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方法文章

检测RNA整体N6-甲基腺苷修饰水平的点杂交实验

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DOI：

10.3791/69860

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2026年2月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用点杂交法对整体m⁶A水平进行半定量检测的实验方案。首先提取总RNA，经变性后点样于尼龙膜上，使用抗m⁶A抗体进行杂交，再通过化学发光法显影。利用ImageJ软件进行灰度分析，量化信号强度，从而反映相对甲基化水平，为相关研究提供一种可重复的实验流程。

摘要

N6-甲基腺苷（m⁶A）是真核生物信使RNA（mRNA）中最丰富的内部修饰，作为转录后基因表达的关键调控因子。针对m⁶A的研究方法可在多个分辨率水平上应用，包括整体定量、特异性核苷酸检测以及特定目标转录本的分析。其中，点杂交（dot blot）检测法为全局m⁶A修饰水平的半定量评估提供了一种简便、快速且经济有效的方法。在该实验中，首先处理细胞以提取总RNA，随后对RNA进行稀释和变性。将RNA样品点样至尼龙膜上，用抗m⁶A抗体进行杂交，并通过化学发光法显影，信号强度反映甲基化修饰的相对丰度。最后，使用ImageJ软件测量灰度值，对信号强度进行定量和比较。与测序或质谱分析等方法相比，点杂交所需的仪器设备和专业技术要求较低，因此特别适用于常规筛选、初步功能研究以及比较分析。本实验方案提供了在基础研究和转化应用中实施m⁶A点杂交检测的详细且可重复的操作流程。

引言

N6-甲基腺苷（m⁶A）是真核生物信使RNA（mRNA）中最常见的内部修饰，其在转录后调控中发挥关键作用，包括RNA稳定性、剪接、降解、翻译和出核运输1,2,3。m⁶A修饰的失调已被证实参与多种生理和病理过程，包括肿瘤的发生、进展和转移4,5。在骨肉瘤中，细胞系和组织样本中均观察到m⁶A水平升高，提示异常的RNA甲基化在该疾病生物学中具有重要作用6,7。因此，系统评估骨肉瘤相关转录本及调控通路中全局m⁶A丰度及其变化，对于阐明RNA甲基化在骨肉瘤中的生物学机制和临床意义至关重要。

目前有多种分析方法可用于研究m⁶A修饰8,9。液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）10和基于酶联免疫吸附试验（ELISA）的检测方法11均可用于测定整体m⁶A水平。前者具有高灵敏度，但需要专门的设备和技术 expertise；而后者仅能提供相对m6A水平，且成本高于点杂交检测。MeRIP-qPCR可用于特定转录本的靶向评估，但其结果受免疫沉淀效率影响较大12。MeRIP-seq13、m⁶A-seq14和m⁶A-SAC-seq15是基于测序的技术，能够精确定位m⁶A甲基化位点；然而，这些方法成本较高，且需要进行大量的生物信息学分析。

m⁶A 点印迹实验为检测RNA中的全局m⁶A修饰水平提供了一种简单、快速且经济有效的方法。作为一种半定量免疫检测技术，其主要优势在于无需专用设备或复杂的生物信息学分析，即可获得m⁶A丰度的整体情况。这使得m⁶A点印迹实验成为常规筛选、初步功能验证和临床研究中的有力工具，也可作为高通量测序和质谱分析等先进方法的实用补充。本实验方案提供了详细的分步操作流程，确保检测结果的可重复性和广泛适用性。

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方案

注意：本实验方案分为三个部分：RNA 制备、点印迹分析和定量。 材料表 汇总了所需的材料，补充表 1 详细列出了试剂配方，图 1 展示了实验流程。

1. RNA 提取

  1. 细胞准备
    1. 从 37 °C 培养箱中取出稳定敲低 SNHG21 的 143B 细胞（shSNHG21）、阴性对照细胞（shCtrl）以及用 3-脱氮腺苷（3-DAA；[100 µM，24 h]）和甲氯芬那酸（MA；[100 µM，24 h]）处理的细胞。
    2. 在显微镜下确认细胞融合度约为 80–90%，且细胞状态良好。
    3. 吸除培养基，然后用 1 mL PBS 洗涤细胞两次。
    4. 吸除 PBS，每 6 cm 培养皿加入 1 mL 胰蛋白酶溶液。
    5. 轻轻晃动以使胰蛋白酶均匀分布，孵育 1 分钟。
    6. 吸除胰蛋白酶，加入含 10% FBS 的 1 mL 培养基以终止消化。
    7. 反复吹打数次，使细胞充分悬浮分散。
    8. 将细胞悬液转移至 1.5 mL 无 RNase 的微量离心管中。
      注意：使用前请标记试管。步骤 1.1.3 至 1.1.8 必须在无菌条件下操作。
    9. 以 1000 × g 离心 3 分钟，然后完全吸除上清液。
  2. RNA 提取
    注意：RNA 提取使用 EZ-press RNA 纯化试剂盒。
    1. 向细胞沉淀中加入 600 µL 裂解缓冲液（RNA 纯化试剂盒提供），充分涡旋以彻底裂解细胞，室温静置 5 分钟。
      注意：RNA 分离约使用 2 × 106 个细胞。
    2. 加入等体积的 100% 乙醇，充分涡旋混匀。
    3. 将 600 µL 混合液加入已装配至收集管的离心柱中。
      注意：使用前请组装离心柱与收集管，并标记收集管。
    4. 以 12,000 × g 离心 1 分钟，弃去收集管中的液体。
      注意：避免离心柱底部接触液体或操作者。
    5. 对剩余混合液重复步骤 1.2.3–1.2.4。
    6. 向每个离心柱中加入 500 µL 洗涤缓冲液（RNA 纯化试剂盒提供），室温静置 1 分钟。
    7. 以 12,000 × g 离心 1 分钟，弃去收集管中的液体。
    8. 将空柱再次以 12,000 × g 离心 1 分钟，以去除残留液体。
    9. 将离心柱转移至新的 1.5 mL 无 RNase 离心管中，打开管盖，室温晾干 2 分钟。
      注意：使用前请标记离心管。
    10. 向离心柱膜中央加入 25–50 µL 洗脱缓冲液（无酶水）。
    11. 室温孵育 2 分钟。
    12. 以 12,000 × g 离心 1 分钟，洗脱 RNA。
    13. 弃去离心柱，将 RNA 置于冰上。
      注意：RNA 可于 -80 °C 保存至使用。
  3. RNA 稀释
    1. 使用 DS-11 分光光度计测定 143B shSNHG21 细胞、143B shCtrl 细胞以及经 3-DAA 和 MA 处理的细胞的 RNA 浓度。
    2. 从每种细胞系中准备 1 µg 总 RNA。
    3. 用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水将 RNA 连续稀释至 400 ng、200 ng 和 100 ng。
      注意：可根据需要调整浓度梯度。
  4. RNA 变性
    1. 将稀释后的 RNA 样品在 95 °C 加热 3 分钟。
    2. 立即转移至冰上冷却。
      注意：变性后的 RNA 可在 4 °C 保存最多 1 周。

2. 点印迹

  1. RNA点样
    1. 将带正电荷的尼龙膜裁剪至所需尺寸。
    2. 在膜上绘制参考线，并用样本名称进行标记。
    3. 通过轻柔涡旋振荡或移液操作充分混匀RNA。
    4. 将每种RNA样本1–2 µL点样至膜上的指定位置。
      注意：始终使用无RNase的移液器吸头。避免移液器吸头直接接触膜表面。让RNA在膜上自然扩散。每个样本使用新的吸头。每点体积不得超过2 µL，以防扩散不规则。
  2. RNA交联
    1. 将膜在空气中干燥3分钟。
    2. 使用紫外交联仪在254 nm波长、120 mJ/cm²剂量下对膜进行RNA交联。
      注意：也可选择将膜在37 °C孵育30分钟作为替代方法。
    3. 在摇床上用10 mL 1× TBST洗涤膜5分钟，以去除未结合的RNA。
  3. 膜封闭
    1. 配制5% BSA溶液。
      注意：使用前新鲜配制该溶液。
    2. 将膜在封闭液中室温孵育2小时。
  4. 抗体孵育
    1. 将膜与抗-m⁶A抗体在4 °C孵育过夜。
      注意：使用前用5% BSA溶液按1:1000比例稀释抗体。将膜置于摇床上，轻柔振荡（50 rpm）孵育。
    2. 在摇床上用10 mL 1× TBST洗涤膜三次，每次10分钟。
    3. 将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗在室温孵育1小时。
      注意：使用前用5% BSA溶液按1:1000比例稀释抗体。
    4. 在摇床上用10 mL 1× TBST洗涤膜三次，每次10分钟。
  5. 化学发光检测
    1. 将化学发光HRP底物均匀地逐滴加至膜表面。
      注意：在室温下轻轻摇动孵育1分钟。
    2. 使用化学发光成像系统检测信号。
    3. 在化学发光成像系统中使用自动曝光功能进行初始预扫描。
      注意：仅当最亮信号饱和度低于65%时接受自动曝光时间；否则将曝光时间减半并重新采集，直至峰值信号落在30–60%范围内。
  6. 亚甲蓝（MB）染色
    1. 将膜在MB染色液中孵育1分钟。
    2. 在摇床上用10 mL 1× TBST洗涤膜三次，每次5分钟，然后成像作为上样对照。
      注意：使用同一张用于化学发光检测的膜进行染色。避免扰动染色液中的沉淀。由于亚甲蓝难以清除，操作时应穿戴防护服和口罩。
    3. 成像后，在摇床上用含1% SDS的溶液对MB染色的膜进行脱色处理15分钟，以便后续记录或可能的重新探针检测。

3. 定量分析

  1. 灰度值测量
    1. 将图像导入 ImageJ 软件。
    2. 使用 Image > Type > 8-bit 将图像转换为 8 位格式。
    3. 通过 Process > Subtract Background 去除背景。
      注：半径设为 50.0 像素，勾选 Light background。
    4. 使用 Rectangle 工具选择分析区域。
    5. 依次定义泳道：Analyze > Gels > Select First Lane。
    6. 使用 Analyze > Gels > Plot Lanes 生成强度分布图并测量峰面积。
    7. 分别测量 m⁶A 和 MB 的灰度值。
  2. 将数据复制到表格中进行分析。
  3. 比较信号强度以评估整体 m⁶A 修饰水平。

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结果

为严格验证点印迹杂交法的性能，并探究 SNHG21 在调控全局 m6A 水平中的作用，对 143B 细胞进行了药理学干预处理，以抑制或增强 m6A 甲基化，并在两个方向上监测 m6A 的丰度。

点印迹法定量检测整体 m6A 水平
我们首先评估了该检测方法在抑制 m6A 甲基化后检测 m6A 水平降低的能力（图 2）。如 图 2A 所示，使用甲基转移酶抑制剂 3-DAA（100 µM，24 小时）处理后，整体 m6A 信号显著降低。单独敲低 SNHG21 即可引起基础 m6A 水平的类似程度下降，而在 shSNHG21 细胞中追加 3-DAA 处理后，信号进一步减弱。这些结果表明，该检测方法能够可靠地检测整体 m6A 水平的逐步降低（

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讨论

本研究中，在成骨肉瘤143B细胞中敲低SNHG21导致m⁶A信号强度降低，表明该检测方法在评估基因修饰是否影响RNA甲基化方面具有重要价值。此外，该检测方法还可用于多种应用，包括：1）功能研究与机制验证：可用于快速初步筛选，以确定整体m⁶A水平是否与特定生物学过程（如细胞分化、应激反应或肿瘤进展）相关16；也可用于评估m⁶A调控因子（“书写蛋白”、“擦除蛋白”和“阅读蛋白”）的功能作用，通过检测其调控是否引起整体甲基化丰度的可测量变化来实现17,18。2）特定RNA群体的分析：该方法能够检测定义RNA亚群（如mRNA、lncRNA或rRNA）中的m⁶A富集情况，从而揭示不同RNA类别特异性的甲基化模式19。3）临床与转化应用：为临床样本中整体m⁶A水平的比较提供了实用方法，例如肿瘤组织与相邻正常组织之间的比较，有助于生物标志物的开发及疾病关联研究20。4）作为高分辨率技术的补充：...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作获得了国家自然科学基金（82174408、82374477 和 82474535）资助。图1使用BioRender.com制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3-脱氮腺苷 (3-DAA)MCEHY-W013332A1 mg
抗 m6A 单克隆抗体Proteintech68055-1-Ig50 μL
牛血清白蛋白 (BSA, 第五组分)BioFroxx4240GR100 100 g
ChemiDoc MP 成像系统BIO RAD12003154
DMEM 高糖培养基WISENT319-005-CL500 mL
DS-11 分光光度计DeNOVIXDS-11
EZ-press RNA 提取纯化试剂盒EZB B0004DP100 次
优质胎牛血清 (FBS)WISENT086-150500 mL
HRP 标记山羊抗小鼠 IgG (H+L)BeyotimeA02161 mL
Immobilon Western 化学发光 HRP 底物 MilliporeWBKLS05002 × 250 mL
甲氯芬那酸 (MA)MCEHY-1172751 mg
亚甲蓝染色液SolarbioG13000.1%，100 mL
尼龙转印膜LABSELECTTM-NY-XS-457.4 × 8.5 cm，0.45 μm，10 片/袋
PBS 缓冲液（即用型干粉）biosharpBL601ApH: 7.2–7.4，2 L/袋
十二烷基硫酸钠 (SDS)SigmaL5750-500G500 g
TBS 缓冲液预混干粉Sangon A510025-00011 个（243.9 g 粉末）
TrypLE Express 酶Gibco12604-0211×，500 mL
吐温-20 (Tween-20)SangonA600560-0500500 mL
紫外交联仪UVPCL-1000

参考文献

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