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方法文章

长链非编码RNA敲低骨肉瘤细胞增殖能力的克隆形成实验检测

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DOI：

10.3791/69910

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2026年1月16日

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1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本实验方案提供了一种稳定、经济且高效的方法，将长链非编码RNA敲低与集落形成实验相结合，以定量分析长链非编码RNA对骨肉瘤细胞增殖的影响。

摘要

异常表达的长链非编码RNA（lncRNA）对骨肉瘤细胞的细胞增殖具有显著影响，提示其可能作为潜在的治疗靶点。然而，目前对lncRNA的功能研究仍主要停留在理论层面，且仅限于少数验证性实验。集落形成实验能够特异性地反映单个细胞最终的增殖命运，被公认为评估长期增殖潜能的金标准。本文建立了一种基于lncRNA敲低细胞的集落形成实验的可靠实验方案，用于评价lncRNA对骨肉瘤细胞增殖能力的影响。该实验方案提供了一种稳定、经济且高效的检测方法，可用于评估lncRNA对骨肉瘤细胞增殖的调控作用。该方法不仅适用于骨肉瘤细胞的研究，也可作为研究其他肿瘤中lncRNA调控细胞增殖能力的可行工具。本研究包含lncRNA敲低及集落形成实验的详细检测流程，并以小核仁RNA宿主基因6（SNHG6）在骨肉瘤细胞（143B）中的敲低为例进行了演示。实验结果证实，SNHG6的表达被有效抑制，同时集落的数量和大小均显著减少。这些发现表明，SNHG6对维持骨肉瘤细胞（143B）的长期增殖潜能具有重要作用。

引言

长链非编码RNA（lncRNA）是指长度超过200个核苷酸且无蛋白质编码潜能的转录本，近年来已被确认为调控多种生物学过程的重要分子1,2。它们在包括骨肉瘤、前列腺癌和肺癌在内的多种癌症的发生和发展中发挥关键作用3,4,5。在骨肉瘤中，越来越多的证据表明，lncRNA表达异常对细胞增殖具有显著影响。例如，沉默lncRNA POU3F3可显著抑制骨肉瘤细胞（MG63和U2OS）的增殖，并促进其凋亡6。类似地，敲低lncRNA HOXA-AS3可减少U2OS和SW1353细胞的克隆形成并抑制其生长7。鉴于不受控制的细胞增殖是癌症生物学的标志性特征，也是决定治疗策略的主要因素，阐明lncRNA调控的肿瘤细胞增殖机制，尤其是在骨肉瘤中的作用，仍具有重要的科学意义和必要性。

尽管已有多种方法可用于评估细胞增殖，但每种方法均存在固有的局限性。比色法或代谢法检测（如CCK-8和MTT）操作简便、快速，通量高，但主要提供短期读数，易受细胞代谢波动干扰，且所用试剂可能产生光学或光化学干扰风险8。基于DNA合成的方法（包括BrdU和EdU掺入）特异性更高，但仅能反映S期进入的瞬时状态，无法体现长期增殖结果9,10。类似地，针对增殖标志物（如Ki-67）的免疫染色仅能指示细胞周期的瞬时活性，无法预测克隆形成能力10。实时监测系统（如RTCA）可实现高重复性的连续生长曲线分析，但其成本高昂，且仅适用于短期或中期评估，实用性受限11。相比之下，克隆形成实验能够独特地捕捉单个细胞无限增殖并形成可见克隆的能力，从而直接反映其最终命运。尽管该方法耗时且劳动强度大，克隆形成实验仍是评估长期增殖潜能的金标准，其所提供的信息是短期或替代性检测方法无法获得的12。

本文包含长链非编码RNA（lncRNA）敲低及克隆形成实验的详细检测方案，并以143B骨肉瘤细胞中SNHG6的敲低为例进行说明。该方法不仅适用于骨肉瘤研究，也可作为研究其他肿瘤中lncRNA介导的细胞增殖的可行工具。

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方案

所用试剂和设备列于材料表中。

1. 质粒转染

  1. 将143B细胞以每10 cm培养皿5 × 105个细胞的密度接种（共两皿），在37 °C、5% CO2的培养箱中，使用完全培养基（DMEM + 10% FBS）进行培养。
  2. 24小时后准备转染试剂，包括质粒（shNC和shSNHG6）、PEI以及Opti-MEM。
    注意：使用前需涡旋混匀，并确保所有试剂均已平衡至室温。
  3. 取出四个1.5 mL微量离心管，用记号笔标记质粒管（shNC和shSNHG6）以及PEI管（两管）。
  4. 向每根离心管中加入500 µL Opti-MEM。
  5. 向质粒管（shNC或shSNHG6）中加入10 µg质粒，向每根PEI管中加入30 µL PEI（1 µg/µL）。
  6. 轻轻上下混匀，室温孵育5分钟。
  7. 将质粒管与PEI管中的液体合并，轻轻混匀后，室温孵育20分钟。
  8. 从培养箱中取出143B细胞，轻柔吸除培养基，每皿加入7 mL无血清培养基。标记培养皿以标明将要加入的质粒类型（143B shNC或143B shSNHG6）。
  9. 将预先制备的转染混合物逐滴加入对应的培养皿中。
    注意：应缓慢滴加，使用移液器以环形轨迹从培养皿外缘向中心均匀分布。随后在37 °C、含5% CO2的培养箱中孵育。
  10. 8–12小时后弃去上清液，每10 cm培养皿中加入10 mL完全DMEM培养基。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中继续培养。
  11. 在弃去上清液并更换为完全DMEM培养基72小时后，于荧光显微镜下观察细胞。

2. 克隆形成实验

  1. 从10 cm培养皿（shNC和shSNHG6）中移除培养基，加入1.5 mL胰蛋白酶-EDTA消化细胞，轻轻吹打使细胞脱落，然后加入5 mL完全培养基终止消化。
  2. 将细胞悬液转移至15 mL离心管中。
  3. 取20 µL细胞悬液进行细胞计数。
    注意：必须多次进行细胞计数，以确保shNC组与shSNHG6组的细胞数量一致。此处收集3 × 105个细胞用于RT-PCR验证SNHG6基因敲低效率。
  4. 在6孔板中每孔接种2 × 103个细胞，加入完全DMEM培养基至终体积2 mL，并在37 °C、5% CO2培养箱中培养。
    注意：每隔一天更换一次新鲜的完全DMEM培养基。
  5. 每日观察克隆形成情况。
    注意：当对照组（shNC）中大多数克隆包含≥50个细胞时，或培养10–14天后（以先到者为准），终止培养。
  6. 从培养箱中取出细胞，弃去上清液。
  7. 每孔用1 mL PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后弃去PBS。
  8. 用1 mL 10%甲醛溶液固定细胞15分钟，然后弃去甲醛溶液。
  9. 每孔用1 mL PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后弃去PBS。
  10. 用1 mL 0.5%结晶紫染色液染色10–30分钟，然后弃去染色液。
  11. 用流动的自来水轻轻冲洗细胞。
  12. 室温下自然晾干细胞。
  13. 用相机拍摄图像。

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结果

为评估lncRNA SNHG6对骨肉瘤细胞增殖能力的影响，我们成功构建了质粒介导的基因敲低系统，并进行了克隆形成实验。实验流程包括对143B细胞进行质粒转染及克隆形成实验（图1）。

转染72小时后，通过荧光显微镜检测确认了143B细胞的转染效率（图2）。结果显示，对照组（shNC）与SNHG6敲低组（shSNHG6）中143B细胞的荧光强度一致，表明对照组和敲低组的质粒均已成功转染至143B细胞中。

RT-qPCR 分析证实，在转染 shSNHG6 质粒的 143B 细胞中，SNHG6 成功实现了敲低。与 shNC 组相比，shSNHG6 组中 SNHG6 的表达水平显著降低（p < 0.001），表明敲低效率较高（图 3）。该结果验证了转染系统的有效性，为后续研究 SNHG6 在骨肉瘤细胞增殖中作用的功能实验提供了可靠的分子...

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讨论

除了利用癌症相关长链非编码RNA（lncRNA）作为生物标志物的诊断价值外，以治疗为目的靶向这些lncRNA正成为癌症管理中的一种新兴策略。明确lncRNA在骨肉瘤发病机制中的作用，对于推动骨肉瘤的诊断、治疗和预后评估至关重要。

为确保本实验的成功，必须遵循以下关键步骤。首先，建立单细胞悬液是进行可靠克隆实验的绝对前提，因为细胞聚集体的存在可能导致假性克隆形成，从而影响结果的准确性12。为获得可靠的单细胞悬液，应使用胰蛋白酶-EDTA进行细胞解离，随后通过轻柔吹打去除细胞团块。重复轻柔吹打操作可确保在接种前完成充分的单细胞解离12,13。其次，接种密度的优化也至关重要。密度过高可能导致克隆过早融合，难以区分单个克隆；而密度过低则可能因旁分泌因子分泌不足而抑制克隆形成。因此，在正式实验前，必须通过预实验确定最佳接种密度13。第三，在早期培养阶段（前5–7天），应尽量减少培养...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了国家自然科学基金（82174408、82374477、82474535 和 82205145）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 离心管MerckAXYMCT150C
10% 中性缓冲福尔马林VICTREX5205000
100 - 1000 μL 带刻度蓝色延长吸头上海生物科技有限公司BS10401ML
100 mm 细胞培养皿无锡耐思生命科技有限公司704001
143BATCCATCC CRL-8303TM
15 mL 离心管上海生物科技有限公司BL2002150
6 孔细胞培养板无锡耐思生命科技有限公司703001
CO2 培养箱赛默飞世尔科技（中国）有限公司300583057
结晶紫梯希爱（上海）化成工业发展有限公司C0428
DMEM 培养基WISENT 公司319-005-CL
Eppendorf Research plusEppendorf3123000233
FBS - 优质WISENT 公司086-150
记号笔斑马贸易（深圳）有限公司 YYST5
Opti-MEMGibco31985070
巴斯德吸管LabgicBS-XG-O3L
PBS 缓冲液（干粉）LabgicBL601A
PEIPolysciences24765
移液器吸头MerckAXYT200Y
TrypLE Express 酶Gibco12604021
胰蛋白酶/EDTAGibcoR001100

参考文献

  1. Chen, N., et al. IAV inhibits the host antiviral defense mediated by LncRNA-LRIR to enhance viral replication. Int J Biol Macromol. 322 (Pt 1), 146665(2025).
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