针对肺腺癌预后的靶向基因组分析和免疫细胞浸润的综合分析

摘要

该方案能够整合下一代测序和多色免疫荧光技术，以分析肺腺癌的特征。其目标是分析基因组异质性与肿瘤浸润免疫细胞密度之间的关系。这种多维方法有助于对肿瘤微环境进行全面评估，以便术后预后评估。

摘要

肺腺癌（LUAD）的预后传统上通过肿瘤淋巴结转移（TNM）分期评估，该分期不考虑患者的免疫状态。该方案整合了基因组分析和免疫微环境分析，以促进更全面的术后预后评估。该方法采用两种主要技术对石蜡嵌入的肿瘤组织进行回顾性分析。首先，下一代测序（NGS）采用定制的37基因面板，以识别驱动基因和重要性不明变异中的突变。其次，多重免疫荧光（mIF）用于靶向HLA-DR、CD68、CD163、CD206、PD-L1和PanCK。这使得能够定量化不同肿瘤区域特定免疫细胞亚群的空间分布和密度。这种综合方法使得能够同时评估基因组异质性和肿瘤浸润免疫细胞的特性。所得数据识别出突变谱的特定组合——如 EGFR 状态——和免疫细胞密度。这些综合组合使得研究它们对患者生存的整体影响成为可能，为未来肺癌预后模型的发展提供了有前景的途径。该方案展示了一种稳健的方法，用于表征LUAD肿瘤微环境复杂生物学特征。

引言

LUAD是最常见的肺癌亚型，但平均5年生存率仍低，约为15^%。当前的预后评估主要依赖TNM分期系统;然而，这种方法常常忽视患者的整体免疫状态，这可能限制其预测准确性。证据表明，基因组异质性和肿瘤微环境（TME）在LUAD肿瘤发生和疾病进展中都起着关键作用^2,3。

近年来，从传统桑格测序向靶向 NGS 的转变，使得对多个驱动基因（如 EGFR、TP53 和 KRAS ^4,5）进行高灵敏度、同时分析成为可能。虽然NGS提供了高分辨率的遗传变异图谱，但仅靠基因组数据无法捕捉TME内复杂的细胞相互作用和空间组织。

为解决这些复杂性，mIF相较传统免疫分析方法具有显著优势。虽然单重免疫组化（IHC）限制每个切片只能有一个标记，而mIF则能够同时检测多个蛋白标记，同时保持组织的空间结构。与可能导致组织降解的序列IHC或导致空间定位丧失和单^{细胞分辨率6,7,8}的序列性IHC不同，mIF结合空间区域注释可以实现免疫景观的原位多参数表^征。

该方案建立了整合靶向NGS、mIF和空间区域评估（涵盖整个组织、肿瘤边界和肿瘤核心）的综合工作流程。这种多维方法对于研究基因组变异与免疫细胞密度之间的相互作用至关重要——而单一模态方法往往未能捕捉到这一关系。通过评估这些综合特征，该方案为表征LUAD的生物学特征提供了互补策略，并为术后预后分层提供了更为稳健的框架。

方案

该回顾性研究已获昆明延安医院医学伦理委员会批准（批准号2021-140-01）。所有参与者均获得知情同意。

研究设计与样本采集
纳入了63名病理学或组织学确诊LUAD患者，他们在2015年至2021年间接受了手术切除。排除标准包括手术前接受新辅助化疗、放疗或免疫治疗。此外，同时患有恶性肿瘤、严重合并症、组织质量差或临床记录不完整的患者被排除在分析之外。将福马林固定石蜡嵌体（FFPE）肿瘤块处理成1毫米切片进行石蜡脱脂处理。如工作流程所示（图1），这些样本接受了使用mIF和靶向天然气管（NGS）的综合分析。这种结合方法使得基因组变化和免疫微环境特征的同时评估成为可能，为肿瘤生物学的表征提供了多维框架。

后续
通过电话随访追踪患者的靶向药物、免疫治疗以及疾病进展或死亡情况，并详细了解患者的存活状况、疾病进展或复发情况、术后辅助治疗情况及新诊断的合并症情况。随访时间于2023年7月结束，最终观察终点为疾病进展或死亡。总体生存期定义为从手术开始到患者死亡的时间。没有患者因随访而流失。最短随访时间为21个月。

NGS文库制备与测序
从FFPE组织切片中提取DNA。
从病理标本中获取FFPE组织切片（厚度3–10微米）。将切片放入无菌的微离心管中。每管加入二甲苯，并在室温下培养5–10分钟以去除石蜡。以12,000 x g 离心5分钟，然后小心丢弃上清液。重复二甲苯处理一次以确保完全脱石蜡。用100%乙醇连续洗涤颗粒两次，去除残留的二甲苯。将颗粒在室温下自然风干，直到残留的乙醇完全蒸发。加入适当的裂解缓冲液和蛋白酶K（DNA提取套件中提供），在56°C下培养1–3小时（必要时过夜），直到组织完全溶解。在90°C下进行额外孵育1小时，以逆转福尔马林交联。按照制造商说明，使用商业FFPE DNA提取套件（见 材料表）提取基因组DNA。FFPE样本中的DNA质量通常存在片段化;因此，DNA质量应满足最低完整性阈值（例如DIN ≥ 5），以确保文库成功制备靶向NGS。

DNA定量与归一化
使用荧光测量法定量DNA，以确保准确的浓度测量。使用三盐酸缓冲液（pH 8.5）将DNA样本归一化至约5–10 ng/μL的最终浓度。如有需要，逐步进行稀释步骤以确保DNA浓度的准确性和稳定性。

文库制备与靶标富集
利用基于混合捕获的靶向 NGS 制备从FFPE组织^提取的DNA测序文库。使用定制的探针面板进行靶标富集，覆盖与肿瘤发育相关的特定基因的外显子区域。如有需要，使用标准方法（如基于电泳的系统）评估文库质量和片段大小分布。

库池化与测序
用荧光测定法定量每个文库。根据测序套件要求，池库以等摩尔浓度进行。将池化的文库加载到Illumina测序平台，并以150 bp的对端测序图样进行测序。

数据处理与变异检测
原始测序读段采用标准生物信息学流程处理，包括转接头修剪、质量过滤以及与人类参考基因组（GRCh37/hg19）的比对。质量控制指标包括：Q20>85%，平均测序深度>2500倍，命中率>65%，Fold 80基础惩罚≤2。质量控制与比对：原始FASTQ数据通过FastQC和Trim Galore（或Trimmomatic）进行质量控制，以去除适配器污染和低质量序列。清除后的读段通过Burrows-Wheeler比对仪（BWA）比对到GRCh37（hg19）人类参考基因组。比对后处理：使用Picard和基因组分析工具包（GATK）进行排序、重复标记和基础质量评分重新校准（BQSR），以减少误报。变体呼叫：使用BWA MEM（0.7.16a - r1181）检测到生殖系单核苷酸多态性（SNP）和Indels。通过共识方法，使用Mutect2和VarScan2识别了体细胞SNV和Indel。低频突变则使用Freebayes（v 1.3.2）统计模型进一步评估。注释与过滤：变体使用ANNOVAR进行注释，整合了gnomAD、ClinVar和COSMIC的数据。通过过滤高频群体SNP和评估变异等位基因频率（VAF）来区分生殖系变异与体细胞突变。VAF阈值：克隆事件（如ROS1和ALK）采用≥5%阈值，基因突变（如 EGFR）则采用1%阈值以确保低频变异的检测，这得益于>500倍的高平均测序深度。通过1000基因组计划（1000G）数据和我们实验室建立的健康汉族个体本地基线数据库，将生殖系突变与体细胞突变区分开来。检测到体细胞变异的致病性评估依据AMP/ASCO/CAP框架¹¹进行，该框架通过分层、循证的方法对体细胞变异的证据评分进行了细化。保留致病/可能致病（P/LP）变异，其分类基于一级/二级标准，要求A/B（FDA批准、临床试验）或C/D（临床前/病例研究）证据进行分级。第三层（VUS）缺乏确凿证据，而第四层通过种群频率（如 gnomAD）或功能性研究表示良性变异;这些突变在后续分析中被排除。根据ACMG/AMP指南¹²进行了检测到的生殖系变异的致病性评估。本研究记录了致病性（P）、可能致病性（LP）和不确定显著性（VUS）的变异。仅纳入下游分析中通过质量控制标准的高置信变异（QUAL ≥1;生殖系突变覆盖深度>10，体细胞突变覆盖深度>500倍）

从FFPE组织中制备样本
石蜡切片的制备
用切片机将FFPE组织块切成3微米厚的切片。将切片浮在40–45摄氏度的水浴中，使组织变平。将切片安装在粘贴显微镜载玻片上，并在室温下晾干。将载玻片放入65°C烘干炉烘干1小时，以确保组织切片牢固附着并融化多余的石蜡。

脱石蜡与再水化
将玻片放入染色架，浸泡在透明溶液I中5分钟。依次转移玻片，分别清除溶液II和溶液III，每次5分钟，完全溶解石蜡。将载玻片转移到100%乙醇中3分钟以去除残留的清除试剂。通过分级乙醇系列进行组织切片水化：95%乙醇3分钟，80%乙醇3分钟。用蒸馏水冲洗两次，洗涤间隔3分钟。二甲苯和乙醇在脱烷烃处理过程中，因其挥发性和毒性，需在化学熏风罩中处理。所有含有机溶剂的废弃物溶液均根据机构危险废物处置指南单独收集并处置。

高爆剂染色隔断
血液素和嗜铬染色
脱石蜡和再水化后，将载玻片浸入室温下5–10分钟的血液中。在自来水下滑洗5分钟。将载玻片浸泡在1%盐酸醇中，浸泡数秒（3–10秒）。立即用自来水冲洗。通过将玻片浸入自来水或蓝化溶液5分钟，以获得蓝核。将载玻片浸入伊欧蛋白溶液中，室温下1–3分钟。如有必要，可用蒸馏水短暂冲洗。

脱水与清理
脱水液通过分级乙醇：80%乙醇浸泡1分钟;95%乙醇1分钟，100%乙醇2次1分钟。透明玻片浸泡在二甲苯I–II中，每次2–5分钟。

安装方式
滴上一滴中性香膏。小心放置盖子，避免气泡。在成像前，请让载玻片在室温下晾干。

FFPE组织切片的多重免疫荧光染色
进行了序列多重免疫荧光染色，以检测同一组织切片上的多个免疫和肿瘤标志物。这种方法能够在原 位 可视化多样的细胞群体，同时保持空间上下文¹³。抗原提取：将染色罐装满抗原提取缓冲液。将罐子放入微波炉，以高功率加热3-5分钟，直到溶液开始沸腾。脱石蜡和再水化后，小心将玻片转移到加热的取回缓冲液中，确保组织切片完全浸没。热滑动以低微波功率滑动15分钟，以实现高效的抗原揭膜。加热后，让滑套在室温下自然冷却30分钟。将切片放入冰水中5分钟，以停止抗原提取过程。

洗涤与疏水屏障制备
用蒸馏水冲洗玻片一次，去除残留的取回缓冲液。用疏水屏障笔在每个组织切片周围画一个圆圈。再用蒸馏水短暂滑洗一次。用TBST缓冲液洗两次。每次洗涤后，将滑套水平放置3分钟，以确保缓冲液彻底清除。

阻挡
涂抹阻断缓冲剂，完全覆盖组织切片（每片约100微升）。在室温加湿舱中滑入15分钟。

初级抗体培养
通过轻轻敲击吸水纸的滑套边缘来移除阻挡缓冲剂。针对HLA-DR、CD68、CD163、CD206、PD-L1和PanCK的初代抗体，在优化的工作稀释值下（1：100至1：400）应用。在每个组织切片上涂抹~100微升稀释的原级抗体溶液。在加湿腔中培养载玻片：37°C1小时，或4°C过夜以提高灵敏度。

洗涤
用TBST缓冲液洗3次，每次洗3分钟。每次洗涤后水平放置滑套以便缓冲排水。

二级抗体培养
通过将1：3稀释在TBST缓冲液中制备二级抗体溶液。每张切片上约涂100微升二级抗体溶液。在37°C的湿度下，在加湿舱中滑槽滑动10分钟。用TBST洗3次，每次3分钟。

荧光信号放大
将荧光放大试剂1：100稀释于扩增缓冲液中。在每张载玻片上涂抹100微升稀释试剂。将载玻片在室温下在黑暗中孵育10分钟，以防止光漂白。用TBST洗3次，每次3分钟。

标记间的抗原检索
按照描述进行微波抗原回收。加热后，冷却依次滑动：5分钟在温水中，5分钟在冰水中。

对额外标记的顺序染色
每增加一个抗体标志物，重复一次和次级抗体的潜伏步骤。确保在染色每个标记后进行抗原提取，然后再进行下一个抗体。

核对染
用TBST缓冲液洗一次载玻片。涂抹DAPI核染色剂。在室温下黑暗孵育5分钟。用蒸馏水洗三次滑套。终点判定：细胞核在荧光显微镜下应明显染色。

最终标记仅染色
将生物素溶液稀释1：200放入扩增缓冲液中，室温培养10分钟。用TBST缓冲液洗3次。按照描述进行抗原提取。用TBST缓冲液洗3次。涂抹内源性生物素阻断试剂，在37°C下培养30分钟。在TBST中以1：100比例涂抹染色染料，并在室温下黑暗中孵育30分钟。用TBST洗一次，然后放水3分钟。

安装方式
在组织切片上滴一滴防褪入装填介质。小心地将盖片覆盖在滑梯上。切片干燥后再进行成像。

H&E和mIF切面的图像采集
使用载玻片扫描仪拍摄了H&E染色及mIF FFPE组织切片的全片切片（WSI）。H&E切片采用明场扫描，mIF切片则采用荧光扫描。目标：20倍放大以进行概览扫描;40倍放大，用于高分辨率区域成像。激发和发射设置：根据制造商规格针对每种荧光团进行优化。曝光时间和增益：由成像软件自动调整，以确保信号强度充足且不饱和。

mIF质量控制与图像可评估性
为确保mIF结果的可靠性，在组织分类和细胞定量前，采用HALO数字病理系统实施了严格的质量控制协议。伪影去除及评估区定义：对整片图像（WSI）进行了细致审查，人工排除含有组织褶皱、染色伪影及非特异性背景信号的区域。这一步骤对于防止误报信号和确保空间分析的准确性至关重要。筛选后，所有样本中平均80%的组织区域（范围：50%–95%）被指定为可评估的mIF区域。病理验证与划分：为准确划分肿瘤和基质区室，mIF切片与相邻的H&E染色序列切片交叉比对。两位经验丰富的病理学家独立审查注释，任何差异均通过共识解决。肿瘤组织面积小于30%的样本被排除在研究之外，以保持分析严格性。定量后验证：在自动细胞表型和定量后，病理学家重新评估了免疫细胞亚群的空间分布和表达模式。该综述确保数字定量数据与其基础的组织形态特征一致，从而保证了研究结果的可靠性和准确性。

数字病理分析与区域注释
全景扫描图像被导入数字病理图像分析平台进行处理。使用HALO AI核分离插件进行细胞分割和识别。以H&E染色为参考，人工注释了以下关注区域（ROI）：全肿瘤区（WSIT）;肿瘤边界（TB）;肿瘤核心（TC）。正信号检测基于荧光强度阈值和每个标记的预期亚细胞定位。采用该区室特异性方法以减少背景干扰并提高免疫细胞识别的准确性。免疫细胞密度被量化为每个特定肿瘤区域的标志性细胞数量。根据组织形态，将mIF图像与对应的H&E衍生注释对齐。根据每个标志物的免疫细胞密度中位数，患者被分层为高密度组和低密度组。

统计分析
分析使用SPSS 17.0软件。正态分布数据以均值±标准差表示，非正态分布定量数据以中位数（25%-75%分位数区间）表示。通过Cox比例风险回归模型，使用蟒蛇生命线模型分析了每种基因突变类型、免疫细胞密度与临床特征之间的相关性。根据样本量及数据是否符合正态分布，连续变量间使用学生检验或曼-惠特尼U检验进行比较。使用Wilcoxon带符号秩检验比较秩变量。根据样本量和理论频率，选择卡方检验或费舍尔精确检验来分析无序的类别变量。相关分析使用了斯皮尔曼检验或皮尔逊检验。患者总体生存率通过Kaplan-Meier方法获得，测试采用对数等级检验。生存曲线是基于RStudio软件的R语言绘制的。P值<0.10被认为具有统计学显著性。

实际适用性与局限性
为了可靠实施这一集成工作流程，FFPE组织块必须符合严格的质量标准，包括理想肿瘤细胞浓度≥30%，且无广泛坏死或显著组织伪影。mIF的技术成功高度依赖于组织保存;过度固定、过度损伤或高背景自体荧光等因素可能导致抗体穿透不足和信号强度不佳。此外，还应考虑本研究的若干固有局限性。首先，分析基于回顾性单中心队列，共63名患者，这可能限制了统计学效度和发现对其他人群的广泛推广性。其次，评估范围仅限于固定的37基因NGS面板和一组特定的免疫标志物（HLA-DR、CD68、CD163、CD206、PD-L1和PanCK; 补充表1）。如资料所述，虽然这种综合方法为预后分层提供了更稳健的框架，但需要更大规模的前瞻性多中心研究以进一步验证这些关联并优化已识别生物标志物的预测效用。

结果

肺腺癌患者的临床特征
本研究共收集了63名2015年至2021年间在本院接受手术的LUAD患者，并符合纳入标准。纳入患者的临床特征见表1。在纳入患者的中位年龄为60岁（47-73岁），其中男性患者30/63人（46.2%）和女性患者33/63人（53.8%）。有23人（63人）有吸烟史（35.4%）。所有纳入患者的病理类型均为LUAD。根据美国癌症联合委员会^第14版TNM分期标准第8版。其中27例（63例）（41.5%）为IB期，3例/63例（4.6%）为IIA期，10例/63例（15.4%）为IIB期，15例/63例（23.1%）IIIA期，2例/63例（3.1%）IIIB期，8例/63例（12.3%）IV期。转移部位包括：9/63例骨转移，8/63例双侧肺转移，6例脑转移，5/63例纵隔转移，4/63例腹壁/胸壁转移，2/63例肝转移。63名患者中有24名患者在手术后出现肿瘤复发或转移，其中17人（63人）死亡。

讨论

LUAD的综合基因组和空间分辨免疫学谱
本研究展示了结合靶向 NGS 和 mIF 的综合工作流程，以表征 LUAD 的多维景观。我们的基因组学发现与以往文献一致，尤其是在突变频率的族群差异方面。观察到的EGFR突变率（约40%-60%）与亚洲人群报告的频率一致，显著高于西方队列（15-20%）15,16,17,18,19,20。此外，PMS2和EPCAM中生殖系突变的检测表明该人群中可能存在遗传易感因子，值得进一步研究遗传风险。通过将基因组数据与空间分辨的免疫分析整合，我们发现E...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AlphaTSA 多路复用 IHC 套件	alphaxbio科技有限公司	AXT36025011	多重免疫荧光染色
防褪色安装介质	利根科技有限公司	IH0252，Lot0525A17	多重免疫荧光染色
CD163	北京中山金桥生物技术有限公司	ZM0428	RRID：AB_3714707;多重免疫荧光染色
CD206	阿布康公司	猫#5307-1	RRID：AB_10896526;多重免疫荧光染色
CD68	北京中山金桥生物技术有限公司	ZM0060	RRID：AB_2904190;多重免疫荧光染色
定制癌症基因面板	TWIST有限公司		NGS图书馆准备
脱石蜡化 Buffe	奇根有限公司	19093	DNA提取HE染色;FFPE组织切片的多重免疫荧光染色
Dynabead M-270 streptavidin	Thermo有限公司	65602	NGS图书馆准备
荧光仪	ThermoFisher科学有限公司	量子比特4.0	NGS图书馆准备
HALO数字病理图像分析平台	Indica Labs， Inc.，阿尔伯克基	版本 3.6.4134	HE染色与多重免疫荧光染色分析
血液素-嗜红染色套件	武汉实验室科学技术有限公司	E-IR-R117	HE染色
HiPure FFPE DNA 套件	广州魔源生物技术有限公司	D6323	从FFPE组织切片中提取DNA
HLA-DR	华碧有限公司	ET1610-66	RRID：AB_3069950;多重免疫荧光染色
Illumina DNA 测序仪	光明会，nbsp;公司	550DX	测序
中性香脂	北京太阳生物科学与科技有限公司	G8590	HE染色
Panck	北京中山金桥生物技术有限公司	ZM0069	RRID：AB_2941997;多重免疫荧光染色
PD-L1	研发系统	目录 # AF1019	RRID：AB_354540;多重免疫荧光染色
TBST 缓冲区	abclonla科技有限公司。	RM00013	HE染色与多重免疫荧光染色
UN-Blocker	Homgen有限公司		NGS图书馆准备
VAHTS DNA 清洁珠子及nbsp;	Vazyme有限公司	N411	NGS图书馆准备
VAHTS单向DNA库Illumina准备套件	Vazyme有限公司	ND610	NGS图书馆准备
全片成像系统	蔡司有限公司	蔡司AXIOSCAN 7版本3.3	HE染色与多重免疫荧光染色分析
xGen杂交与洗涤套件	IDT有限公司	1080577	NGS图书馆准备