜与合适的辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵育1小时。再次洗涤后，使用增强型化学发光底物显色，并通过数字成像系统采集蛋白条带信号。使用图像分析软件对条带强度进行定量，将HMGB1信号归一化至GAPDH，进而比较各组间的相对表达水平。

双荧光素酶报告基因检测

将含有预测的miR-181a-5p结合位点的NEAT1野生型与突变片段以及HMGB1 3′-非翻译区（3′-UTR）克隆至萤光素酶报告载体中¹⁹。所有构建体均通过Sanger测序验证，以确认插入和突变位点的准确性²⁰。将RAW264.7细胞接种于24孔板中，过夜贴壁培养。随后，使用基于脂质的转染试剂，按照常规转染操作步骤，将报告质粒与miR-181a-5p抑制剂、模拟物或相应的阴性对照共同转染至细胞中。

孵育约24-48小时后，用PBS洗涤细胞，加入适量被动裂解缓冲液（例如，每孔20 µL）裂解细胞，并轻轻振荡以确保裂解完全。使用双荧光素酶检测试剂盒和发光仪，按照制造商的说明检测荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性归一化萤火虫荧光素酶活性，以校正转染效率；将每组的相对荧光素酶活性与相应的对照组进行比较。

Transwell 迁移实验

采用预先包被适合细胞侵袭实验的细胞外基质凝胶的Transwell小室评估巨噬细胞迁移。将凝胶在冰上用无血清培养基按1:6比例稀释，取50 µL稀释液加入每个插入膜的上表面。将培养板于37 °C孵育约4小时，使凝胶充分凝固。收集转染或处理后的RAW264.7细胞，重悬于无血清培养基中，调整细胞浓度至1 × 10⁶ cells/mL，取100 µL细胞悬液（含1 × 10⁵个细胞）加入上室。下室中加入600 µL含10%胎牛血清的完全培养基作为趋化因子。

细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。孵育结束后，用棉签轻轻擦除膜上表面未迁移的细胞。黏附在膜下表面的迁移细胞在室温下用 95% 乙醇固定约 20 分钟，然后用 0.5% 结晶紫溶液染色 10–15 分钟。用 PBS 洗涤以去除多余染料，膜自然风干。在光学显微镜下观察迁移细胞，对每个插入物中若干随机选取的视野内的细胞进行盲法计数，以量化迁移能力。

TUNEL 凋亡检测

为了检测细胞凋亡，将 RAW264.7 细胞培养在玻璃盖玻片上，并进行指定的处理或转染。细胞在室温下用 4% 多聚甲醛固定 30–60 分钟，并用 PBS 漂洗。内源性过氧化物酶活性通过在 0.3% 过氧化氢中孵育 20 分钟进行阻断，随后用 PBS 洗涤。使用 TUNEL 检测试剂盒，将标记混合液加至细胞表面使其完全覆盖。样品在湿化 chamber 中 37 °C 孵育约 60 分钟，然后根据试剂盒说明书终止反应。在 37 °C 下与链霉亲和素-HRP 或等效检测试剂孵育 30 分钟后，使用显色底物（如 3,3′-二氨基联苯胺，DAB）对细胞核进行显色，直至出现棕褐色染色的凋亡细胞核。切片用苏木精复染，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，最后用永久封片剂封片。在光学显微镜下观察凋亡细胞和总细胞核数量，凋亡指数以 TUNEL 阳性细胞所占的百分比计算。

免疫荧光

进行免疫荧光染色时，将石蜡包埋的组织切片在二甲苯中脱蜡，并通过梯度乙醇溶液逐步水化至水。根据抗体说明书推荐，使用适当的缓冲液（如柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0）进行抗原修复，并采用微波或高压锅进行热诱导表位修复。切片冷却并漂洗后，在37 °C下用含5%正常血清的PBS封闭1小时，以减少非特异性结合。随后，将组织切片在4 °C下与针对巨噬细胞极化标志物和炎症细胞因子的一抗孵育过夜，所用一抗包括CD206、TNF-α、IL-1β、IL-6、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、IL-4、IL-10和Arg-1（通常按1:500稀释），抗体用封闭缓冲液稀释。

次日，将切片用PBS洗涤，然后在37 °C避光条件下与相应的荧光染料标记的二抗孵育1小时。用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行复染，持续5分钟。最终洗涤后，切片用抗荧光淬灭封片剂封片，并使用合适的滤光片组在荧光显微镜下观察。各组图像均采用一致的曝光参数采集，所有图注和图例中均标明比例尺（例如，20 µm）和放大倍数。

CLP诱导的脓毒症小鼠模型

雄性C57BL/6小鼠（24–32 g）在手术前至少适应环境1周，随后被随机分配至假手术组、盲肠结扎穿孔组（CLP）、CLP加阴性对照短发夹RNA组或CLP加NEAT1短发夹RNA组（每组n = 6）。小鼠在密闭容器中通过吸入乙醚麻醉约1–3分钟，直至翻正反射消失；也可使用其他机构批准的麻醉剂，剂量和暴露时间以诱导翻正反射消失同时维持足够呼吸功能为准。腹部毛发剃除后，皮肤用适当的消毒液进行消毒。沿腹中线做约1–2 cm的切口，暴露盲肠及其相连的肠段。

对于CLP操作，将盲肠轻柔地移出体外，并使用无菌缝线在其长度约三分之二处结扎，注意避免阻塞回盲瓣或影响肠系膜血流。使用经批准方案中指定规格的无菌针头（例如21 G）对结扎后的盲肠穿刺两次，并轻轻挤出少量粪便物质，以确保穿刺孔通畅。随后将盲肠放回腹腔，分层缝合腹壁和皮肤。假手术小鼠仅接受相同的剖腹手术和盲肠暴露，但不进行结扎或穿刺。

为实现 in vivo 条件下 NEAT1 的基因沉默，制备了编码 shNEAT1 的腺病毒载体及相应的阴性对照载体，并将其滴度调整至预定浓度（例如，1 × 10⁹ 空斑形成单位/mL）。根据实验设计及伦理委员会批准的方案，于 CLP 手术后的特定时间点（例如，术后 1 小时），通过尾静脉注射固定体积的病毒悬液（如每只小鼠 100 µL）。术后小鼠接受标准的术后护理，必要时给予皮下补液，并持续监测脓毒症和痛苦的临床体征。在预定时间点，将动物置于密闭容器中，通过过量吸入乙醚实施人道处死（使用约 5–10 mL 乙醚以确保呼吸迅速停止），并在确认死亡后采集血液用于细胞因子分析，同时取器官组织用于组织病理学、免疫荧光及分子检测。

统计分析

统计分析使用 SPSS 23.0 版本或同等统计软件完成。数据以均值 ± 标准差（SD）表示，除非另有说明。对于两组之间的比较，若数据呈正态分布且方差齐性，则采用非配对 Student t 检验。对于三组或更多组之间的比较，采用单因素方差分析（ANOVA），并在发现显著总体效应时，进行适当的事后检验以进行多重比较。双侧 p 值 < 0.05 被认为具有统计学显著性。统计学符号的含义（例如，p < 0.05，*p < 0.01）在图注中定义，生物学重复次数在相应正文或图注中注明。

结果

脓毒症中 NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 表达及相互作用的检测

脓毒症患者血清中，NEAT1 和 HMGB1 水平显著高于健康对照组，而 miR-181a-5p 则明显降低。在脂多糖刺激的外周血单个核细胞（PBMCs）以及 RAW264.7 巨噬细胞中也观察到类似的表达模式，表明该调控轴在脓毒症及类脓毒症炎症条件下均发生一致性的改变（图 1A-C）。在 RAW264.7 细胞中敲低 NEAT1 可有效降低 NEAT1 表达并提高 miR-181a-5p 水平，证实成功构建了适用于功能研究的 NEAT1 缺失模型（图 1D）。双荧光素酶报告基因实验显示，miR-181a-5p 可直接与 NEAT1 及 HMGB1 3′-非翻译区（3′-UTR）中预测的结合位点相互作用，而这些位点的突变则消除了 miR-181a-5p 对荧光素酶活性的依赖性效应（

讨论

脓毒症的特征是严重的、且常常是长期存在的免疫失调，其中过度炎症和免疫抑制阶段并存，并共同导致器官衰竭和不良预后^21,22。越来越多的证据表明，长链非编码RNA（lncRNA）通过调控炎症信号通路和巨噬细胞极化参与这些过程^23,24。例如，lncRNA-MAAMT被报道可通过SRSF1/NF-κB轴促进巨噬细胞募集和促炎性活化²⁵，而TCONS_00019715则与M1型极化增强相关²⁶。在本研究中，数据显示NEAT1在脓毒症患者血清和外周血单个核细胞（PBMCs）以及脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞中均持续上调，而miR-181a-5p则呈下调。体外（in vitro）和体内（in vivo）实验均表明，在炎症条件下，NEAT1可抑制miR-181a-5p的表达，提示该lncR...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
腺病毒载体（shNEAT1）	10692-V5	Vigene Biosciences	用于在体内和体外敲低 NEAT1 表达的腺病毒。
BCA 蛋白检测试剂盒	23227	Thermo Fisher	用于定量细胞裂解液中蛋白浓度的试剂盒。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒	E1910	Promega	用于双荧光素酶报告基因实验，以检测 miR-181a-5p 相互作用的试剂盒。
ELISA 试剂盒（细胞因子）	N/A	R&D Systems	用于测定血清和组织样本中细胞因子水平的试剂盒。
胎牛血清（FBS）	16000-044	Gibco	用于细胞培养基中以支持细胞生长的添加剂。
GAPDH 抗体	2118S	Cell Signaling Technology	作为 Western 印迹实验中上样对照使用的 GAPDH 一抗。
苏木精-伊红染色试剂盒	N/A	Thermo Fisher	用于组织切片的组织学染色，以进行病理学分析。
免疫荧光抗体（CD206）	14693-1-AP	Proteintech	用于检测组织切片中 M2 巨噬细胞标志物 CD206 的抗体。
脂多糖（LPS）	L2630	Sigma-Aldrich	用于诱导 RAW264.7 细胞中炎症性巨噬细胞极化的 LPS。
miR-181a-5p 模拟物	N/A	N/A	用于调控 miR-181a-5p 水平的合成 miR-181a-5p 模拟物。
NEAT1 表达质粒	N/A	N/A	用于在 RAW264.7 巨噬细胞中过表达 NEAT1 的质粒。
RAW264.7 巨噬细胞	TIB-71	ATCC	用于体外实验的小鼠巨噬细胞系。
RIPA 裂解缓冲液	89901	Thermo Fisher	用于裂解细胞以提取总蛋白的缓冲液。
RPMI-1640 培养基	11875-093	Gibco	RAW264.7 巨噬细胞的培养基。
SYBR Green 主混合液	4385612	Thermo Fisher	用于定量实时 PCR 分析的试剂。
Transwell 迁移实验小室	3422	Corning	用于 Transwell 迁移实验，以评估巨噬细胞迁移能力的小室。
TUNEL 凋亡检测试剂盒	ab66110	Abcam	通过 TUNEL 染色检测 RAW264.7 细胞凋亡的试剂盒。
Western 印迹抗体（HMGB1）	ab18256	Abcam	用于 Western 印迹实验的 HMGB1 一抗。