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方法文章

MeRIP-qPCR 检测骨肉瘤细胞中特定 RNA 的 m6A 修饰水平

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DOI：

10.3791/69880

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2025年12月30日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案提供了利用MeRIP-qPCR技术检测特定RNA中m6A修饰水平的详细方法。

摘要

RNA 表观转录组修饰在多种癌症的发生和发展中发挥着关键作用，其中 N6-甲基腺苷（m6A）是最常见且功能最多样化的修饰形式。本文介绍了一种利用 MeRIP-qPCR 检测骨肉瘤细胞中特定转录本 m6A 修饰水平的简化且可重复的实验方案。在该实验中，首先提取总 RNA，随后与特异性的抗 m6A 抗体孵育，以免疫捕获发生 m6A 修饰的 RNA。接着对 RNA 进行片段化处理，并利用蛋白 G 磁珠富集 m6A 修饰的 RNA 片段。通过蛋白酶 K 消化释放富集的 RNA，并使用 RNA 结合磁珠进行纯化。最后，将 RNA 进行逆转录并进行定量聚合酶链式反应（PCR），以评估候选基因中的 m6A 水平。结果表明，该方法能够有效区分甲基化差异，为研究骨肉瘤细胞中 m6A 修饰的功能机制提供了可靠的工具。综上所述，MeRIP-qPCR 为研究骨肉瘤细胞中的 m6A 修饰提供了一种简便且高特异性的方法。该方案在解析 m6A 调控网络和发现新型治疗靶点方面具有广阔的应用前景。

引言

最新的表观转录组学研究显示，RNA N6-甲基腺苷（m6A）修饰，即腺苷上 N6 位点的甲基化，是真核细胞 mRNA 中已知最丰富的内在化学修饰1。m6A 参与多种生物学过程，包括 mRNA 的稳定性、剪接、核输出以及翻译效率2。重要的是，越来越多的证据表明，m6A 修饰的失调在多种癌症的发生和发展中起重要作用，其中包括骨肉瘤——一种主要影响青少年和年轻成年人的高度侵袭性恶性骨肿瘤3。

研究m6A修饰需要稳健且可靠的方法。目前已开发出多种检测m6A修饰水平的技术，包括m6A点印迹（dot blot）、m6A ELISA和MeRIP-seq。m6A点印迹法操作简单、成本较低，但其灵敏度有限且定量能力较差，仅能提供总RNA的m6A修饰水平，而无法获得特定RNA的m6A修饰水平4。m6A ELISA检测相对便捷且通量较高，但仍存在交叉反应性强和准确性低的主要问题，同样无法揭示转录本或位点特异性的修饰情况5。MeRIP-seq可实现全转录组范围内的m6A图谱绘制，但其对大量RNA起始量的需求、分辨率相对较低以及对抗体的依赖性，限制了该方法的精确性和可重复性6。相比之下，MeRIP-qPCR将免疫沉淀与定量PCR相结合，能够对特定RNA上的m6A进行更高灵敏度和特异性的靶向检测7。该方法可灵敏地靶向检测候选基因中m6A富集的差异，因此特别适用于m6A相关癌症研究中的验证实验。对于致力于研究m6A介导的调控机制的实验室而言，该方法是一种经济高效且易于实施的替代方案。

本文以MeRIP-qPCR方法为例，提供了一套详细的实验方案（图1），用于检测骨肉瘤细胞中c-Myc的m6A修饰水平。MeRIP-qPCR依赖于抗体富集甲基化的RNA片段，并结合逆转录和定量PCR技术，可评估特定RNA上m6A的存在情况及其相对丰度。我们证明了该方法能够有效区分c-Myc的甲基化差异，为研究m6A在骨肉瘤细胞中的功能作用提供了可靠的平台。本研究突出了MeRIP-qPCR作为骨肉瘤中m6A修饰研究的一种实用且特异的工具的潜力，并为发现新的治疗靶点奠定了基础。

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方案

1. RNA 的制备

注意：使用RNA提取试剂盒进行RNA提取。处理细胞和RNA试剂时，应在洁净的生物安全柜内操作。穿戴适当的个人防护装备（实验服、手套、护目镜）。开始前将离心机预冷至4 °C。

  1. 准备细胞。
    1. 从3.5 cm培养皿中移除培养基，用预冷的PBS轻柔洗涤细胞一次。直接向培养皿中加入适量RNA裂解缓冲液，充分裂解细胞，并轻轻吹打以实现均质化。
    2. 将细胞悬液转移至1.5 mL微量离心管中。
    3. 在4 °C下以1000 × g离心5分钟。
      注意：确保转子平衡且盖子已牢固关闭。
    4. 离心后小心取出微量离心管。
    5. 使用1 mL移液器彻底吸除上清液，避免扰动管底的沉淀。
      注意：移液器吸头不得接触细胞沉淀。
  2. 裂解细胞。
    1. 向细胞沉淀中加入300 µL裂解缓冲液。
    2. 通过反复倒置试管30次，充分混匀，直至溶液呈透明且黏稠状，无可见团块。
    3. 在室温下孵育2分钟。
  3. 沉淀RNA。
    1. 向裂解液中加入300 µL 100%乙醇（与裂解缓冲液体积相等）。
    2. 立即轻柔上下吹打约8–10次，确保充分混匀。
  4. 进行RNA柱结合。
    1. 将RNA纯化柱放入提供的2 mL收集管中。
    2. 将全部混合液转移至纯化柱中。
      注意：避免接触柱中心的白色膜。
    3. 盖紧盖子，在12,000 × g下离心1分钟。
    4. 弃去下层液体，并将收集管倒置轻敲于吸水纸上，以去除残留液体。
    5. 将纯化柱重新放回收集管中。
  5. 洗涤杂质。
    1. 向纯化柱中加入500 µL洗涤缓冲液（无核酸酶水）。
      注意：避免接触柱中心的白色膜。
    2. 在12,000 × g下离心1分钟，弃去下层液体。
    3. 再次在12,000 × g下离心1分钟，以去除残留液体。
    4. 将纯化柱转移至一个新的1.5 mL微量离心管中。
    5. 打开盖子，让柱在室温下静置2分钟。
  6. 洗脱RNA。
    1. 将纯化柱放入一个新的1.5 mL微量离心管中。
    2. 将25 µL洗脱缓冲液直接加至膜的中心位置。
    3. 在室温下孵育5分钟。
    4. 在12,000 × g下离心1分钟，收集下层管中的RNA。
    5. 将洗脱液重新加回到膜上，再次在12,000 × g下离心1分钟，以最大化回收率。
      注意：务必始终将洗脱缓冲液直接加至柱膜中心。避免将其加至侧壁，否则可能导致RNA无法充分溶解，显著降低得率。同时，切勿用移液器吸头刺穿膜。
  7. 测定RNA浓度。
    1. 用1.5 µL洗脱缓冲液冲洗分光光度计样品口。
    2. 使用1.5 µL洗脱缓冲液作为空白对照，确认读数接近零。
    3. 加载1.5 µL RNA样品，测定其浓度。
    4. 使用分光光度计（A260/A280 = 1.8–2.2，A260/A230 = 2.0–2.5）和琼脂糖凝胶电泳评估RNA样品的质量。

2. 甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）

  1. 免疫捕获混合物的制备
    1. 取一个新的 0.2 mL PCR 管。
    2. 加入 表 1 中所列的组分（以一个反应为例）。
  2. 免疫捕获
    1. 拧紧管盖。将 PCR 管置于旋转仪或滚轴混合器上。
    2. 室温孵育 90 分钟。
      注意：确保溶液持续轻柔地混合。
  3. RNA 切割
    1. 孵育结束后，向每个管中加入 10 µL 核消化增强剂（NDE）和 2 µL 切割酶混合液（CEM）。
    2. 用移液器轻轻吹打 5 至 6 次以混匀。
    3. 室温孵育 4 分钟。
    4. 输入 RNA 对照的制备
      1. 为确保免疫沉淀（IP）样本与输入样本之间的一致性，平行处理部分 RNA 作为输入对照。
      2. 从每个样本中转移 1 µg 总 RNA（10% 输入）至单独的 PCR 管中。加入 20 µL 免疫捕获缓冲液（ICB）、1.5 µL NDE 和 1 µL CEM，室温孵育 2 分钟。
  4. 磁珠富集与洗涤
    1. 将 PCR 管置于磁力架上。
    2. 静置 2 分钟，直至溶液变澄清，磁珠吸附于管壁。
    3. 小心吸除并弃去上清液，避免扰动磁珠。
    4. 保持管子在磁力架上，加入 150 µL 洗涤缓冲液（WB）。
    5. 将管子从磁力架上取下，轻轻倒置倾斜，充分重悬磁珠。
    6. 将管子放回磁力架，等待 1–2 分钟直至溶液澄清，然后弃去上清液。
    7. 重复洗涤步骤三次。
    8. 使用相同方法，用 150 µL 蛋白消化缓冲液（PDB）再洗涤磁珠一次。
  5. 富集 RNA 的释放与回收
    1. 按 1:9 的比例混合蛋白酶 K 与 PDB，配制蛋白消化工作液。（每个反应配制 20 µL：2 µL 蛋白酶 K + 18 µL PDB）。
    2. 最后一次洗涤后，将管子从磁力架上取下。
    3. 向磁珠沉淀中加入 20 µL 新鲜配制的蛋白消化工作液，并轻轻混匀。
    4. 将 PCR 管放入热循环仪中，55 °C 孵育 15 分钟。
    5. 将 PCR 管放回磁力架上，等待溶液澄清（约 2 分钟）。
    6. 小心将全部上清液（约 20 µL）转移至新的 0.2 mL PCR 管中。
      ​注意：RNA 现已存在于上清液中。弃去磁珠。
  6. RNA 纯化
    1. 向每个样本管、阴性对照管和输入管中加入 20 µL RNA 纯化溶液（RPS）。
    2. 加入 160 µL 100% 乙醇。
    3. 涡旋振荡 RNA 结合磁珠以充分重悬。
    4. 向每管中加入 2 µL 重悬的 RNA 结合磁珠。
    5. 充分上下颠倒混匀至少 10 次。
    6. 室温孵育 5 分钟，使 RNA 与磁珠结合。
    7. 将管子置于磁力架上，等待溶液澄清（约 2 分钟）。
    8. 小心弃去上清液，避免扰动磁珠。
    9. 保持管子在磁力架上，加入 150 µL 新鲜配制的 90% 乙醇，孵育 30 秒。
    10. 弃去 90% 乙醇。再用 90% 乙醇洗涤一次（共洗涤两次）。
    11. 将管子从磁力架上取下。
    12. 向干燥的磁珠中加入 13 µL 洗脱缓冲液。
    13. 室温孵育 5 分钟以洗脱 RNA。
    14. 将管子放回磁力架上，等待溶液澄清（约 2 分钟）。
    15. 小心将全部上清液（约 13 µL）转移至新的无 RNase 的 PCR 管中。
    16. 立即使用，或将 RNA 储存于 -20 °C。

3. 逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）

  1. 将 m6A 富集的 RNA 逆转录为 cDNA
    1. 使用 m6A-IP、Input 或 IgG 组中纯化的 RNA 进行逆转录。
    2. 配制逆转录（RT）反应体系。
      注意：确保各组间 RNA 加样量相等，以便在后续 qPCR 分析中进行可靠比较。
  2. qPCR 扩增
    1. 使用 SYBR Green 化学法配制 qPCR 反应体系。在每个反应管中加入 10 µL SYBR Green Master Mix（2×）、0.5 µL 正向引物（10 µM）、0.5 µL 反向引物（10 µM）、7 µL ddH2O 和 2 µL cDNA，充分混匀后短暂离心，再上机进行 qPCR 检测。
      注意：每份 cDNA 样品（Input、IgG、m6A-IP）设置三个重复孔。引物列表请参见 表 2。
    2. 运行 qPCR 程序。
      1. 在实时荧光定量 PCR 仪上运行以下程序：95 °C 预变性 30 s；进行 40 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 15 s、58 °C 退火 10 s 和 72 °C 延伸 30 s。
      2. 扩增结束后进行熔解曲线分析：95 °C 变性 15 s，60 °C 冷却 1 min，然后以 0.5 °C/s 的升温速率从 60 °C 逐步升至 95 °C，同时连续采集荧光信号，以确认扩增产物的特异性。
  3. 数据分析
    1. 分析目标组与对照组的 Ct 值。
    2. 使用以下方法之一计算富集程度：
      1. 方法 1：%Input 法
        %Input = 2[Ct(Input)−Ct(IP)] × DF × 100%
        注意：Ct (Input) 和 Ct (IP) 分别代表 Input 和 IP 样品的循环阈值，稀释因子（DF）为用于 qPCR 的 Input 样品所占总 RNA 比例的倒数（例如，若使用总 RNA 的 10% 作为 Input，则 DF = 10）。
      2. 方法 2：比较 Ct 法（2−ΔΔCt 法）
        ΔCt样本 = CtIP − CtIgG
        ΔΔCt = ΔCt处理组 − ΔCt对照组，倍数变化 = 2−ΔΔCt。
        注意：所有样品的 RNA 加样量、反应体系设置及引物扩增效率应保持一致。

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结果

此处展示了MeRIP-qPCR分析的代表性结果，即c-Myc在hFOB1.19和143B细胞中的m6A修饰水平。图2显示，与仅呈现背景信号水平的IgG对照组相比，抗m6A抗体对c-Myc的富集显著更高，表明该抗m6A抗体具有良好的有效性和特异性。我们还观察到，c-Myc的m6A修饰水平在143B细胞中显著高于hFOB1.19细胞（P < 0.001）。该结果提示，c-Myc在骨肉瘤细胞中经历了更强的m6A修饰，这可能与其在肿瘤发生和发展中的作用密切相关。因此，m6A修饰可能通过调控c-Myc的稳定性或翻译效率，进而促进骨肉瘤细胞恶性表型的维持。

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讨论

MeRIP-qPCR 已成为研究 RNA m6A 修饰的一种重要工具，具有广泛的应用前景。该方法在验证高通量测序结果以及在机制研究中精确定位靶基因特定区域内的修饰位点方面尤为有用。此外，由于其成本相对较低且操作简便，大多数分子生物学实验室均可便捷地开展该技术，使其成为表观转录组学研究中一种高效且实用的方法8。

为确保成功，该方法依赖于几个关键步骤。首先，RNA的完整性和质量至关重要，因为降解的RNA可能导致结果不可靠。其次，严格的对照设计非常重要，必须设置Input和IgG对照，以消除非特异性结合带来的偏差。第三，抗体的选择至关重要；只有高亲和力和高特异性的m6A抗体才能确保可靠的富集效果9。此外，RNA片段化的优化以及引物的精心设计将直接影响检测的分辨率和效率10。

与其它方法相比，MeRIP-qPCR 具有明显优势。借助特异性抗体富集和 ...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由国家自然科学基金（82174408、82374477、82474535 和 82205145）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100% 乙醇Shanghai Titan Scientific Co.,Ltd., America1158566
143BATCC, AmericaATCC CRL-8303TM
2×SYBR Green qPCR Mix北京启恒兴生物科技有限公司，中国FS-Q1002
Denovix DS-11 DenovixDS-11 分光光度计
DMEM 培养基WISENT CORPORATION, 中国319-005-CL
DMEM/F-12 培养基Gibco, America11320033
EpiQuik CUT&RUN m6A RNA 富集（MeRIP）试剂盒Epigentek, AmericaP-9018-24
胎牛血清WISENT CORPORATION, 中国086-150
hFOB1.19中国科学院细胞库，中国GNHu14
m6A RNA 甲基化检测试剂盒Abcam, Englandab185912
microRNA 反转录试剂盒EZBioscience-EZB, AmericaA0010CGQ
实时定量 PCR 系统BIO-RAD, AmericaCFX96
总 RNA 提取试剂盒EZBioscience-EZB, AmericaB0004DP
TrypLE Express 酶Gibco, America12604021

参考文献

  1. Ma, S., et al. The interplay between m6A RNA methylation and noncoding RNA in cancer. J Hematol Oncol. 12 (1), 121(2019).
  2. Zhu, Z. M., Huo, F. C., Zhang, J., Shan, H. J., Pei, D. S. Crosstalk between m6A modification and alternative splicing during cancer progression. Clin Transl Med. 13 (10), e1460(2023).
  3. Hu, T., Wang, G., Wang, D., Deng, Y., Wang, W. m6A methylation modification: Potential pathways to suppress osteosarcoma metastasis. Int Immunopharmacol. 145, 113759(2025).
  4. Nagarajan, A., Janostiak, R., Wajapeyee, N. Dot blot analysis for measuring global N6-methyladenosine modification of RNA. Methods Mol Biol. 1870, 263-271 (2019).
  5. Yang, Y., et al. Current progress in strategies to profile transcriptomic m6A modifications. Front Cell Dev Biol. 12, 1392159(2024).
  6. McIntyre, A. B. R., Gokhale, N. S., Cerchietti, L., Jaffrey, S. R., Horner, S. M., Mason, C. E. Limits in the detection of m6A changes using MeRIP/m6A-seq. Sci Rep. 10 (1), 6590(2020).
  7. Meyer, K. D., Saletore, Y., Zumbo, P., Elemento, O., Mason, C. E., Jaffrey, S. R. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  8. Zheng, H. X., Zhang, X. S., Sui, N. Advances in the profiling of N6-methyladenosine (m6A) modifications. Biotechnol Adv. 45, 107656(2020).
  9. Matsuzawa, S., Wakata, Y., Ebi, F., Isobe, M., Kurosawa, N. Development and validation of monoclonal antibodies against N6-methyladenosine for the detection of RNA modifications. PLoS One. 14 (10), e0223197(2019).
  10. Law, J., Günther, S., Watanabe, S. Epitranscriptome mapping of N6-methyladenosine using m6A immunoprecipitation with high-throughput sequencing in skeletal muscle stem cells. Methods Mol Biol. 2640, 431-443 (2023).
  11. Mathur, L., Jung, S., Jang, C., Lee, G. Quantitative analysis of m6A RNA modification by LC-MS. STAR Protoc. 2 (3), 100724(2021).
  12. Slama, K., et al. Determination of enrichment factors for modified RNA in MeRIP experiments. Methods. 156, 102-109 (2019).
  13. Guo, W., et al. Single-molecule m6A detection empowered by endogenous labeling unveils complexities across RNA isoforms. Mol Cell. 85 (6), 1233-1246.e7 (2025).

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