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用于组织工程应用的人类皮肤细胞中隧道纳米管的标准化检测方法

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DOI：

10.3791/69883

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2026年1月13日

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1Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, 3Ningbo Savaid Stomatology and Otolaryngology Medical Institute, Ningbo ENT Hospital, 4Department of Urology, the Affiliated People's Hospital of Ningbo University

本文内容

摘要

本文展示了一种标准化的实验方案，通过膜和F-肌动蛋白标记结合z轴层扫共聚焦成像技术，可视化人表皮角质形成细胞与真皮成纤维细胞之间的隧道纳米管，并可选择性地进行α-微管蛋白共染色，从而实现可重复的检测及细胞骨架特征分析，适用于组织工程研究。

摘要

隧道纳米管（TNTs）是基于肌动蛋白的细长细胞间通道，可介导细胞器和信号分子的长距离转移。尽管已在多种细胞类型中广泛报道，但在人类皮肤细胞中其存在尚未得到充分描述。本文介绍了一种用于检测和表征隧道纳米管的标准实验方案 体外 人表皮角质形成细胞与真皮成纤维细胞之间。该方法包括原代细胞共培养体系的建立、轻柔固定以保存脆弱的膜纳米管（TNTs）、利用麦芽凝集素（wheat germ agglutinin）进行膜标记、鬼笔环肽（phalloidin）标记F-肌动蛋白（F-actin），以及通过倒置共聚焦显微镜进行系统的z轴层扫成像，以区分悬浮于基质上方的TNTs与贴附性的丝状伪足。可选的α-微管蛋白（α-tubulin）免疫荧光染色可用于评估微管是否参与TNTs结构。TNTs的鉴定依据三个特征：连接两个或多个细胞的细长、直行突起；含有F-肌动蛋白；在连续光学切片中跨越细胞对保持结构连续性。代表性结果展示了连接真皮-真皮、表皮-表皮以及真皮-表皮细胞对的TNTs，其细胞骨架组成具有异质性（仅含F-actin，或同时含有F-actin与α-tubulin）。关键实验步骤包括轻柔固定、使用新鲜试剂，以及采集足够数量的z轴层面以避免误判；常见的技术伪影包括TNT断裂和染色不完全。综上，这些优化步骤可实现皮肤细胞系统中TNTs的可重复检测 为未来研究隧道纳米管介导的皮肤生物学与再生中的通讯提供了方法学基础。

引言

隧道纳米管（TNTs）是基于肌动蛋白的纳米级通道，可实现细胞器和信号分子的直接细胞间转移。它们通常长度为6-100 µm，直径为50-500 nm，某些甚至可达700 nm厚1。与空的膜突起不同，TNTs含有细胞骨架丝，最常见的是F-肌动蛋白，可提供结构刚性并支持线粒体运输2,3,4。在二维培养条件下，TNTs具有三个定义特征：细长（20-700 nm）、呈直线状且悬浮于基质上方、连接两个或多个细胞的突起；存在F-肌动蛋白丝；以及具备运输 cargo 的能力。

自从 Rustom 等人首次在 PC-12 细胞中发现膜纳米管（TNTs）以来5，TNTs 已在多个系统中得到研究，包括心血管系统6、免疫系统7、呼吸系统8、角膜上皮9、肿瘤10以及神经系统11,12。TNTs 参与多种生理和病理过程，如免疫信号传导、细胞凋亡、物质运输和血管生成13,14,15。TNTs 可介导多种物质的长距离转移，包括线粒体、内质网、核酸、离子，甚至病毒5,16,17。

皮肤是一个结构复杂的器官，其表皮和真皮依赖持续的相互通讯来维持稳态、伤口愈合以及附属器再生18,19,20。尽管膜纳米管（TNTs）已在多种组织中被报道，包括免疫系统、神经系统以及角膜上皮7,9,12，但在已发表的文献中尚未见关于其存在于人类皮肤细胞中的报道。在Sáenz-de-Santa-María等人所描述的方法学框架基础上21，我们提出了一种标准化且经过优化的实验方案，通过免疫荧光染色结合倒置共聚焦显微镜技术，用于检测表皮角质形成细胞与真皮成纤维细胞之间的膜纳米管22。

与其它TNT检测方法相比，本方案在灵敏度和可及性之间提供了实用的平衡。活细胞成像能够捕捉TNT的动态过程，但受限于光毒性以及TNT寿命较短的特性1,23。电子显微镜可提供超微结构细节，但通常难以完整保存较长的TNT结构，且不适用于原代皮肤细胞的常规分析24,25。基于报告基因的纳米管系统可实现对TNT的实时追踪，但需要进行基因操作，而这类操作在原代角质形成细胞和成纤维细胞中通常效率较低24,26。相比之下，本方案采用标准的免疫荧光染色和共聚焦显微镜技术，可在独立制备的皮肤细胞培养物中实现可重复的TNT检测，同时保持对脆弱的原代细胞的兼容性。

该方法特别适用于关注细胞骨架组成和膜纳米管（TNT）存在情况的固定样本分析。由于膜纳米管极为脆弱，固定和操作步骤仍是主要的技术限制，该方法无法捕捉膜纳米管的实时动态变化。然而，对于从事原代人皮肤细胞研究的实验室而言，这一标准化操作流程提供了一种简便且一致的膜纳米管可视化方法，并有助于后续在组织工程与再生医学领域中对其潜在功能开展研究。

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方案

本研究中使用的所有皮肤细胞均为先前冻存的原代细胞，这些细胞分离自包皮环切手术中获取的人类皮肤组织废弃样本，并已完全去标识化22。人类皮肤样本的获取工作在宁波大学附属人民医院泌尿外科完成，研究方案经机构伦理委员会批准（方案编号：2024104；批准日期：2024年10月30日）。

1. 人原代皮肤表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞中隧道纳米管（TNTs）的鉴定

  1. 溶液配制
    1. 通过加入4%多聚甲醛（PFA）（100 µL）、2.5%戊二醛（4 µL）、1 M HEPES（40 µL）和1×PBS（56 µL）配制固定液1（200 µL）。使用前新鲜配制并预热至37 °C。
    2. 通过加入8%多聚甲醛（PFA）（100 µL）、1 M HEPES（0.4 µL）和1×PBS（99.6 µL）配制固定液2（200 µL）。使用前新鲜配制并预热至37 °C。
    3. 通过加入8%多聚甲醛（PFA）（100 µL）、2.5%戊二醛（4 µL）和1×PBS（96 µL）配制固定液3（200 µL）。使用前新鲜配制并预热至37 °C。
  2. 细胞培养
    1. 解冻人表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞，并在60 mm培养皿中使用适当的生长培养基进行培养。复苏期间，在角质形成细胞培养基中添加Y-27632，终浓度为5 µM。将细胞在37 °C、湿润培养箱中培养至汇合度约80%。
    2. 移除培养基，用1 mL 1×PBS短暂洗涤细胞（用于维持洗涤过程中的生理pH和渗透压），吸除PBS。
    3. 加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，均匀分布后于37 °C孵育1.5–2.5分钟。
    4. 用移液器轻柔重悬细胞，加入2 mL生长培养基，转移至15 mL离心管中，在室温下以200 × g离心5分钟。
    5. 弃去上清液，将沉淀重悬于1–2 mL培养基中，使用自动细胞计数仪计数细胞。
    6. 在8孔腔室载玻片的每个孔中接种12,000个真皮成纤维细胞或20,000个角质形成细胞，终体积为400 µL。接种后轻轻交叉摇动腔室孔，使细胞均匀分布。于37 °C孵育约24小时。
    7. 孵育约24小时后，在显微镜下观察细胞汇合度。若达到约80%，则进行后续固定步骤。
  3. 固定
    1. 当细胞培养至约80%汇合度时，直接向腔室孔中轻轻滴加数滴固定液1，对细胞进行预固定。室温孵育4分钟。确保固定液均匀覆盖而不扰动细胞。
      注意：操作需谨慎，避免破坏膜纳米管（TNTs）。由于固定液含有PFA和戊二醛等有毒成分，操作时务必佩戴防护手套、防护服和口罩，并在通风橱中进行。操作后应彻底洗手。PFA和戊二醛废液应分别收集于贴有标签的容器中，按危险化学品处理。
    2. 吸除预固定液，加入140 µL新鲜的固定液1，确保完全覆盖整个孔。于37 °C孵育15分钟。
    3. 移除固定液1，加入140 µL固定液2。于37 °C孵育15分钟。确保溶液完全覆盖细胞，以维持均匀固定。
    4. 移除固定液，加入140 µL 100 mM NH₄Cl以淬灭残余醛基。室温孵育10–30分钟。
    5. 在室温下用1×PBS轻轻沿腔室壁冲洗样品3次，每次30秒，避免冲走细胞或破坏膜纳米管（TNTs）。
  4. 膜和细胞骨架染色
    1. 在避光、室温条件下，用140 µL 1:300（v/v）WGA（麦芽凝集素）-Alexa Fluor偶联物与1×PBS混合液孵育细胞20分钟，该试剂可标记质膜糖蛋白，用于可视化膜来源的膜纳米管（TNTs）。
      注意：后续步骤需在避光环境中进行。
    2. 用1×PBS洗涤3次，每次30秒。在避光、室温条件下，用140 µL以1% BSA稀释1:250（v/v）的鬼笔环肽偶联物孵育30分钟。
    3. 用1×PBS洗涤3次，每次30秒。在避光、室温条件下，用140 µL DAPI溶液孵育5分钟。
    4. 用1×PBS洗涤3次。加入2–3滴封片剂，室温孵育20分钟，随后于4 °C避光保存至少20分钟，待成像。
  5. 成像
    1. 使用配备40倍物镜的倒置共聚焦显微镜采集图像。随机选择视野，从细胞底部至顶部采集Z轴层扫图像（10–20层）。图像采集所用的具体显微镜参数如下：
      共聚焦激光扫描显微镜：ZEISS LSM 900
      激光线：通道1（561 nm，4.0%）、通道2（488 nm，16.0%）、通道3（405 nm，60.0%）
      探测器增益：525 V
      Z轴步进大小：20个光学切片（总深度：5.32 µm）

2. 表皮细胞与真皮细胞的共培养

  1. 按照步骤 1.2.1–1.2.5 准备角质形成细胞和成纤维细胞。
  2. 在每孔 400 µL 培养基中接种 10,000 个角质形成细胞和 6,000 个成纤维细胞。接种后，轻轻横向摇动培养板孔，使细胞均匀分布。于 37 °C 培养 24 小时。
  3. 培养约 24 小时后，在显微镜下观察细胞融合度。若达到约 80%，则进行后续固定步骤。
  4. 按照步骤 1.3–1.4 所述方法固定并染色膜结构。
  5. 使用 0.1% Triton X-100 在室温下处理细胞 3 分钟，以通透细胞膜，便于抗体进入细胞内靶位，随后用 1× PBS 洗涤 3 次。
    注意：0.1% Triton X-100 应在使用前新鲜配制。
    警告：Triton X-100 对水生生物有害，必须作为化学废弃物妥善处理，严禁倒入下水道。
  6. 用含 2% BSA 的 PBS 溶液 140 µL 在室温下封闭 20 分钟，以减少非特异性抗体结合。
    注意：2% BSA 应在使用前新鲜配制。
  7. 在 4 °C 下用抗细胞角蛋白 5 抗体（以 2% BSA 溶液按 1:200 (v/v) 稀释）孵育过夜。
  8. 用 1× PBS 洗涤 3 次，然后在避光条件下于室温下与 Alexa Fluor 594 标记的二抗孵育 1–2 小时。
  9. 用 1× PBS 洗涤 3 次，用 DAPI 染色细胞核，并按照步骤 1.4.5–1.5.2 进行成像。

3. 鉴定隧道纳米管的细胞骨架组分

  1. 细胞培养
    1. 按照步骤 1.2–1.3 培养并固定细胞。室温下用 0.1% Triton X-100 处理 3 分钟进行透化，然后用 1× PBS 洗涤。
    2. 用 2% BSA 在室温下封闭 20 分钟。在 4 °C 下与抗-α-tubulin 抗体孵育过夜。
    3. 用 1× PBS 洗涤 3 次，在室温避光条件下与 Alexa Fluor 标记的二抗孵育 1–2 小时。
      注意：后续步骤需在避光环境中进行。
    4. 用 1× PBS 洗涤 3 次，用鬼笔环肽（phalloidin）标记 F-actin，并按照步骤 1.4.3–1.5 进行成像。
  2. 细胞共培养
    1. 按照步骤 2.1–2.2 准备共培养体系。室温下用固定液 3 固定 15 分钟。
    2. 更换为 140 µL 的 100 mM NH4Cl，室温孵育 10–30 分钟。用 1× PBS 洗涤 3 次。
    3. 首先，按照步骤 2.4–2.8 所述方法，通过透化、封闭及 CK5 免疫染色来鉴定表皮细胞。
    4. 接着，按照步骤 3.1.2–3.1.4 进行 α-tubulin 免疫染色。
    5. 最后，用鬼笔环肽（phalloidin）染色 F-actin，并按照步骤 1.4.2–1.5.2 所述进行成像。

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结果

采用此标准化方案，成功在单培养和共培养条件下的人皮肤细胞中鉴定出隧道纳米管（TNTs）。为验证抗体特异性，在进行实验分析前，对所有抗体均进行了阳性和阴性对照染色，如补充图1、补充图2、补充图3和补充图4所示。代表性图像显示，TNTs可被重复检测为连接细胞之间的细长、含肌动蛋白的通道。

单细胞群体中隧道纳米管（TNTs）的检测
在真皮成纤维细胞培养物中，观察到隧道纳米管（TNTs）为连接相邻细胞的细长突起。通过WGA（绿色）对细胞膜染色以及鬼笔环肽（红色）对F-肌动蛋白标记，确认了其结构特征；TNTs悬浮于基质上方，由黄色箭头指示（图1）。为进一步区分TNTs与贴附于基质的丝状伪足，并提高实验可重复性，基于z轴层扫图像生成了三维（3D）重建图像（补充图5）。类似地，在表皮角质形成细胞培养物中也观察到类似的TNT结构，表现为富含F-肌动蛋白、连接邻近细胞的特征性突起（

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讨论

本方案中的一个关键步骤是在固定和染色过程中保持隧道纳米管（TNTs）的完整性，因为这些结构极为脆弱，容易受到破坏。在固定过程中需轻柔操作，严格控制时间，并使用新鲜的固定剂，这对于维持TNT的结构完整性至关重要。采用Z轴层扫共聚焦成像同样重要，可有效区分悬浮于基质上方的TNTs与黏附性的丝状伪足或其他突起结构，避免误判。这些因素凸显了建立标准化操作流程的必要性，以实现在不同实验室之间对TNT进行可重复的可视化观察，尤其是在皮肤细胞中，此类细胞具有较强的基质黏附性以及显著的肌动蛋白依赖性突起，可能增加TNT识别的复杂性。

固定方案设计了三种不同的溶液，以满足不同的实验需求，在精细结构保存与抗原性之间实现平衡。其核心原则是通过调整成分和步骤，优先保证关键染色靶标的质量。固定液1含有2% PFA、0.05% 戊二醛和HEPES缓冲液，可在固定过程中稳定pH值，从而保护膜的完整性，用于温和的预固定。较低浓度的PFA可轻度稳定整体细胞形态，而极低浓度的戊二醛则可增强与膜相关的结构，保留如麦芽凝集素（WGA）等探针的结合位点。若跳过此步骤，可能导致膜结构损伤及WGA染色不清晰。固定液2含有4% ...

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披露

作者声明无竞争性财务利益。

致谢

本项目由国家自然科学基金（项目编号：82273554）资助。作者感谢宁波口腔医院生物材料与组织再生工程实验室的持续支持，并感谢课题组现任及往届成员的宝贵讨论。作者同时感谢杭州医学院科研实验中心的冯莉老师在使用共聚焦显微镜方面提供的慷慨帮助和大力支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 离心管KIRGENKG2611无菌、无RNase/DNase、无致热原
37 °C孵箱赛默飞世尔科技5103287737摄氏度的CO2培养箱提供了理想的体外环境。
鬼笔环肽-红色-罗丹明BeyotimeC2207sActin-Tracker Red-Rhodamine 探针是一种用罗丹明荧光染料标记的鬼笔环肽，最大激发波长为 540 nm，最大发射波长为 565 nm。
小麦胚芽凝集素（WGA）的Alexa Fluor偶联物分子探针W11261 Alexa Fluor 488 标记物
抗α-微管蛋白抗体Abcamab7291抗α-微管蛋白抗体 - 上样对照 (ab7291) 是一种可检测α-微管蛋白的小鼠单克隆抗体。适用于人、小鼠、大鼠。
抗细胞角蛋白5抗体 Abcamab52635抗细胞角蛋白5抗体 - 细胞骨架标记物 (ab52635) 是一种可检测细胞角蛋白5的兔单克隆抗体。适用于人、小鼠、大鼠。
Aqua-Poly/MountPolysciences18606水溶性非荧光封片剂，专为封固来自水溶液的切片而配制。适用于免疫荧光技术，可增强并保持荧光染色效果。
自动细胞计数仪CountstarIC1000用于快速、精确细胞计数的自动细胞计数仪
台式离心机BIORIDGETD5用于实验室环境中快速高效分离样品的台式离心机
生物安全柜赛默飞世尔科技1379生物安全柜是一种无菌密闭装置，在微生物操作过程中通过过滤空气中的病原体并防止交叉污染，保护操作人员、样品和环境免受生物危害。
牛血清白蛋白（BSA）YOBIBIOU5010-10gBSA 是牛血清中的一种球蛋白，含有 583 个氨基酸残基，分子量为 66.430 kDa，等电点为 4.7
细胞培养皿（60×15 mm）Eppendorf30701119组织培养处理，无菌，无可检测到的热原，无RNase &和 DNase、DNA。
Cellvis Chamber Slide-8孔板CellvisC8-1.5H-N专为共聚焦显微镜等高分辨率成像设计。
DAPI 染色液BeyotimeC1006-10 mLDAPI染色液适用于所有常见细胞和组织的细胞核染色。
山羊抗小鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 405） Abcamab175660山羊抗小鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 405）是一种二抗，其最大吸收波长为401 nm，最大发射波长为421 nm。
山羊抗兔IgG H&与Alexa Fluor 405偶联的amp;LAbcamab175652山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 405）是一种二抗，其最大吸收波长为401 nm，最大发射波长为421 nm。
山羊抗兔IgG H&L 偶联 Alexa Fluor 594Abcamab150080山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 594）是一种二抗，最大吸收波长为590 nm，最大发射波长为617 nm。
倒置共聚焦荧光显微镜LeicaTCS SP8 XLeica SP8 X 激光扫描共聚焦显微镜可提供无与伦比的高分辨率成像，具备先进的荧光检测和活细胞分析功能。
倒置共聚焦荧光显微镜AndorBC43Andor BC43 是一款紧凑型高速共聚焦显微镜，成像速度比传统系统快10倍，支持一键式2D/3D成像
NH4Cl MedChemExpressHY-Y1269 氯化铵作为一种极性化合物用于调节pH。
鬼笔环肽缀合物 Oregon Green™488Life TechnologiesO7466颜色：绿色。激发波长范围：496/520。
磷酸盐缓冲液（PBS）Viva Cell BiosciencesC3582-0500其功能是维持培养基的pH在生理范围内，并保持细胞内外的渗透压平衡。
Triton-X 100SolarbioT8200-100ml它是一种用途广泛的非离子型表面活性剂，可在温和的变性条件下用于恢复膜组分。
胰蛋白酶-EDTA 溶液GIBCO25300054由于其较强的消化能力，胰蛋白酶被广泛用于细胞解离、常规细胞培养传代以及原代组织解离。
Y-27632MedChemExpressHY-10071Y-27632 是一种口服有效的ATP竞争性ROCK-I和ROCK-II抑制剂

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