本文介绍了一种缺血性慢性肾病模型，该模型采用单侧肾缺血再灌注损伤，并在样本采集前一日进行对侧肾切除术；该方案可在28天和42天时实现基于血清的功能评估，具有高存活率和可重复的慢性肾病病理特征，为机制研究和干预研究提供了多功能平台。
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本文内容
摘要
摘要
通过手术短暂阻断肾蒂可诱导肾缺血-再灌注损伤（IRI），这是研究小鼠急性肾损伤（AKI）向慢性肾病（CKD）进展的常用模型。然而， 传统方案通常无法进行基于血清的功能评估，或导致较高的死亡率。尽管现有的单侧和双侧肾IRI模型强调可重复性，但在实现稳定的损伤程度和适合研究CKD进展的长期存活率方面仍存在挑战。本文介绍一种背侧入路方案，可建立稳定且可重复的缺血性AKI向CKD转化的动物模型。背侧入路便于直接暴露肾脏，并最大限度减少腹腔内操作。我们采用单侧肾IRI结合对侧肾切除术，后者在采集血液和组织样本前1天进行。该方法具有两个主要优势：（1）通过避免双侧损伤带来的不一致性，显著减少个体间变异；（2）在维持稳定损伤的同时实现接近100%的存活率，相比之下，早期进行肾切除的方案通常伴随更高的死亡率。功能评估通过检测血清尿素氮（BUN）和肌酐水平进行，间质纤维化则在肾IRI后28天和42天通过Masson三色染色法评估胶原沉积以及CKD标志物基因表达水平进行量化。上述指标共同提供了关于肾功能损害及组织病理变化发展的互补性信息。本方案建立了一种可靠且多功能的小鼠缺血性CKD模型，适用于机制性研究。
引言
急性肾损伤（AKI）是住院患者中常见的并发症，仍然是一个重大的全球健康问题。流行病学研究表明，AKI在住院患者中的发生率高达20%，在重症患者中的发生率为30%-60%1,2。尽管部分患者肾功能可恢复，但另一些患者则表现为不完全恢复，从而易进展为慢性肾病（CKD）3。AKI向CKD的转变 increasingly 被认为是决定长期预后的重要因素，并已成为机制研究和治疗研究的重点4,5,6。为了研究其潜在的分子机制并测试可能的治疗方法，可重复的动物模型至关重要。
手术性短暂阻断肾蒂（动脉和静脉）可诱导肾缺血-再灌注损伤（IRI），这是研究小鼠急性肾损伤（AKI）最常用的模型之一。该操作可导致急性肾小管上皮细胞损伤及炎症反应，进而可能发展为慢性间质性纤维化7,8。然而，传统的肾IRI实验方案存在若干挑战。单侧肾IRI模型死亡率极低，广泛用于长期研究9；但无法评估肾功能（....
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方案
本研究中进行的动物实验均经匹兹堡大学机构动物照护与使用委员会（IACUC；方案编号 23103811）批准，并遵循机构指南。可根据需要设置假手术对照组，通常仅进行手术暴露，但不实施血管夹闭或对侧肾切除术。有关所用工具和设备的详细信息，请参见材料部分。锐器（包括针头、手术刀片和夹子）必须丢弃于指定的锐器容器中。生物废弃物（包括组织和尸体）必须按照机构生物危害废弃物处理规程进行处理和处置。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 动物准备与手术设置
- 使用前对所有手术器械进行高压灭菌。对多只动物进行手术时，每次操作间应清除器械上的血液和碎屑，然后使用高温珠灭菌器灭菌10-15秒。待器械冷却后再重复使用。
- 设置一个循环水加热垫，并在手术区域上方放置红外灯。
- 将小鼠放入麻醉诱导室，使用异氟烷（1.5%–2% 氧气混合，流速 1–2 L/min）诱导麻醉（遵循机构批准的实验方案）。当小鼠意识丧失后，通过夹捏脚趾确认反射消失，以验证麻醉深度。
- 将小鼠转移至加热的手术垫上，并维持麻醉状态 通过 鼻锥
- 术后镇痛给予 Ethiqa XR（缓释型丁丙诺啡；3.25 mg/kg，皮下注射）。
- 将小鼠俯卧位放置于手术垫上。必要时用胶带固定四肢以减少移动。
- 使用电推剪剃除预定切口部位....
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结果
手术过程中观察到的肾脏颜色特征性变化证实了均匀性肾缺血的成功诱导以及随后的有效再灌注。成功的缺血表现为肾脏颜色由黑色变为深紫色，在移除血管夹后颜色随之改善，从而证实了再灌注的实现。若肾缺血未能成功诱导，则肾脏仅表现出轻微的颜色变化，后续损伤可能不一致。本研究中，FVB/NJ雄性小鼠经受30分钟肾缺血后进行再灌注，以诱导肾脏损伤。代表性结果见图2。血清样本由堪萨斯州立大学兽医诊断实验室进行肾功能谱分析，包括血尿素氮（BUN）和肌酐的检测。Masson三色染色的肾脏切片通过ImageJ软件进行成像分析，以评估间质胶原沉积。关于Acta2和Col1a1的实时定量qPCR分析，请参见我们此前发表的研究16。
低倍镜图像显示，在肾缺血再灌注损伤（IRI）后28天和42天，肾脏切片呈现进行性萎缩（图2A）。肾IRI后第28天和第42天，Masson三色染色的肾组织显示肾皮质和髓质中广泛存在间质.......
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讨论
该方案提供了一种可重复的由肾缺血-再灌注损伤（IRI）诱导的急性肾损伤（AKI）向慢性肾病（CKD）转变的模型，其特征为持续性肾功能障碍和进行性间质性纤维化，这两者被广泛认为是慢性肾病（CKD）的典型标志17,18单侧输尿管梗阻（UUO）是一种广泛应用的慢性肾病模型，可诱导梗阻性肾病，并主要导致纤维化 通过 持续性管状阻塞18,19肾缺血-再灌注可导致肾小管上皮细胞损伤与血管内皮/微血管功能障碍并存，这是缺血性急性肾损伤及其向慢性肾病进展的关键机制6,20UUO 会引发持续性的梗阻性损伤，而我们的缺血性 CKD 模型则是短暂的。因此，缺血性 CKD 模型更适用于针对缺血应激及急性肾损伤向慢性肾病（AKI-to-CKD）转变的研究。此外，UUO 是一种快速进展的 CKD 模.......
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致谢
本工作得到了NIDDK K01-DK133635、UPMC VMI P3HVB奖项、Samuel和Emma Winters基金会奖项、UPMC CHP RAC启动资助、UPMC CHP基金会儿童信托资助者奖项、George M. O'Brien肾脏资源联盟机会池项目（OKRA OPP）（资助TC）、NIDDK R01-DK121758、DK134346、R25-DK119180（资助SSL）、NIDDK R01-DK125015、R01-DK137410（资助JH）以及Carolyn和Mark Snyder与Snyder家族（资助JH和SSL）的支持。我们感谢UPMC CHP组织学核心实验室在组织学和扫描成像方面的协助，以及堪萨斯州立大学兽医诊断实验室在血清化学分析方面的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 麻醉气体过滤器 | A.M. Bickford | F-AIR | |
| 麻醉诱导舱（带加热功能） | AIMS Lab Products | WCS8 | |
| 血液采集管 | BD Microtainer | 365967 | |
| 乙醇 | Decon Labs | 2701 | |
| 乙替卡 XR（缓释型丁丙诺啡） | Fidelis Animal Health | NDC 86084-100-30 | |
| 眼膏 | AKORN | NDC 17478-062-35 | |
| 无菌纱布垫 | Dynarex | 3353 | |
| 小型动物用毛发剪 | WAHL | CLP-9868 | |
| 红外加热灯 | Physitemp Instruments | HL-1 | |
| 用于温水循环的热泵 | BrainTree Scientific | HTP-1500 | |
| 小型动物用加热/麻醉系统，Versaflex | BrainTree Scientific | EZ-7150 | |
| 保温型手术单 | Braintree Scientific | SPDR-MPS | |
| 微珠灭菌器 | Simon Keller | Steri 250 | |
| 异氟烷溶液 | Covetrus | 29405 | |
| 结扎夹施夹器 | WECK | 533140 | |
| 结扎夹 | WECK | 533837 | |
| 直肠温度用微探针 | Physitemp | RET-3 | |
| 微探针温度计 | Physitemp | BAT-12 | |
| 光学显微镜 | Leica | DM2500 | |
| 切片扫描显微镜 | Leica | Aperio CS2 slide scanner | |
| 小鼠（FVB/NJ） | Jackson Laboratory | 001800 | |
| 针头（23G） | BD | 305145 | |
| 聚维酮碘棉签棒 | Dynarex | 1201 | |
| 手术刀片 | Fine Science Tools | 10020-00 | |
| 手术刀柄 | Fine Science Tools | 10060-13 | |
| 无齿手术镊 | Roboz Surgical Instrument | RS-5228 | |
| 有齿手术镊 | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| 带齿手术镊 | Fine Science Tools | 11019-12 | |
| 外科手套 | CTI | SPGF750 | |
| 组织分离剪 | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| 缝合线，聚乙醇酸（PGA）/可吸收 （5-0） | Dynarex | 9131 | |
| 缝合线，丝线（4-0） | Oasis | MV-683-V | |
| 注射器（3ml） | BD | 309628 | |
| 无菌毛巾单 | Dynarex | 4410 | |
| 血管夹施夹钳 | Fine Science Tools | 15057-14 | |
| 无创血管夹 | Fine Science Tools | 18055-03 | |
| 伤口缝合钉施加器 | Fine Science Tools | 12020-09 | |
| 伤口缝合钉 | Fine Science Tools | 12022-09 |
参考文献
- Susantitaphong, P., et al. World incidence of AKI: A meta-analysis. Clin J Am Soc Nephrol. 8, 1482-1493 (2013).
- Pickkers, P., et al. Acute kidney injury in the critically ill: an updated review on pathophysiology and management. Intensive ....
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重印与许可
