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方法文章

由肾脏缺血/再灌注损伤诱导的小鼠急性至慢性肾病转化模型

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DOI：

10.3791/69866

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2026年2月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of Pittsburgh Medical Center Children's Hospital of Pittsburgh (UPMC CHP), University of Pittsburgh

本文内容

摘要

本文介绍了一种缺血性慢性肾病模型，该模型采用单侧肾缺血再灌注损伤，并在样本采集前一日进行对侧肾切除术；该方案可在28天和42天时实现基于血清的功能评估，具有高存活率和可重复的慢性肾病病理特征，为机制研究和干预研究提供了多功能平台。

摘要

通过手术短暂阻断肾蒂可诱导肾缺血-再灌注损伤（IRI），这是研究小鼠急性肾损伤（AKI）向慢性肾病（CKD）进展的常用模型。然而， 传统方案通常无法进行基于血清的功能评估，或导致较高的死亡率。尽管现有的单侧和双侧肾IRI模型强调可重复性，但在实现稳定的损伤程度和适合研究CKD进展的长期存活率方面仍存在挑战。本文介绍一种背侧入路方案，可建立稳定且可重复的缺血性AKI向CKD转化的动物模型。背侧入路便于直接暴露肾脏，并最大限度减少腹腔内操作。我们采用单侧肾IRI结合对侧肾切除术，后者在采集血液和组织样本前1天进行。该方法具有两个主要优势：（1）通过避免双侧损伤带来的不一致性，显著减少个体间变异；（2）在维持稳定损伤的同时实现接近100%的存活率，相比之下，早期进行肾切除的方案通常伴随更高的死亡率。功能评估通过检测血清尿素氮（BUN）和肌酐水平进行，间质纤维化则在肾IRI后28天和42天通过Masson三色染色法评估胶原沉积以及CKD标志物基因表达水平进行量化。上述指标共同提供了关于肾功能损害及组织病理变化发展的互补性信息。本方案建立了一种可靠且多功能的小鼠缺血性CKD模型，适用于机制性研究。

引言

急性肾损伤（AKI）是住院患者中常见的并发症，仍然是一个重大的全球健康问题。流行病学研究表明，AKI在住院患者中的发生率高达20%，在重症患者中的发生率为30%-60%1,2。尽管部分患者肾功能可恢复，但另一些患者则表现为不完全恢复，从而易进展为慢性肾病（CKD）3。AKI向CKD的转变 increasingly 被认为是决定长期预后的重要因素，并已成为机制研究和治疗研究的重点4,5,6。为了研究其潜在的分子机制并测试可能的治疗方法，可重复的动物模型至关重要。

手术性短暂阻断肾蒂（动脉和静脉）可诱导肾缺血-再灌注损伤（IRI），这是研究小鼠急性肾损伤（AKI）最常用的模型之一。该操作可导致急性肾小管上皮细胞损伤及炎症反应，进而可能发展为慢性间质性纤维化7,8。然而，传统的肾IRI实验方案存在若干挑战。单侧肾IRI模型死亡率极低，广泛用于长期研究9；但无法评估肾功能（如血清生化指标、尿液分析或肾小球滤过率）。双侧肾IRI模型，或单侧肾IRI联合同时或早期对侧肾切除的模型，虽可用于功能评估，但死亡率较高，限制了其在慢性研究中的应用。尽管近期已有对这些模型的优化变体被报道10，但在慢性研究中的应用仍需谨慎评估。此外，部分实验方案采用腹正中切口开腹术，需移动腹腔内器官以暴露肾蒂，从而增加了手术创伤性和技术难度。Skrypnyk等报道，在单侧缺血8天后实施对侧肾切除，可在维持高存活率的同时实现损伤后肾功能的血清学评估11。本方案提供了一套系统化的操作流程，优化用于评估AKI向慢性肾病（CKD）进展的过程，观察期可长达42天。

本研究展示了一种利用单侧肾缺血再灌注损伤（IRI）建立缺血性急性肾损伤-慢性肾病（AKI-CKD）模型的方法，并在采集肾脏和血液样本前1天进行延迟性对侧肾切除术。我们此前已在多项研究中采用过类似方法作为急性肾损伤（AKI）模型12,13,14,15。我们已成功将该方法拓展用于研究AKI向CKD的转归过程，在术后第28天和第42天时，已可观察到明显的慢性肾病（CKD）征象（示意图见图1）。该方法具有良好的动物存活率，可在受损肾脏中诱导出显著的纤维化表型，并可通过采集的血液样本评估肾功能。因此，该方法特别适用于需要血清学检测的研究（相较于仅行单侧肾IRI模型），且具有较优的存活率（相较于双侧肾IRI模型）。手术采用背部侧腰部入路直接暴露肾脏。与腹正中切口开腹术相比，该入路可最大限度减少腹腔内组织的干扰，将手术操作局限于肾脏及肾门周围组织，从而提高手术操作的一致性。

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方案

本研究中进行的动物实验均经匹兹堡大学机构动物照护与使用委员会（IACUC；方案编号 23103811）批准，并遵循机构指南。可根据需要设置假手术对照组，通常仅进行手术暴露，但不实施血管夹闭或对侧肾切除术。有关所用工具和设备的详细信息，请参见材料部分。锐器（包括针头、手术刀片和夹子）必须丢弃于指定的锐器容器中。生物废弃物（包括组织和尸体）必须按照机构生物危害废弃物处理规程进行处理和处置。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 动物准备与手术设置

  1. 使用前对所有手术器械进行高压灭菌。对多只动物进行手术时，每次操作间应清除器械上的血液和碎屑，然后使用高温珠灭菌器灭菌10-15秒。待器械冷却后再重复使用。
  2. 设置一个循环水加热垫，并在手术区域上方放置红外灯。
  3. 将小鼠放入麻醉诱导室，使用异氟烷（1.5%–2% 氧气混合，流速 1–2 L/min）诱导麻醉（遵循机构批准的实验方案）。当小鼠意识丧失后，通过夹捏脚趾确认反射消失，以验证麻醉深度。
  4. 将小鼠转移至加热的手术垫上，并维持麻醉状态 通过 鼻锥
  5. 术后镇痛给予 Ethiqa XR（缓释型丁丙诺啡；3.25 mg/kg，皮下注射）。
  6. 将小鼠俯卧位放置于手术垫上。必要时用胶带固定四肢以减少移动。
  7. 使用电推剪剃除预定切口部位周围的背部毛发。
  8. 手术过程中在眼睛上涂抹眼膏以防止干燥。
  9. 插入直肠探针，用胶带固定，并连接至体温计以进行持续监测。
  10. 用10%聚维酮碘和70%乙醇交替消毒手术区域，然后用无菌巾覆盖该区域。

2. 单侧肾缺血再灌注损伤

  1. 在肾脏水平处做一条3-4 cm的背侧正中皮肤切口。
  2. 使用组织分离剪将皮肤与皮下组织层分离。
  3. 通过皮肤触诊确定肾脏位置。
  4. 在左侧脊柱旁约1 cm处、可见肾脏水平的位置，做一条1-1.5 cm的纵向肌肉切口。
    注意：若切口过长，肾脏可能滑回腹腔，增加后续操作难度。较小的皮肤切口有助于保持肾脏外置。
  5. 通过背侧切口轻柔地将肾脏外置。若存在薄膜阻碍进入，可进行钝性分离。
  6. 使用无齿镊固定肾脏，钝性分离肾门上下方血管蒂周围的脂肪和结缔组织，以形成一个"通道"，便于放置血管夹。
  7. 在诱导缺血前，确认核心体温足够温暖（36.8-37.2 °C）。将无创性血管夹夹闭肾动脉和肾静脉主干。
    注意：确保血管位于血管夹钳口中央，并施加均匀压力。在肾门处以固定位置夹闭，血管夹方向应与血管轴线垂直。此类型血管夹可重复使用约10次动物实验。
  8. 牵拉皮肤覆盖肾脏，使其尽可能接近核心体温。
  9. 在缺血期间，通过将循环水加热垫设置为38-39 °C（根据需要调整）并间歇开启或关闭红外灯（根据需要调节灯距），维持核心体温在36.8-37.2 °C。
    注意：该"三明治"加热系统，由循环水加热垫和红外灯组成，可有效将核心体温维持在36.8-37.2 °C的狭窄范围内。每分钟记录一次核心体温，确保其稳定在36.8-37.2 °C。
  10. 缺血30分钟后，移除血管夹，并用棉签将肾脏复位于腹腔内。
    注意：去夹前应确认整个肾脏呈均匀苍白。去除血管夹后，确认再灌注成功。若再灌注明显延迟（如30秒或更长），可能提示再灌注不完全，应考虑将该动物排除在后续分析之外。肾缺血再灌注损伤（IRI）的易感性及后续慢性肾病（CKD）的严重程度受年龄、性别和背景品系的显著影响。每项研究设计均应进行预实验，以确定最佳缺血时间。
  11. 使用5-0可吸收缝线缝合肌肉层，随后使用伤口夹（例如9 mm）闭合皮肤。
    注意：术后10天拆除伤口夹。
  12. 停止异氟烷麻醉，让小鼠在清洁笼具中恢复。若动物已从麻醉中苏醒，且无痛苦或低体温迹象，可将笼具移回动物饲养室。术后需监测动物是否出现疼痛或不适，必要时追加Ethiqa XR剂量。根据机构IACUC指南设定人道终点，以最大程度减少动物痛苦。
    注意：Ethiqa XR可提供长达3天的镇痛作用。若动物在首次给药72小时后出现任何疼痛或不适迹象，应追加给药。

3. 对侧肾切除术

  1. 执行步骤1中的动物准备操作。
  2. 按照步骤2.1和2.2所述进行皮肤切口。
  3. 在右侧肾脏可见水平，约脊柱右侧1 cm处，做一长度为1-1.5 cm的纵行肌肉切口。
  4. 用无齿镊夹持肾脏，钝性分离肾门周围脂肪和结缔组织，以暴露肾蒂。
  5. 小心将肾上腺从肾脏分离，保持肾上腺完整，并避免损伤其血管。
  6. 使用结扎夹（夹子尺寸：小型）和4-0丝线结扎肾蒂，然后在肾脏侧切断血管；随后切断输尿管并移除肾脏。
  7. 按照步骤2.11所述关闭切口。

4. 血液和肾组织的采集

  1. 使用异氟烷（1.5%-2% 氧气混合，流速 1-2 L/min）对小鼠进行麻醉，并通过夹趾反应确认麻醉深度，以验证反射消失。
  2. 将小鼠置于仰卧位，沿中线做切口并移除膈肌。
  3. 小心暴露心脏，将连接于 3 mL 注射器的 23 号针头插入左心室。
  4. 缓慢采血（600-1,000 µL）。
  5. 拔出针头以防止溶血，并将血液转移至收集管中。
  6. 切除左肾，并根据研究要求使用手术刀片（安装在刀柄上）对组织进行切片。
  7. 在麻醉状态下摘除心脏，实施安乐死（遵循机构批准的方案）。
  8. 根据研究要求处理切下的组织（如固定、速冻）。

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结果

手术过程中观察到的肾脏颜色特征性变化证实了均匀性肾缺血的成功诱导以及随后的有效再灌注。成功的缺血表现为肾脏颜色由黑色变为深紫色，在移除血管夹后颜色随之改善，从而证实了再灌注的实现。若肾缺血未能成功诱导，则肾脏仅表现出轻微的颜色变化，后续损伤可能不一致。本研究中，FVB/NJ雄性小鼠经受30分钟肾缺血后进行再灌注，以诱导肾脏损伤。代表性结果见图2。血清样本由堪萨斯州立大学兽医诊断实验室进行肾功能谱分析，包括血尿素氮（BUN）和肌酐的检测。Masson三色染色的肾脏切片通过ImageJ软件进行成像分析，以评估间质胶原沉积。关于Acta2和Col1a1的实时定量qPCR分析，请参见我们此前发表的研究16。

低倍镜图像显示，在肾缺血再灌注损伤（IRI）后28天和42天，肾脏切片呈现进行性萎缩（图2A）。肾IRI后第28天和第42天，Masson三色染色的肾组织显示肾皮质和髓质中广泛存在间质...

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讨论

该方案提供了一种可重复的由肾缺血-再灌注损伤（IRI）诱导的急性肾损伤（AKI）向慢性肾病（CKD）转变的模型，其特征为持续性肾功能障碍和进行性间质性纤维化，这两者被广泛认为是慢性肾病（CKD）的典型标志17,18单侧输尿管梗阻（UUO）是一种广泛应用的慢性肾病模型，可诱导梗阻性肾病，并主要导致纤维化 通过 持续性管状阻塞18,19肾缺血-再灌注可导致肾小管上皮细胞损伤与血管内皮/微血管功能障碍并存，这是缺血性急性肾损伤及其向慢性肾病进展的关键机制6,20UUO 会引发持续性的梗阻性损伤，而我们的缺血性 CKD 模型则是短暂的。因此，缺血性 CKD 模型更适用于针对缺血应激及急性肾损伤向慢性肾病（AKI-to-CKD）转变的研究。此外，UUO 是一种快速进展的 CKD 模...

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致谢

本工作得到了NIDDK K01-DK133635、UPMC VMI P3HVB奖项、Samuel和Emma Winters基金会奖项、UPMC CHP RAC启动资助、UPMC CHP基金会儿童信托资助者奖项、George M. O'Brien肾脏资源联盟机会池项目（OKRA OPP）（资助TC）、NIDDK R01-DK121758、DK134346、R25-DK119180（资助SSL）、NIDDK R01-DK125015、R01-DK137410（资助JH）以及Carolyn和Mark Snyder与Snyder家族（资助JH和SSL）的支持。我们感谢UPMC CHP组织学核心实验室在组织学和扫描成像方面的协助，以及堪萨斯州立大学兽医诊断实验室在血清化学分析方面的支持。 

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
麻醉气体过滤器A.M. Bickford F-AIR
麻醉诱导舱（带加热功能）AIMS Lab ProductsWCS8
血液采集管BD Microtainer365967
乙醇Decon Labs2701
乙替卡 XR（缓释型丁丙诺啡）Fidelis Animal HealthNDC 86084-100-30
眼膏AKORNNDC 17478-062-35
无菌纱布垫 Dynarex3353
小型动物用毛发剪WAHLCLP-9868
红外加热灯Physitemp InstrumentsHL-1
用于温水循环的热泵BrainTree ScientificHTP-1500
小型动物用加热/麻醉系统，Versaflex BrainTree ScientificEZ-7150
保温型手术单Braintree ScientificSPDR-MPS
微珠灭菌器Simon KellerSteri 250
异氟烷溶液Covetrus29405
结扎夹施夹器WECK533140
结扎夹WECK533837
直肠温度用微探针 PhysitempRET-3
微探针温度计PhysitempBAT-12
光学显微镜LeicaDM2500
切片扫描显微镜LeicaAperio CS2 slide scanner
小鼠（FVB/NJ）Jackson Laboratory001800
针头（23G）BD305145
聚维酮碘棉签棒 Dynarex1201
手术刀片Fine Science Tools10020-00
手术刀柄Fine Science Tools10060-13
无齿手术镊Roboz Surgical InstrumentRS-5228
有齿手术镊Fine Science Tools11051-10
带齿手术镊Fine Science Tools11019-12
外科手套CTISPGF750
组织分离剪Fine Science Tools14072-10
缝合线，聚乙醇酸（PGA）/可吸收 （5-0）Dynarex9131
缝合线，丝线（4-0）OasisMV-683-V
注射器（3ml）BD309628
无菌毛巾单 Dynarex4410
血管夹施夹钳Fine Science Tools15057-14
无创血管夹 Fine Science Tools 18055-03
伤口缝合钉施加器Fine Science Tools12020-09
伤口缝合钉Fine Science Tools12022-09

参考文献

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