建立用于叙利亚金黄仓鼠高血压研究的标准化肾动脉结扎术

摘要

本研究建立并优化了叙利亚仓鼠的单侧肾动脉部分结扎模型（2K1C），该模型可在高脂血症背景下稳定诱导肾素-血管紧张素系统相关的继发性高血压，为心血管研究提供了高度可重复的实验平台。

摘要

高血压被视为一种主要的全球健康威胁，​ 可能导致严重的并发症，包括血管重塑、心力衰竭、心肌梗死和终末期肾病。叙利亚金黄地鼠是一种天然表达胆固醇酯转移蛋白（CETP）的模型动物，易发生饮食诱导的高脂血症。为了建立一个可靠且可重复的地鼠模型，用于研究肾动脉狭窄（RAS）、继发性高血压与心血管疾病之间的关系，本研究采用了双肾单夹（2K1C）Goldblatt模型。本文详细描述了在叙利亚金黄地鼠中诱导肾动脉狭窄的优化手术操作流程。 通过 部分肾动脉结扎，强调手术分离技术及结扎材料选择等关键因素，这些因素对实验结果具有显著影响。采用该标准化手术方案后，约90%的处理仓鼠表现出持续性收缩压升高25–30 mmHg。此优化的肾动脉结扎方法可提供一种稳定可靠的技术，用于建立一致性高、可重复性强的高血压仓鼠模型，适用于心血管疾病研究。

引言

肾动脉狭窄（RAS）是继发性高血压的主要病因之一，也是心血管疾病发病率的重要危险因素¹。临床研究中的一个主要挑战在于，由于合并症和伴随用药的干扰，难以明确界定血脂异常、高血压与终末器官损伤之间的因果通路。这凸显了建立一种能够在受控且可重复的实验条件下准确模拟该复杂病理生理过程的动物模型的迫切需求。

双肾单夹（2K1C）Goldblatt 模型是一种在啮齿类动物中诱导肾血管性高血压的成熟方法。然而，常规使用的物种如小鼠和大鼠存在显著局限性。值得注意的是，这些啮齿类动物缺乏胆固醇酯转移蛋白（CETP），而该酶在人类高密度脂蛋白代谢中起关键作用²。因此，它们对饮食诱导的高胆固醇血症和动脉粥样硬化具有抵抗性，无法模拟肾动脉狭窄（RAS）患者中常见的代谢特征。此外，在这些模型中，肾动脉夹闭引起的高血压反应通常较弱且高度可变；例如，C57BL/6 小鼠的血压升高幅度极小，而 Sprague-Dawley 大鼠则表现出显著的个体间差异，这阻碍了机制研究和治疗探索的可重复性^3,4。

相比之下，叙利亚金黄仓鼠（Mesocricetus auratus）在相关研究中具有独特的生理优势。当饲喂高脂高胆固醇饮食时，其体内天然表达胆固醇酯转移蛋白（CETP），可形成类似人类的脂蛋白谱，包括低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）升高和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）轻度上升，并在主动脉和冠状动脉中自发形成动脉粥样硬化病变⁵。这为心血管疾病的研究提供了高度相关的代谢和血管背景。此外，近期证据表明，与小鼠相比，仓鼠在肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）激活以及类糜蛋白酶作用下，表现出更显著的血压反应，因此特别适用于高血压研究⁶。

尽管具有上述优势，仓鼠2K1C模型的应用仍受限于缺乏标准化且可存活的手术方案。现有技术从完全结扎（死亡率高）到依赖操作者经验的部分结扎不等，导致结果不一致且可重复性差⁷。因此，为了充分挖掘仓鼠对代谢性疾病和高血压疾病的双重易感性，我们开发了一种经过优化且高度可重复的2K1C模型手术方法。该优化方案可在饮食诱导的血脂异常背景下稳定诱导高血压，从而为研究肾素-血管紧张素系统（RAS）、高脂血症与心血管损伤之间的协同作用提供一个可靠且整合的实验平台。

方案

动物实验方案经江门国际生命健康创新研究院实验动物伦理委员会（N2023008）和北京大学（DLASBE0730）批准。实验使用10–12周龄雄性叙利亚金黄地鼠。所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 术前准备

1. 在标准条件下（温度21–24 °C，湿度40%–60%，12小时光照-黑暗循环）饲喂动物普通饲料并提供清洁饮水。
2. 使用前对所有手术器械和材料进行灭菌。用75%乙醇消毒手术平台。术前将加热垫预热至约38 °C。
3. 将仓鼠放入麻醉诱导室，通入3%异氟烷（遵循机构批准的方案）。
4. 通过脚掌回缩反射消失确认深度麻醉状态，并维持麻醉。 通过 带有1.5%–2%异氟烷的鼻罩。
5. 使用电动剪刀去除左侧腰部中间区域的毛发。
6. 用聚维酮碘对暴露的皮肤进行消毒。

2. 手术步骤

1. 使用手术刀在左侧腰部区域中线处做一条长约1.5–2 cm的纵向切口。钝性分离下方肌肉，将背阔肌与髂肋肌层分开。沿肌纤维方向建立一个约1 cm的通路通道。
2. 使用钝头镊子轻轻牵开腹膜后脂肪，暴露肾脏。将左肾轻柔牵出体外，辨认肾蒂结构，并用钝头镊子分离肾动脉与肾静脉。
3. 将一根直径为0.27 mm的针置于肾动脉旁侧，用6-0聚丙烯缝线将针与肾动脉一同结扎。打一个松散的单结。
   1. 小心抽出针头，使肾动脉形成环形缩窄，管腔直径缩小至0.27 mm。通过观察血流明显变细但未完全阻断，同时肾脏颜色出现轻微改变，确认狭窄操作成功。
4. 将肾脏复位至肾窝内。分别使用4-0和3-0不可吸收聚丙烯缝线逐层缝合肌肉层和皮肤。依次使用聚维酮碘和乙醇对术区进行消毒。
5. 将动物置于加热垫上，持续监测呼吸状态直至意识恢复。术后连续3天给予卡洛芬（5 mg/kg，皮下注射）。术后至少单独饲养仓鼠1周。

3. 血压测量

注意：术后2周和4周，使用尾套法血压监测系统无创测量血压。

1. 将仓鼠置于含有3%异氟烷的麻醉舱内进行麻醉。
2. 将动物俯卧位固定于手术板上，并佩戴面罩以维持麻醉状态。
3. 在前肢安装袖带，每只动物至少记录2分钟的血压。

4. 超声检查

注意：术后4周使用彩色多普勒和三维容积超声系统评估肾脏血流动力学及结构适应性。

1. 使用3%异氟烷麻醉舱对仓鼠进行麻醉。
2. 将动物俯卧位固定于手术板上，并佩戴面罩以维持麻醉状态。
3. 使用脱毛膏去除腹部毛发，以确保最佳声学接触；放置超声探头前涂抹耦合凝胶。
4. 将探头置于左肾区域，获取清晰的纵向B模式图像。
5. 使用卡尺功能测量肾脏长度和皮质厚度。
6. 启动彩色多普勒模式，观察肾脏血流情况。
7. 记录收缩期峰值流速、舒张末期流速，并计算阻力指数。
8. 进行三维扫描以重建肾脏体积。
9. 保存所有图像及测量数据。
10. 移除探头并监测动物直至其恢复清醒。

结果

本研究中，这些仓鼠被随机分为两组：假手术组8只，手术组11只。除非另有说明，所有数据均以均值±标准差表示。每只动物的手术时间约为20–25分钟。术中无死亡，术后9周内的存活率为100%。术后2周测量了无创血压。无论是否进行结扎，手术对食欲的影响较小，两组的体重变化相似（图1A）。结扎组的收缩压和舒张压分别为125.5 ± 16.97 mmHg和85.33 ± 13.06 mmHg，假手术组分别为79.50 ± 13.92 mmHg和53.50 ± 18.79 mmHg。与假手术组相比，结扎组的平均血压显著升高了1.5倍。两组的心率相似（图1B–E）。

肾动脉结扎2周后进行血液生化分析。采集血浆样本，检测血糖、甘油三酯、总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-胆固醇）水平。值得注意的是，与假手术组相比，结扎组的总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇水平显著降低表1与此同时，在术后4周检测了血液中尿酸、尿素和肌酐...

讨论

双肾单夹（2K1C）模型是肾血管性高血压研究中的经典动物模型。该模型的历史可追溯到上个世纪，能有效模拟人类肾血管性高血压的发病机制。其基本机制在于肾动脉狭窄引起的缺血激活肾素-血管紧张素系统（RAS），最终导致全身性高血压。该模型不仅高度模拟了人类高血压的病理进展过程，而且具有操作简便、可重复性高等显著优势。

相比之下，单侧肾单夹（1K1C）模型可诱导更显著的高血压，但缺乏2K1C模型中存在的代偿机制。转基因模型能够精确探究特定基因的功能，但操作复杂且成本较高 。药物诱导方法则可用于全面分析肾素-血管紧张素系统（RAS）内部复杂的相互作用⁸。整合多种模型有助于深入解析RAS内部复杂的相互作用关系。因此，2K1C模型在模拟慢性肾血管性高血压以及研究RAS病理生理机制方面具有不可替代的作用，尤其适用于药物筛选和系统性影响评估。此外，将2K1C模型与基因修饰模型或药物诱导方法相结合，靶向特定的RAS效应分子，可进一步阐明RAS系统的复杂性及其在多种疾病中的多方面作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.37 直径缝合线	Johnson &强生医疗科技，中国	JH-18-5100
6-0聚丙烯缝合线	中国扬州环球医疗器械有限公司	N/A
动物麻醉机	美国 Midmark 公司	V2330299
卡洛芬	Macklin，中国	C830557-5g
胆固醇检测试剂盒	中国北京	100000180
彩色多普勒超声系统	迈瑞医疗，中国	Resona8
葡萄糖检测试剂盒	中国北京	100000240
高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒	中国北京	100020235
LDLR基因敲除叙利亚金黄仓鼠	中国北京大学	N/A
Muromachi MK-2000ST 小鼠无创血压监测仪 &和大鼠	日本村町机械株式会社	140305MU
宠物加热垫	中国梅泰	DXT30*35-1X
大鼠肾素ELISA试剂盒	中国 Covide	KWD-E7398R-B
缝合针	Johnson &强生医疗科技，中国	JH-18-5037
甘油三酯检测试剂盒	中国北京	100000220
垂直压力蒸汽灭菌器	日本山本科学公司	J3170372