本文介绍了一种结合孟德尔随机化与实验验证的研究方案，用于鉴定跟腱损伤中的因果性代谢物，共鉴定出19种与跟腱损伤具有因果关联的血浆代谢物，并证明了5,6-二氢胸腺嘧啶和羟基天冬酰胺在促进组织修复和减轻炎症反应中的治疗潜力。
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本文介绍了一种结合孟德尔随机化与实验验证的研究方案，用于鉴定跟腱损伤中的因果性代谢物，共鉴定出19种与跟腱损伤具有因果关联的血浆代谢物，并证明了5,6-二氢胸腺嘧啶和羟基天冬酰胺在促进组织修复和减轻炎症反应中的治疗潜力。
为研究血浆代谢物对跟腱损伤（ATI）进展和恢复的因果效应，本研究采用双样本孟德尔随机化（MR）方法，利用两个大型数据集的遗传数据进行分析。ATI 数据来源于 IEU-OpenGWAS 项目（ebi-a-GCST90018895），血浆代谢物数据包含 1,400 种代谢物。研究识别出代谢物的显著工具变量（IVs），并采用五种 MR 方法——IVW、MR-Egger、加权中位数、简单模式和加权模式——评估其因果关系。同时进行反向 MR 分析，以探讨 ATI 对代谢物水平的影响。在小鼠跟腱组织中，通过 H&E 染色和 Western blot 检测了经 5,6-二氢胸腺嘧啶（Dih）和羟基天冬氨酸（Hyd）处理后第 7 天的组织修复情况以及 IL-6、TNF-α、VEGFA 和 TGF-β1 的表达水平。MR 分析共识别出 19 种与 ATI 具有显著因果关联的代谢物。其中，12 种代谢物与 ATI 进展呈正相关，包括 Dih（IVW：OR = 1.197，95% CI：1.074–1.334；P = 0.001）和孕二醇-3-葡萄糖醛酸（IVW：OR = 1.098，95% CI：1.023–1.177；P = 0.001）。相比之下，7 种代谢物与 ATI 恢复相关，例如 Hyd（IVW：OR = 0.789，95% CI：0.707–0.880；P < 0.001）。反向 MR 分析未发现 ATI 对代谢物水平具有显著的因果效应，提示该关系为单向性。X 射线和 H&E 分析显示，Dih 和 Hyd 治疗以剂量依赖方式显著促进跟腱愈合。此外，Dih 和 Hyd 治疗显著降低 IL-6 和 TNF-α 的表达（P < 0.05），同时提高 VEGFA 和 TGF-β 的水平（P < 0.05），表明炎症反应减轻且组织修复得到促进。本研究识别出特定血浆代谢物与 ATI 转归之间的潜在因果关系，研究结果可能为未来的治疗策略提供依据，并凸显 MR 方法在探索代谢物-疾病关联中的应用价值。
跟腱损伤（ATI）是一种常见且致残性的肌肉骨骼疾病，尤其多发于运动员和体力活动频繁的人群1,2。跟腱是人体最大且最强健的肌腱，在运动中起着关键作用，可在行走、跑步和跳跃等活动期间将小腿肌肉的力量传递至足跟3,4,5,6。由于其血供有限且承受较大的机械应力，因此特别容易因过度使用而受损2,7。ATI 表现形式多样，从轻度肌腱病到完全断裂不等，常导致显著疼痛、活动能力下降以及长期康复8,9。尽管治疗手段已有进步，ATI 仍常导致持续性疼痛、活动能力降低和恢复时间延长，并增加慢性并发症及再次受伤的风险5,10,11,12。
近期研究强调了血浆代谢物在急性肌腱损伤（ATI）愈合过程中的关键作用13,14。这些参与多种生物化学通路的代谢物被认为会影响炎症反应、组织修复和肌腱健康等关键因素15。例如，特定氨基酸和脂类对于胶原蛋白合成以及氧化应激的调控至关重要，这两者均在肌腱病变中发挥重要作用16,17。富含血小板血浆（PRP）含有多种生长因子，如PDGF、TGF-β、VEGF和IGF，在促进肌腱愈合方面显示出一定潜力，但其在治疗慢性跟腱病方面的有效性仍存在争议14。近年来，高通量组学技术（如代谢组学和蛋白质组学）为探索ATI等复杂疾病分子特征提供了前所未有的机遇18,19。先进的代谢组学技术有助于识别与ATI预后相关的生物标志物，揭示特定代谢物如何影响损伤进展与恢复过程。
代谢物谱分析及代谢通路研究已成为识别与损伤相关的生物标志物和通路的有力手段20,21。孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）是一种稳健的因果推断方法，利用遗传变异作为工具变量（instrumental variables, IVs），以解决传统流行病学研究中常见的混杂偏倚问题22,23,24,25,26,27。MR在研究暴露因素（如血浆代谢物）与结局（如肌腱损伤，ATI）之间的因果关系方面尤为有用。与易受混杂因素和反向因果关系影响的传统观察性研究不同，MR通过使用遗传变异作为工具变量，能够提供更强的因果推断依据。深入理解血浆代谢物如何影响肌腱健康，对于推动治疗策略的发展和改善康复效果至关重要。
在这些进展的基础上，本研究利用孟德尔随机化（MR）方法探究血浆代谢物在急性肾损伤（ATI）中的因果作用。通过分析与代谢物水平相关的遗传变异，确定了与ATI进展和恢复相关的特定代谢物。此外，研究还利用动物模型对候选代谢物（如5,6-二氢胸腺嘧啶（Dih）和羟基天冬酰胺（Hyd））进行了实验验证，以阐明其对ATI病程及修复过程的影响。
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伦理批准与参与同意
所有动物实验设计均严格遵循宁夏回族自治区实验动物管理办法，并经宁夏医科大学宁夏回族自治区人民医院伦理委员会批准。
研究设计
本研究采用两样本孟德尔随机化（MR）方法，探讨了1400种血浆代谢物与ATI之间的因果关系。为了确保工具变量（IVs）在因果推断中的有效性，必须满足三个关键假设：（1）遗传变异与感兴趣的暴露因素直接相关；（2）遗传变异不受暴露与结局之间潜在混杂因素的影响；（3）遗传变异仅通过暴露因素影响结局，而不通过其他替代通路产生作用。
ATI 的 GWAS 数据来源
关于ATI的全基因组关联研究（GWAS）数据来源于IEU-OpenGWAS项目（https://gwas.mrcieu.ac.uk/），具体使用的是数据集ebi-a-GCST90018895。该GWAS分析共纳入357,658名欧洲血统个体，其中包括7,746例病例和349,912例对照。经过质量控制后，共鉴定出19,072,056个单核苷酸多态性（SNPs）。质量控制步骤包括剔除次要等位基因频率<0.01、哈迪-温伯格平衡检验P值<1×10-⁶以及基因型检出率<0.95的SNP位点。采用主成分分析评估群体分层，并计算基因组膨胀因子（λ）以评估系统性偏倚。
血浆代谢物的全基因组关联研究数据来源
暴露因素数据集包含了1,400种血浆代谢物的全基因组关联研究（GWAS）数据，其中包括1,091个代谢物水平和309个代谢物比值，这些数据收录于GWAS数据库（https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90199621-90201020）中。孟德尔随机化（MR）分析仅限于欧洲血统个体。该数据集的详细信息见补充材料，表S1。
IV 的选择
在确定工具变量（IVs）时，血浆代谢物相关SNP的统计学显著性阈值设定为 P < 1 × 10-5。为确保分析的独立性，采用 r2 = 0.001 和千碱基（kb）= 10,000 的阈值对SNP进行聚类合并，排除了 r2 > 0.001 且 kb < 10,000 的 19,037,213 个SNP，以消除潜在的连锁不平衡（LD）效应。F统计量值 < 10 的SNP因存在高度异质性而被排除在后续分析之外，最终保留了符合标准的34843个SNP作为有效的工具变量。
动物与实验设计
所有动物实验均严格遵循中国宁夏回族自治区实验室动物管理条例，并经宁夏医科大学附属宁夏回族自治区人民医院伦理委员会批准。雄性 BALB/c 小鼠（8 周龄，SPF 级）购自北京维通利华实验动物技术有限公司（中国北京）。小鼠在受控环境（温度 23 ± 1°C，湿度 60 ± 10%）中适应性饲养一周，自由摄取标准饲料和饮水，光照周期为 12 小时光照/12 小时黑暗。适应期结束后，建立小鼠肌腱损伤模型。经纵向皮肤切口暴露左侧跟腱，并使用显微外科剪在肌腱中点处进行标准化全层横断。随后在体视显微镜下立即使用 6-0 不可吸收缝线进行肌腱修复。手术后立即进行 X 射线成像，以确认 ATI 小鼠模型建立成功。同时，在相同麻醉条件下对对照组小鼠进行 X 射线成像，作为空白对照28。所有操作均通过腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg·kg-1）诱导全身麻醉完成，术后每 12 小时皮下注射布托啡诺（0.05 mg·kg-1）镇痛，持续 48 小时29。模型成功建立后，小鼠由不知分组信息的研究人员采用计算机生成的随机数字随机分配至以下各组：对照组、模型组，以及接受低剂量（10 mg·kg-1，LD-Hyd）、中剂量（30 mg·kg-1，MD-Hyd）和高剂量（50 mg·kg-1，HD-Hyd）Dih 治疗的治疗组。样本量计算：根据前期数据显示代谢物治疗可使愈合评分提高 40%（标准差 = 15%），设定 α = 0.05（双侧检验），每组 n = 6 只小鼠即可达到 80% 的检验效能。实验操作和结局评估均由不知分组信息的研究人员完成30。
苏木精-伊红（HE）染色
治疗后第7天，在经腹腔注射戊巴比妥钠（100 mg/kg）诱导深度麻醉后处死小鼠·kg-1），确保在组织采集前完全丧失反射反应。小心采集受伤的跟腱组织，包括少量周围软组织，并进行处理。一段15 mm2 以跟腱为中心的皮肤组织被切除。皮肤样本在室温下用4%多聚甲醛溶液固定48 h，随后进行脱水、石蜡包埋，并切成5 μm厚的切片。 µm. 采用H染色评估伤口皮肤的结构特征、肉芽组织形成及炎性细胞浸润情况&E 染色。进行组织学评估时，切片在二甲苯中脱蜡（2 × 10 分钟），通过梯度乙醇复水（100%、95%、85% 和 75%，每级 5 分钟），并用蒸馏水冲洗。切片用 Harris 苏木精染色 5 分钟，流水冲洗 5 分钟，1% 酸性乙醇分化 10 秒，0.2% 氨水返蓝 30 秒。洗涤后，切片用 0.5% 伊红复染 2 分钟，随后脱水、透明并封片。组织学评估可靠性：为确保测量准确性，随机选取 20% 的样本由两名不知分组情况的观察者独立评分。采用组内相关系数（ICC）评估评分者间信度。胶原排列的 ICC 为 0.89（95% CI：0.81–0.94），组织退变的 ICC 为 0.92（95% CI：0.86–0.96），炎症细胞浸润的 ICC 为 0.87（95% CI：0.78–0.93），表明信度极佳。评分者内信度通过一名观察者在两周间隔后重新评估 15% 的样本进行评估，所得 ICC 值 > 所有参数均为 0.8531.
Western印迹分析
采用蛋白质印迹法（Western blot）分析蛋白质表达水平。使用BCA蛋白浓度检测试剂盒进行蛋白质定量。等量蛋白质通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，转移至硝酸纤维素膜。将膜置于含0.1% Tween-20的Tris缓冲盐水中，加入5%脱脂牛奶，室温封闭1小时。膜与以下一抗于4°C孵育过夜：VEGFA（1:1000，ab46154）、TGF-β1（1:1000，21898-1-AP）、IL-6（1:1000，26404-1-AP）和TNF-α（1:1000，17590-1-AP）。用PBS洗涤三次后，膜在室温下与二抗（1:5000）孵育90分钟。根据制造商说明书，使用ECL化学发光底物试剂盒（详见材料表）显影蛋白条带，并采用ImageJ软件（版本1.8；美国国立卫生研究院）进行分析。以GAPDH（10494-1-AP）作为上样对照。
统计分析
统计分析使用 R Studio 软件进行。采用 TwoSampleMR 和 ieugwasr R 软件包提取暴露数据并筛选有效的工具变量（IV），包括连锁不平衡剪枝（r² < 0.001，窗口大小 = 10,000 kb）、等位基因一致性校正以及 F 统计量计算（F = β²_exposure/SE²_exposure）。在孟德尔随机化（MR）和反向 MR 分析中，我们使用了 VariantAnnotation、gwasglue 和 TwoSampleMR 软件包，以实现稳健的因果推断和敏感性检验。开展了一项两样本 MR 研究，以探究与血浆代谢物相关的性状。采用了五种不同的分析方法：逆方差加权法（IVW）、MR-Egger 回归、加权中位数法（WM）、简单模式法和加权模式法。主要结果基于 IVW 方法确定，统计学显著性阈值设为 P < 0.01。IVW 方法通过赋予权重以最小化变异影响，从而提供更精确的效应估计值。使用 MR-Egger 回归评估多效性（即基因影响多个性状的现象），其中水平多效性通过截距的 P 值进行评估（P > 0.05），异质性则通过结合 MR-Egger 的 Q 统计量的 IVW 方法进行检验。当 P > 0.05 时，未观察到显著异质性。采用 Benjamini-Hochberg 错误发现率（FDR）方法进行多重检验校正，FDR < 0.05 被认为具有显著性。异质性通过 Cochran's Q 统计量和 I2 统计量进行量化，其中 I2 > 50% 表示存在显著异质性。对于 I2 值，依据 Ioannidis 等人描述的方法计算 95% 置信区间。通过依次剔除每个 SNP 进行敏感性分析，以评估单个变异对整体结果的影响。
为评估测量的可靠性，采用组内相关系数（ICC）对关键结局指标（WB 定量和组织学评分）进行重测信度分析。使用 ICC 评估 Western Blot（WB）定量和组织学评分的评分者间和评分者内可靠性。判断标准如下：低于 0.50 为差，0.50 至 0.75 为中等，0.75 至 0.90 为良好，高于 0.90 为极好32。三名独立的研究人员在相隔一周的两个时间点对同一组样本进行了盲法评估。IL-6、TNF-α、VEGFA 和 TGF-β 的 Western blot 定量 ICC 值介于 0.87 至 0.93 之间，表明具有极好的可靠性。组织学评分的 ICC 值分别为胶原排列 0.85 和新生血管形成评估 0.82。
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1,400 种血浆代谢物与 ATIs 之间的因果关系
对1,400种血浆代谢物进行了全面的孟德尔随机化（MR）分析，以评估其对急性肾损伤（ATI）的因果效应。主要分析采用逆方差加权（IVW）方法，并严格控制连锁不平衡（LD）和潜在混杂因素，以识别显著影响ATI进展和恢复的代谢物。图1展示了144种血浆代谢物与ATI之间的因果关联，若某种代谢物在本研究使用的至少一种MR分析方法中达到P值<0.050，则认为其关联具有统计学意义。表1列出了基于IVW方法在P<0.050水平上显示出潜在因果关联的69种血浆代谢物。在应用Benjamini-Hochberg方法对多重检验进行错误发现率（FDR）校正后，仍有19种代谢物在FDR<0.05水平上与ATI显著相关。使用Q统计量进行异质性检验的结果为Q = 15.73（P = 0.15），I² = 24%（95% CI: 0–58%），表明各研究间的异质性较低至中等。
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本研究进行了一项全面的孟德尔随机化分析，以探索1400种血浆代谢物与肌腱损伤（ATI）之间的因果关系。研究鉴定出19种血浆代谢物与ATI的进展和愈合显著相关，其中Dih和Hyd被确定为影响ATI预后的关键因素。后续的体内实验验证了这些代谢物在促进肌腱愈合中的有益作用。使用Dih和Hyd治疗后，促炎性细胞因子IL-6和TNF-α的表达显著下调，且呈剂量依赖性（P < 0.001）。同时，血管生成和组织修复的关键标志物VEGFA和TGF-β的表达随着Dih和Hyd剂量的增加而显著上调。这些发现凸显了这些代谢物在增强肌腱再生方面的治疗潜力。
在鉴定出的19种代谢物中，有12种与肌腱病（ATI）进展显著相关，提示它们可能参与了ATI的病理生理过程。本研究鉴定出的代谢标志物在肌腱病理生理学方面具有显著的生物学合理性。琥珀酸是线粒体代谢中的关键中间产物，同时作为一种信号分子，可通过IL-1β介导的通路调节炎症反应和缺氧适应，这些过程对肌腱修复至关重要34。神经酰胺作为具有生物活性的脂质介质，参与调控腱细胞凋亡和细胞外基质...
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作者声明无竞争利益。
肠道菌群评估及分步治疗糖尿病足慢性溃疡的临床应用研究，银川市科技创新项目（2024SF005）。不同手术方法对急性闭合性跟腱断裂腱周组织血供及生物力学修复影响的应用研究，宁夏重点研发计划项目（2019BEG3036）。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5,6-二氢胸腺嘧啶 | 试剂 | 696-04-8 | 试剂 |
| BCA 蛋白定量试剂盒 | 试剂 | P0012 | 试剂 |
| ECL 化学发光底物试剂盒 | 试剂 | P0018S | 试剂 |
| GAPDH 抗体 | 抗体 | 10494-1-AP | 抗体 |
| 苏木精-伊红染色试剂盒 | 试剂 | G1120 | 试剂 |
| 羟基天冬酰胺 | 试剂 | H1126 | 试剂 |
| IL-6 抗体 | 抗体 | 26404-1-AP | 抗体 |
| ImageJ | 软件 | version 1.8 | 软件 |
| 硝酸纤维素膜 | 耗材 | HATF08130 | 耗材 |
| 多聚甲醛 | 试剂 | P0099-3L | 试剂 |
| RStudio | 软件 | version 4.5.2 | 软件 |
| SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒 | 试剂 | P0012AC | 试剂 |
| 戊巴比妥钠 | 麻醉剂 | 200-323-9 | 麻醉剂 |
| TGF-β1 抗体 | 抗体 | 21898-1-AP | 抗体 |
| TNF-α 抗体 | 抗体 | 17590-1-AP | 抗体 |
| VEGFA 抗体 | 抗体 | ab46154 | 抗体 |
| X 射线成像系统 | 仪器 | MX-20 | 仪器 |
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