本文介绍了一种结合孟德尔随机化与实验验证的研究方案，用于鉴定跟腱损伤中的因果性代谢物，共鉴定出19种与跟腱损伤具有因果关联的血浆代谢物，并证明了5,6-二氢胸腺嘧啶和羟基天冬酰胺在促进组织修复和减轻炎症反应中的治疗潜力。
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本文介绍了一种结合孟德尔随机化与实验验证的研究方案，用于鉴定跟腱损伤中的因果性代谢物，共鉴定出19种与跟腱损伤具有因果关联的血浆代谢物，并证明了5,6-二氢胸腺嘧啶和羟基天冬酰胺在促进组织修复和减轻炎症反应中的治疗潜力。
为研究血浆代谢物对跟腱损伤（ATI）进展和恢复的因果效应，本研究采用双样本孟德尔随机化（MR）方法，利用两个大型数据集的遗传数据进行分析。ATI 数据来源于 IEU-OpenGWAS 项目（ebi-a-GCST90018895），血浆代谢物数据包含 1,400 种代谢物。研究识别出代谢物的显著工具变量（IVs），并采用五种 MR 方法——IVW、MR-Egger、加权中位数、简单模式和加权模式——评估其因果关系。同时进行反向 MR 分析，以探讨 ATI 对代谢物水平的影响。在小鼠跟腱组织中，通过 H&E 染色和 Western blot 检测了经 5,6-二氢胸腺嘧啶（Dih）和羟基天冬氨酸（Hyd）处理后第 7 天的组织修复情况以及 IL-6、TNF-α、VEGFA 和 TGF-β1 的表达水平。MR 分析共识别出 19 种与 ATI 具有显著因果关联的代谢物。其中，12 种代谢物与 ATI 进展呈正相关，包括 Dih（IVW：OR = 1.197，95% CI：1.074–1.334；P = 0.001）和孕二醇-3-葡萄糖醛酸（IVW：OR = 1.098，95% CI：1.023–1.177；P = 0.001）。相比之下，7 种代谢物与 ATI 恢复相关，例如 Hyd（IVW：OR = 0.789，95% CI：0.707–0.880；P < 0.001）。反向 MR 分析未发现 ATI 对代谢物水平具有显著的因果效应，提示该关系为单向性。X 射线和 H&E 分析显示，Dih 和 Hyd 治疗以剂量依赖方式显著促进跟腱愈合。此外，Dih 和 Hyd 治疗显著降低 IL-6 和 TNF-α 的表达（P < 0.05），同时提高 VEGFA 和 TGF-β 的水平（P < 0.05），表明炎症反应减轻且组织修复得到促进。本研究识别出特定血浆代谢物与 ATI 转归之间的潜在因果关系，研究结果可能为未来的治疗策略提供依据，并凸显 MR 方法在探索代谢物-疾病关联中的应用价值。
跟腱损伤（ATI）是一种常见且致残性的肌肉骨骼疾病，尤其多发于运动员和体力活动频繁的人群1,2。跟腱是人体最大且最强健的肌腱，在运动中起着关键作用，可在行走、跑步和跳跃等活动期间将小腿肌肉的力量传递至足跟3,4,5,6。由于其血供有限且承受较大的机械应力，因此特别容易因过度使用而受损2,7。ATI 表现形式多样，从轻度肌腱病到完全断裂不等，常导致显著疼痛、活动能力下降以及长期康复8,9。尽管治疗手段已有进步，ATI 仍常导致持续性疼痛、活动能力降低和恢复时间延长，并增加慢性并发症及再次受伤的风险5,10,11,
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伦理批准与参与同意
所有动物实验设计均严格遵循宁夏回族自治区实验动物管理办法，并经宁夏医科大学宁夏回族自治区人民医院伦理委员会批准。
研究设计
本研究采用两样本孟德尔随机化（MR）方法，探讨了1400种血浆代谢物与ATI之间的因果关系。为了确保工具变量（IVs）在因果推断中的有效性，必须满足三个关键假设：（1）遗传变异与感兴趣的暴露因素直接相关；（2）遗传变异不受暴露与结局之间潜在混杂因素的影响；（3）遗传变异仅通过暴露因素影响结局，而不通过其他替代通路产生作用。
ATI 的 GWAS 数据来源
关于ATI的全基因组关联研究（GWAS）数据来源于IEU-OpenGWAS项目（https://gwas.mrcieu.ac.uk/），具体使用的是数据集ebi-a-GCST90018895。该GWAS分析共纳入357,658名欧洲血统个体，其中包括7,746例病例和349,912例对照。经过质量控制后，共鉴定出19,072,056个单核苷酸多态性（SNPs）。质量控制步骤包括剔除次要等位基因频率<0.01、哈迪-温伯格平衡检验P值<1×10-
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1,400 种血浆代谢物与 ATIs 之间的因果关系
对1,400种血浆代谢物进行了全面的孟德尔随机化（MR）分析，以评估其对急性肾损伤（ATI）的因果效应。主要分析采用逆方差加权（IVW）方法，并严格控制连锁不平衡（LD）和潜在混杂因素，以识别显著影响ATI进展和恢复的代谢物。图1展示了144种血浆代谢物与ATI之间的因果关联，若某种代谢物在本研究使用的至少一种MR分析方法中达到P值<0.050，则认为其关联具有统计学意义。表1列出了基于IVW方法在P<0.050水平上显示出潜在因果关联的69种血浆代谢物。在应用Benjamini-Hochberg方法对多重检验进行错误发现率（FDR）校正后，仍有19种代谢物在FDR<0.05水平上与ATI显著相关。使用Q统计量进行异质性检验的结果为Q = 15.73（P = 0.15），I² = 24%（95% CI: 0–58%），表明各研究间的异质性较低至中等。
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本研究进行了一项全面的孟德尔随机化分析，以探索1400种血浆代谢物与肌腱损伤（ATI）之间的因果关系。研究鉴定出19种血浆代谢物与ATI的进展和愈合显著相关，其中Dih和Hyd被确定为影响ATI预后的关键因素。后续的体内实验验证了这些代谢物在促进肌腱愈合中的有益作用。使用Dih和Hyd治疗后，促炎性细胞因子IL-6和TNF-α的表达显著下调，且呈剂量依赖性（P < 0.001）。同时，血管生成和组织修复的关键标志物VEGFA和TGF-β的表达随着Dih和Hyd剂量的增加而显著上调。这些发现凸显了这些代谢物在增强肌腱再生方面的治疗潜力。
在鉴定出的19种代谢物中，有12种与肌腱病（ATI）进展显著相关，提示它们可能参与了ATI的病理生理过程。本研究鉴定出的代谢标志物在肌腱病理生理学方面具有显著的生物学合理性。琥珀酸是线粒体代谢中的关键中间产物，同时作为一种信号分子，可通过IL-1β介导的通路调节炎症反应和缺氧适应，这些过程对肌腱修复至关重要34。神经酰胺作为具有生物活性的脂质介质，参与调控腱细胞凋亡和细胞外基质.......
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作者声明无竞争利益。
肠道菌群评估及分步治疗糖尿病足慢性溃疡的临床应用研究，银川市科技创新项目（2024SF005）。不同手术方法对急性闭合性跟腱断裂腱周组织血供及生物力学修复影响的应用研究，宁夏重点研发计划项目（2019BEG3036）。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5,6-二氢胸腺嘧啶 | 试剂 | 696-04-8 | 试剂 |
| BCA 蛋白定量试剂盒 | 试剂 | P0012 | 试剂 |
| ECL 化学发光底物试剂盒 | 试剂 | P0018S | 试剂 |
| GAPDH 抗体 | 抗体 | 10494-1-AP | 抗体 |
| 苏木精-伊红染色试剂盒 | 试剂 | G1120 | 试剂 |
| 羟基天冬酰胺 | 试剂 | H1126 | 试剂 |
| IL-6 抗体 | 抗体 | 26404-1-AP | 抗体 |
| ImageJ | 软件 | version 1.8 | 软件 |
| 硝酸纤维素膜 | 耗材 | HATF08130 | 耗材 |
| 多聚甲醛 | 试剂 | P0099-3L | 试剂 |
| RStudio | 软件 | version 4.5.2 | 软件 |
| SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒 | 试剂 | P0012AC | 试剂 |
| 戊巴比妥钠 | 麻醉剂 | 200-323-9 | 麻醉剂 |
| TGF-β1 抗体 | 抗体 | 21898-1-AP | 抗体 |
| TNF-α 抗体 | 抗体 | 17590-1-AP | 抗体 |
| VEGFA 抗体 | 抗体 | ab46154 | 抗体 |
| X 射线成像系统 | 仪器 | MX-20 | 仪器 |
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