用于组织工程应用的人类皮肤细胞中隧道纳米管的标准化检测方法

摘要

本文展示了一种标准化的实验方案，通过膜和F-肌动蛋白标记结合z轴层扫共聚焦成像技术，可视化人表皮角质形成细胞与真皮成纤维细胞之间的隧道纳米管，并可选择性地进行α-微管蛋白共染色，从而实现可重复的检测及细胞骨架特征分析，适用于组织工程研究。

摘要

隧道纳米管（TNTs）是基于肌动蛋白的细长细胞间通道，可介导细胞器和信号分子的长距离转移。尽管已在多种细胞类型中广泛报道，但在人类皮肤细胞中其存在尚未得到充分描述。本文介绍了一种用于检测和表征隧道纳米管的标准实验方案 体外 人表皮角质形成细胞与真皮成纤维细胞之间。该方法包括原代细胞共培养体系的建立、轻柔固定以保存脆弱的膜纳米管（TNTs）、利用麦芽凝集素（wheat germ agglutinin）进行膜标记、鬼笔环肽（phalloidin）标记F-肌动蛋白（F-actin），以及通过倒置共聚焦显微镜进行系统的z轴层扫成像，以区分悬浮于基质上方的TNTs与贴附性的丝状伪足。可选的α-微管蛋白（α-tubulin）免疫荧光染色可用于评估微管是否参与TNTs结构。TNTs的鉴定依据三个特征：连接两个或多个细胞的细长、直行突起；含有F-肌动蛋白；在连续光学切片中跨越细胞对保持结构连续性。代表性结果展示了连接真皮-真皮、表皮-表皮以及真皮-表皮细胞对的TNTs，其细胞骨架组成具有异质性（仅含F-actin，或同时含有F-actin与α-tubulin）。关键实验步骤包括轻柔固定、使用新鲜试剂，以及采集足够数量的z轴层面以避免误判；常见的技术伪影包括TNT断裂和染色不完全。综上，这些优化步骤可实现皮肤细胞系统中TNTs的可重复检测 为未来研究隧道纳米管介导的皮肤生物学与再生中的通讯提供了方法学基础。

引言

隧道纳米管（TNTs）是基于肌动蛋白的纳米级通道，可实现细胞器和信号分子的直接细胞间转移。它们通常长度为6-100 µm，直径为50-500 nm，某些甚至可达700 nm厚¹。与空的膜突起不同，TNTs含有细胞骨架丝，最常见的是F-肌动蛋白，可提供结构刚性并支持线粒体运输^2,3,4。在二维培养条件下，TNTs具有三个定义特征：细长（20-700 nm）、呈直线状且悬浮于基质上方、连接两个或多个细胞的突起；存在F-肌动蛋白丝；以及具备运输 cargo 的能力。

自从 Rustom 等人首次在 PC-12 细胞中发现膜纳米管（TNTs）以来⁵，TNTs 已在多个系统中得到研究，包括心血管系统⁶、免疫系统⁷、呼吸系统⁸、角膜上皮⁹、肿瘤¹⁰以及神经系统^11,

方案

本研究中使用的所有皮肤细胞均为先前冻存的原代细胞，这些细胞分离自包皮环切手术中获取的人类皮肤组织废弃样本，并已完全去标识化²²。人类皮肤样本的获取工作在宁波大学附属人民医院泌尿外科完成，研究方案经机构伦理委员会批准（方案编号：2024104；批准日期：2024年10月30日）。

1. 人原代皮肤表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞中隧道纳米管（TNTs）的鉴定

1. 溶液配制
   1. 通过加入4%多聚甲醛（PFA）（100 µL）、2.5%戊二醛（4 µL）、1 M HEPES（40 µL）和1×PBS（56 µL）配制固定液1（200 µL）。使用前新鲜配制并预热至37 °C。
   2. 通过加入8%多聚甲醛（PFA）（100 µL）、1 M HEPES（0.4 µL）和1×PBS（99.6 µL）配制固定液2（200 µL）。使用前新鲜配制并预热至37 °C。
   3. 通过加入8%多聚甲醛（PFA）（100 µL）、2.5%戊二醛（4 µL）和1×PBS（96 µL）配制固定液3（200 µL）。使用前新鲜配制并预热至37 °C。
2. 细胞培养
   1. 解冻人表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞，并在60 mm培养皿中使用适当的生长培养基进行培养。复苏期间，在角质形成细胞培养基中添....

结果

采用此标准化方案，成功在单培养和共培养条件下的人皮肤细胞中鉴定出隧道纳米管（TNTs）。为验证抗体特异性，在进行实验分析前，对所有抗体均进行了阳性和阴性对照染色，如补充图1、补充图2、补充图3和补充图4所示。代表性图像显示，TNTs可被重复检测为连接细胞之间的细长、含肌动蛋白的通道。

单细胞群体中隧道纳米管（TNTs）的检测
在真皮成纤维细胞培养物中，观察到隧道纳米管（TNTs）为连接相邻细胞的细长突起。通过WGA（绿色）对细胞膜染色以及鬼笔环肽（红色）对F-肌动蛋白标记，确认了其结构特征；TNTs悬浮于基质上方，由黄色箭头指示（图1）。为进一步区分TNTs与贴附于基质的丝状伪足，并提高实验可重复性，基于z轴层扫图像生成了三维（3D）重建图像（补充图5）。类似地，在表皮角质形成细胞培养物中也观察到类似的TNT结构，表现为富含F-肌动蛋白、连接邻近细胞的特征性突起（

讨论

本方案中的一个关键步骤是在固定和染色过程中保持隧道纳米管（TNTs）的完整性，因为这些结构极为脆弱，容易受到破坏。在固定过程中需轻柔操作，严格控制时间，并使用新鲜的固定剂，这对于维持TNT的结构完整性至关重要。采用Z轴层扫共聚焦成像同样重要，可有效区分悬浮于基质上方的TNTs与黏附性的丝状伪足或其他突起结构，避免误判。这些因素凸显了建立标准化操作流程的必要性，以实现在不同实验室之间对TNT进行可重复的可视化观察，尤其是在皮肤细胞中，此类细胞具有较强的基质黏附性以及显著的肌动蛋白依赖性突起，可能增加TNT识别的复杂性。

固定方案设计了三种不同的溶液，以满足不同的实验需求，在精细结构保存与抗原性之间实现平衡。其核心原则是通过调整成分和步骤，优先保证关键染色靶标的质量。固定液1含有2% PFA、0.05% 戊二醛和HEPES缓冲液，可在固定过程中稳定pH值，从而保护膜的完整性，用于温和的预固定。较低浓度的PFA可轻度稳定整体细胞形态，而极低浓度的戊二醛则可增强与膜相关的结构，保留如麦芽凝集素（WGA）等探针的结合位点。若跳过此步骤，可能导致膜结构损伤及WGA染色不清晰。固定液2含有4% .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 离心管	KIRGEN	KG2611	无菌、无RNase/DNase、无致热原
37 °C孵箱	赛默飞世尔科技	51032877	37摄氏度的CO2培养箱提供了理想的体外环境。
鬼笔环肽-红色-罗丹明	Beyotime	C2207s	Actin-Tracker Red-Rhodamine 探针是一种用罗丹明荧光染料标记的鬼笔环肽，最大激发波长为 540 nm，最大发射波长为 565 nm。
小麦胚芽凝集素（WGA）的Alexa Fluor偶联物	分子探针	W11261	Alexa Fluor 488 标记物
抗α-微管蛋白抗体	Abcam	ab7291	抗α-微管蛋白抗体 - 上样对照 (ab7291) 是一种可检测α-微管蛋白的小鼠单克隆抗体。适用于人、小鼠、大鼠。
抗细胞角蛋白5抗体	Abcam	ab52635	抗细胞角蛋白5抗体 - 细胞骨架标记物 (ab52635) 是一种可检测细胞角蛋白5的兔单克隆抗体。适用于人、小鼠、大鼠。
Aqua-Poly/Mount	Polysciences	18606	水溶性非荧光封片剂，专为封固来自水溶液的切片而配制。适用于免疫荧光技术，可增强并保持荧光染色效果。
自动细胞计数仪	Countstar	IC1000	用于快速、精确细胞计数的自动细胞计数仪
台式离心机	BIORIDGE	TD5	用于实验室环境中快速高效分离样品的台式离心机
生物安全柜	赛默飞世尔科技	1379	生物安全柜是一种无菌密闭装置，在微生物操作过程中通过过滤空气中的病原体并防止交叉污染，保护操作人员、样品和环境免受生物危害。
牛血清白蛋白（BSA）	YOBIBIO	U5010-10g	BSA 是牛血清中的一种球蛋白，含有 583 个氨基酸残基，分子量为 66.430 kDa，等电点为 4.7
细胞培养皿（60×15 mm）	Eppendorf	30701119	组织培养处理，无菌，无可检测到的热原，无RNase &和 DNase、DNA。
Cellvis Chamber Slide-8孔板	Cellvis	C8-1.5H-N	专为共聚焦显微镜等高分辨率成像设计。
DAPI 染色液	Beyotime	C1006-10 mL	DAPI染色液适用于所有常见细胞和组织的细胞核染色。
山羊抗小鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 405）	Abcam	ab175660	山羊抗小鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 405）是一种二抗，其最大吸收波长为401 nm，最大发射波长为421 nm。
山羊抗兔IgG H&与Alexa Fluor 405偶联的amp;L	Abcam	ab175652	山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 405）是一种二抗，其最大吸收波长为401 nm，最大发射波长为421 nm。
山羊抗兔IgG H&L 偶联 Alexa Fluor 594	Abcam	ab150080	山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 594）是一种二抗，最大吸收波长为590 nm，最大发射波长为617 nm。
倒置共聚焦荧光显微镜	Leica	TCS SP8 X	Leica SP8 X 激光扫描共聚焦显微镜可提供无与伦比的高分辨率成像，具备先进的荧光检测和活细胞分析功能。
倒置共聚焦荧光显微镜	Andor	BC43	Andor BC43 是一款紧凑型高速共聚焦显微镜，成像速度比传统系统快10倍，支持一键式2D/3D成像
NH4Cl	MedChemExpress	HY-Y1269	氯化铵作为一种极性化合物用于调节pH。
鬼笔环肽缀合物 Oregon Green™488	Life Technologies	O7466	颜色：绿色。激发波长范围：496/520。
磷酸盐缓冲液（PBS）	Viva Cell Biosciences	C3582-0500	其功能是维持培养基的pH在生理范围内，并保持细胞内外的渗透压平衡。
Triton-X 100	Solarbio	T8200-100ml	它是一种用途广泛的非离子型表面活性剂，可在温和的变性条件下用于恢复膜组分。
胰蛋白酶-EDTA 溶液	GIBCO	25300054	由于其较强的消化能力，胰蛋白酶被广泛用于细胞解离、常规细胞培养传代以及原代组织解离。
Y-27632	MedChemExpress	HY-10071	Y-27632 是一种口服有效的ATP竞争性ROCK-I和ROCK-II抑制剂