本研究采用行为学、生物力学、影像学和组织学方法，评估瓜蒌桂枝解痉颗粒（GLGZ）对脊髓损伤（SCI）所致痉挛状态的影响，并探讨其与PAN凋亡相关的作用机制。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
研究文章
* These authors contributed equally
本研究采用行为学、生物力学、影像学和组织学方法，评估瓜蒌桂枝解痉颗粒（GLGZ）对脊髓损伤（SCI）所致痉挛状态的影响，并探讨其与PAN凋亡相关的作用机制。
脊髓损伤（SCI）后的肌肉痉挛严重影响生活质量，但目前有效的治疗方法有限。栝蒌桂枝解痉颗粒（GLGZ）是一种医院研发的中药制剂，具有缓解痉挛的作用。本研究旨在评估GLGZ在脊髓损伤所致痉挛中的疗效及其与PAN凋亡（一种涉及凋亡、坏死性凋亡和焦亡的新型程序性细胞死亡）之间的关联。
选用体重为180-200 g的雄性Sprague-Dawley大鼠。采用Allen重物坠落法诱导脊髓损伤（SCI）。造模成功的动物被随机分配至模型组或GLGZ不同剂量组（高、中、低剂量组）。假手术组大鼠仅接受椎板切除术，但不造成脊髓损伤。干预持续4周。干预结束后，采用Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）评分评估肢体运动功能。通过超声剪切波弹性成像（SWE）检测股四头肌僵硬度，利用磁共振成像（MRI）评估脊髓结构完整性。采用苏木精-伊红（HE）、尼氏（Nissl）及Luxol快蓝染色观察组织病理学改变。通过多重免疫荧光染色标记含CARD的凋亡相关斑点样蛋白（ASC，绿色）、Caspase-8（橙色）以及受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3（RIPK3，黄色），以评估PANoptosis水平。
GLGZ 呈剂量依赖性改善 BBB 评分：假手术组（21.00 ± 0.00），模型组（5.8 ± 1.1），高剂量组（10.6 ± 1.3），中剂量组（8.5 ± 1.2），低剂量组（7.1 ± 1.0）。剪切波弹性成像（SWE）显示肌肉僵硬度降低：模型组（6.68 ± 0.74 m/s），高剂量组（2.19 ± 0.36 m/s，P < 0.001），中剂量组（3.04 ± 0.45 m/s，P = 0.002），低剂量组（4.08 ± 0.65 m/s，P = 0.031），均较模型组降低。与模型组（3.65 ± 1.03 mm²）相比，GLGZ 在所有剂量组中均呈剂量依赖性减小脊髓病变面积（所有 P < 0.05），其中高剂量组为 1.33 ± 0.79 mm²，中剂量组为 1.94 ± 0.67 mm²，低剂量组为 2.50 ± 0.79 mm²。组织学结果显示，GLGZ 可保护神经元并促进髓鞘修复。GLGZ 呈剂量依赖性降低 ASC、Caspase-8 和 RIPK3 的表达。
肌肉痉挛是脊髓损伤（SCI）的常见并发症，严重影响患者的生活质量。其病理过程包括最初的机械性损伤、继发性炎症、氧化应激、细胞凋亡以及神经再生障碍等1,2。目前的治疗方法（手术减压、药物治疗、康复治疗）疗效有限，且长期用药会导致耐药性等副作用3。因此，探索新的发病机制和治疗策略至关重要。
近期研究发现，PAN凋亡（PANoptosis）是一种整合了凋亡（caspase依赖性）、坏死性凋亡（RIPK3/MLKL依赖性）和焦亡（caspase-8/GSDMD依赖性）的程序性细胞死亡形式4，是脊髓损伤（SCI）继发性损伤的关键病理机制。ASC、caspase-8和RIPK3的异常活化可导致神经元丢失和胶质瘢痕形成，从而加重痉挛症状5。因此，靶向调控PAN凋亡已成为阻断SCI继发性损伤级联反应的一种有前景的策略4。
由于具有多靶点作用（例如抗炎、抗氧化应激），传统中药（TCM）在神经系统疾病领域受到关注6。瓜蒌桂枝解痉颗粒（GLGZ）源自张仲景《金匮要略》，并经优化制成医院制剂7。其成分包括天花粉（Trichosanthes kirilowii）、桂枝（Cinnamomum cassia）、白芍（Paeonia lactiflora）、甘草（Glycyrrhiza uralensis）、大枣和生姜8。初步研究表明，GLGZ可通过调节神经递质和抑制炎症反应，缓解中枢神经系统损伤后的痉挛症状9。然而，其对脊髓损伤（SCI）所致痉挛的影响，以及与PAN凋亡（PANoptosis）之间可能存在的关联，尚不明确。
与单靶点的传统药物不同，GLGZ 的多组分特性与脊髓损伤（SCI）复杂的病理网络相契合——可同时干预炎症反应、神经元丢失、髓鞘损伤以及潜在的 PAN 凋亡过程。本研究假设 GLGZ 通过促进脊髓病理修复（减轻炎症、保护神经元、修复髓鞘）并抑制 PAN 凋亡，从而改善 SCI 大鼠的肌肉痉挛症状。通过验证该假设，我们旨在为 GLGZ 作为一种兼具症状缓解与核心病理修复作用的潜在治疗策略提供实验依据。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
动物模型构建
本研究经福建中医药大学附属第二人民医院伦理委员会批准（批准号：FJPSPH-IAEC2024114），并依照动物福利指南进行。选用雄性Sprague-Dawley大鼠，体重180–200 g，在温度22–26°C、湿度40–70%的受控环境中饲养。采用Allen重物坠落法诱导脊髓损伤（SCI）10：3–4%异氟烷吸入麻醉，T10节段正中切口，暴露T9–T11脊髓节段，行椎板切除术（硬脊膜完整），随后进行打击损伤（探头直径2 mm，速度0.5 m/s，深度1.3 mm，持续时间1 s）。假手术组大鼠仅接受椎板切除术而不施加打击。纳入标准：术后24 h BBB评分<8；排除标准：感染、脊髓完全横断。术后护理包括镇痛（皮下注射布托啡诺，0.1 mg/kg，每12 h一次，持续3天）、膀胱排空（每6 h一次，持续1周）以及无菌伤口护理。成功建模的大鼠被随机分配至模型组、GLGZ高剂量组（2.32 g/kg，n = 10）、中剂量组（1.16 g/kg，n = 10）和低剂量组（0.58 g/kg，n = 10）。
运动功能分析
采用盲法进行Basso、Beattie和Bresnahan（BBB）评分。将大鼠置于开放场地中观察5分钟，评估后肢关节运动、负重能力、步态及协调性。
剪切波弹性成像测量股直肌硬度
使用配备线阵探头（18L6）的多普勒超声系统。将大鼠置于侧卧位（肌肉放松状态）。将探头垂直于肌肉（90°角）放置，探测深度为1–2 cm，进行剪切波弹性成像（SWE）。感兴趣区域（ROI）设置为0.5 × 0.5 cm，每次测量采集十帧图像。最终硬度值取三次有效测量的平均值。记录剪切波速度（SWV）；绿色质量控制提示表示图像有效11。
MRI 检查
使用 7.0 T 扫描仪结合 T2 加权脂肪抑制序列及动物专用线圈进行 MRI 扫描。扫描参数如下：重复时间（TR）3,800 ms，回波时间（TE）72 ms，层厚 1 mm，体素大小 0.1 × 0.1 × 1 mm，矩阵 256 × 256，视野（FOV）25.6 × 25.6 mm，信号平均次数为 4 次，并采用呼吸门控。病灶区域通过图像处理软件进行测量。
组织学染色
通过依次进行脱蜡、复水、苏木精染色5分钟、流水冲洗、1%盐酸乙醇分化30秒、伊红染色2分钟、脱水、透明和封片来进行苏木精-伊红（HE）染色。作为可视化质控点，染色切片显示细胞核呈蓝色，细胞质呈红色。
尼氏染色通过脱蜡、复水、在50-60 °C下用0.1%甲苯胺蓝孵育30分钟，随后用蒸馏水冲洗、乙醇分化、脱水、透明和封片完成。作为可视化质控点，假手术组中可清晰观察到深蓝色的尼氏体。
Luxol 快蓝-焦油紫染色步骤如下：脱蜡、复水、在 60 °C 下用 Luxol 快蓝孵育 2 小时、用 95% 乙醇冲洗、碳酸锂分化 30 秒，随后用 70% 乙醇进一步分化、焦油紫复染 10 分钟、脱水、透明和封片。焦油紫的工作浓度为 0.1%。作为视觉质控点，假手术组中可见深蓝色的髓鞘。
多重免疫荧光染色从脱蜡、复水开始，随后使用柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）在95 °C下进行抗原修复20分钟。切片用3%过氧化氢处理10分钟，接着在37 °C下用5% BSA封闭1小时。一抗在4 °C下孵育过夜（ASC：1:500；Caspase-8：1:400；RIPK3：1:500）。用PBS-T（0.1% Tween-20）洗涤（3次，每次5分钟）后，切片在37 °C下与HRP标记的二抗（1:1000）孵育1小时。随后进行荧光染料标记：ASC使用YTR520 Plus，Caspase-8使用TYR570 Plus，RIPK3使用TYR690 Plus（各30分钟），接着用DAPI染核5分钟。切片封片后，使用荧光显微镜成像，曝光时间设为500 ms，增益1.0，放大倍数×200，并匹配相应荧光染料的滤光片组。
对于二甲苯和乙醇，所有操作均在通风橱中进行，并在使用时佩戴手套和护目镜。对于染色试剂，严格避免与皮肤直接接触。所有废弃试剂均需弃置于指定的危险废物容器中。对于生物危害材料，在最终处理前必须进行彻底的高压灭菌，以防止潜在的生物污染。
统计分析
组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）结合LSD事后检验。P < 0.05 被认为具有统计学显著性。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
BBB 评分
假手术组的 BBB 评分为 21.00 ± 0.00，显著高于模型组（5.8 ± 1.1，P < 0.001）。GLGZ 呈剂量依赖性提高 BBB 评分：高剂量组（10.6 ± 1.3，P < 0.001）、中剂量组（8.5 ± 1.2，P = 0.003）、低剂量组（7.1 ± 1.0，P = 0.028）与模型组相比均有所升高（图 1）。
股直肌硬度的剪切波弹性成像分析
剪切波弹性成像（SWE）可通过彩色图谱和数值反映肌肉硬度的变化。左侧图像为质量控制图，其中绿色表示图像质量良好；右侧图像显示肌肉硬度的彩色标尺，较高硬度以红色或黄色区域表示，较低硬度以蓝色或绿色区域表示。假手术组的SWV为1.27 ± 0.31 m/s。模型组SWV（6.68 ± 0.74 m/s）显著升高（P < 0.001）。GLGZ可降低SWV：高剂量组（2.19 ± 0.36 m/s，P < 0.001）、中剂量组（3.04...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本研究系统评估了GLGZ对脊髓损伤（SCI）大鼠肌肉痉挛的改善作用，并探讨了其与神经保护及PAN凋亡（PANoptosis）之间的关系。结果表明，GLGZ能够以剂量依赖的方式改善SCI大鼠的BBB评分并减轻肌肉僵硬。研究还发现，GLGZ的作用机制可能与神经保护、髓鞘修复以及PAN凋亡的抑制有关。目前，临床针对SCI后肌肉痉挛的药物治疗主要以缓解症状为主，未能解决脊髓损伤的核心病理问题。本研究通过动物实验证实，GLGZ不仅可有效改善肌肉痉挛症状，还能靶向脊髓损伤的核心病理过程实现修复，为GLGZ用于治疗脊髓损伤提供了实验依据。
实验结果表明，GLGZ 显著改善了脊髓损伤（SCI）大鼠的 Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）评分。与模型组相比，高、中、低剂量组的 BBB 评分分别提高了 82.76%、46.55% 和 22.41%，呈现出剂量依赖性效应。这些结果提示，GLGZ 能有效增强 SCI 大鼠的肢体运动功能。采用剪切波弹性成像对股直肌僵硬度进行定量评估，进一步证实 GLGZ 以剂量依赖方式降低了肌肉僵硬度。与模型组（6.68 ± 0.74 m/s）相比，各剂...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者声明无任何利益冲突。
本工作由福建省卫生健康委员会重大科研项目（2024ZD01006）、2023年临床医学研究中心开放项目（LC2023001-研究所）、福建省自然科学基金（2024J01733）、福建省卫生健康委员会医学创新研究项目（2022CXA052）以及福建中医药大学重大科技创新项目“清单式”领军人才引进项目（XJB2022003-3）资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 无水乙醇 | 240403A1 | 脱水 | |
| 无水乙醇 | 241101A1 | 染色 | |
| 抗荧光淬灭封片剂（含DAPI） | MA0221 | 免疫荧光染色 | |
| ASC抗体 | Bs-6741R | PAN凋亡分析（1:300） | |
| Caspase-8抗体 | 13423-1-AP | PAN凋亡分析（1:400） | |
| 荧光显微镜 | NIKON | ECLIPSECi-L | |
| 全自动数字玻片扫描仪 | GCell-60 | 玻片扫描仪 | |
| 苏木精-伊红染色试剂盒 | R23718 | 苏木精-伊红（HE）染色 | |
| 图像分析软件 | NIH | ImageJ 1.53k | |
| 劳克坚蓝 | R23193 | 劳克坚蓝-焦油紫染色 | |
| MRI扫描仪 | Bruker | 7.0T | |
| 多重荧光染色试剂盒 | 240522 | 免疫荧光染色 | |
| 髓系细胞染色试剂盒 | G3245 | 髓系染色 | |
| 中性树胶 | MB9899 | 染色后封片 | |
| 尼氏染色试剂盒 | R23093 | 尼氏染色 | |
| RIPK3抗体 | Bs-3551R | PAN凋亡分析（1:400） | |
| SPSS 22.0 | 统计分析软件 | ||
| Sprague-Dawley大鼠 | 福州航益生物科技有限公司 | ||
| 酒石酸、三聚磷酸钠 | 10019418 | 染色 | |
| 超声系统 | SIEMENS Acuson | 线阵探头（18L6） | |
| 二甲苯 | 240904A2 | 染色 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。