MeRIP-qPCR 检测骨肉瘤细胞中特定 RNA 的 m6A 修饰水平

摘要

本方案提供了利用MeRIP-qPCR技术检测特定RNA中m⁶A修饰水平的详细方法。

摘要

RNA 表观转录组修饰在多种癌症的发生和发展中发挥着关键作用，其中 N⁶-甲基腺苷（m⁶A）是最常见且功能最多样化的修饰形式。本文介绍了一种利用 MeRIP-qPCR 检测骨肉瘤细胞中特定转录本 m⁶A 修饰水平的简化且可重复的实验方案。在该实验中，首先提取总 RNA，随后与特异性的抗 m⁶A 抗体孵育，以免疫捕获发生 m⁶A 修饰的 RNA。接着对 RNA 进行片段化处理，并利用蛋白 G 磁珠富集 m⁶A 修饰的 RNA 片段。通过蛋白酶 K 消化释放富集的 RNA，并使用 RNA 结合磁珠进行纯化。最后，将 RNA 进行逆转录并进行定量聚合酶链式反应（PCR），以评估候选基因中的 m⁶A 水平。结果表明，该方法能够有效区分甲基化差异，为研究骨肉瘤细胞中 m⁶A 修饰的功能机制提供了可靠的工具。综上所述，MeRIP-qPCR 为研究骨肉瘤细胞中的 m⁶A 修饰提供了一种简便且高特异性的方法。该方案在解析 m⁶A 调控网络和发现新型治疗靶点方面具有广阔的应用前景。

引言

最新的表观转录组学研究显示，RNA N⁶-甲基腺苷（m⁶A）修饰，即腺苷上 N⁶ 位点的甲基化，是真核细胞 mRNA 中已知最丰富的内在化学修饰¹。m⁶A 参与多种生物学过程，包括 mRNA 的稳定性、剪接、核输出以及翻译效率²。重要的是，越来越多的证据表明，m⁶A 修饰的失调在多种癌症的发生和发展中起重要作用，其中包括骨肉瘤——一种主要影响青少年和年轻成年人的高度侵袭性恶性骨肿瘤³。

研究m⁶A修饰需要稳健且可靠的方法。目前已开发出多种检测m⁶A修饰水平的技术，包括m⁶A点印迹（dot blot）、m⁶A ELISA和MeRIP-seq。m⁶A点印迹法操作简单、成本较低，但其灵敏度有限且定量能力较差，仅能提供总RNA的m⁶A修饰水平，而无法获得特定RNA的m⁶A修饰水平⁴。m⁶A ELISA检测相对便捷且通量较高，但仍存在交叉反应性强和准确性低的主要问题，同样无法揭示转录本或位点特异性的修饰情况

方案

1. RNA 的制备

注意：使用RNA提取试剂盒进行RNA提取。处理细胞和RNA试剂时，应在洁净的生物安全柜内操作。穿戴适当的个人防护装备（实验服、手套、护目镜）。开始前将离心机预冷至4 °C。

1. 准备细胞。
   1. 从3.5 cm培养皿中移除培养基，用预冷的PBS轻柔洗涤细胞一次。直接向培养皿中加入适量RNA裂解缓冲液，充分裂解细胞，并轻轻吹打以实现均质化。
   2. 将细胞悬液转移至1.5 mL微量离心管中。
   3. 在4 °C下以1000 × g离心5分钟。
      注意：确保转子平衡且盖子已牢固关闭。
   4. 离心后小心取出微量离心管。
   5. 使用1 mL移液器彻底吸除上清液，避免扰动管底的沉淀。
      注意：移液器吸头不得接触细胞沉淀。
2. 裂解细胞。
   1. 向细胞沉淀中加入300 µL裂解缓冲液。
   2. 通过反复倒置试管30次，充分混匀，直至溶液呈透明且黏稠状，无可见团块。
   3. 在室温下孵育2分钟。
3. 沉淀RNA。
   1. 向裂解液中加入300 µL 100%乙醇（与裂解缓冲液体积相等）。
   2. 立即轻柔上下吹打约8–10次，确保充....

结果

此处展示了MeRIP-qPCR分析的代表性结果，即c-Myc在hFOB1.19和143B细胞中的m⁶A修饰水平。图2显示，与仅呈现背景信号水平的IgG对照组相比，抗m⁶A抗体对c-Myc的富集显著更高，表明该抗m⁶A抗体具有良好的有效性和特异性。我们还观察到，c-Myc的m⁶A修饰水平在143B细胞中显著高于hFOB1.19细胞（P < 0.001）。该结果提示，c-Myc在骨肉瘤细胞中经历了更强的m⁶A修饰，这可能与其在肿瘤发生和发展中的作用密切相关。因此，m⁶A修饰可能通过调控c-Myc的稳定性或翻译效率，进而促进骨肉瘤细胞恶性表型的维持。

讨论

MeRIP-qPCR 已成为研究 RNA m⁶A 修饰的一种重要工具，具有广泛的应用前景。该方法在验证高通量测序结果以及在机制研究中精确定位靶基因特定区域内的修饰位点方面尤为有用。此外，由于其成本相对较低且操作简便，大多数分子生物学实验室均可便捷地开展该技术，使其成为表观转录组学研究中一种高效且实用的方法⁸。

为确保成功，该方法依赖于几个关键步骤。首先，RNA的完整性和质量至关重要，因为降解的RNA可能导致结果不可靠。其次，严格的对照设计非常重要，必须设置Input和IgG对照，以消除非特异性结合带来的偏差。第三，抗体的选择至关重要；只有高亲和力和高特异性的m⁶A抗体才能确保可靠的富集效果⁹。此外，RNA片段化的优化以及引物的精心设计将直接影响检测的分辨率和效率¹⁰。

与其它方法相比，MeRIP-qPCR 具有明显优势。借助特异性抗体富集和 .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100% 乙醇	Shanghai Titan Scientific Co.,Ltd., America	1158566
143B	ATCC, America	ATCC CRL-8303TM
2×SYBR Green qPCR Mix	北京启恒兴生物科技有限公司，中国	FS-Q1002
Denovix DS-11	Denovix	DS-11	分光光度计
DMEM 培养基	WISENT CORPORATION, 中国	319-005-CL
DMEM/F-12 培养基	Gibco, America	11320033
EpiQuik CUT&RUN m6A RNA 富集（MeRIP）试剂盒	Epigentek, America	P-9018-24
胎牛血清	WISENT CORPORATION, 中国	086-150
hFOB1.19	中国科学院细胞库，中国	GNHu14
m6A RNA 甲基化检测试剂盒	Abcam, England	ab185912
microRNA 反转录试剂盒	EZBioscience-EZB, America	A0010CGQ
实时定量 PCR 系统	BIO-RAD, America	CFX96
总 RNA 提取试剂盒	EZBioscience-EZB, America	B0004DP
TrypLE Express 酶	Gibco, America	12604021