本实验方案提供了一种稳定、经济且高效的方法，将长链非编码RNA敲低与集落形成实验相结合，以定量分析长链非编码RNA对骨肉瘤细胞增殖的影响。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
长链非编码RNA敲低骨肉瘤细胞增殖能力的克隆形成实验检测
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
异常表达的长链非编码RNA（lncRNA）对骨肉瘤细胞的细胞增殖具有显著影响，提示其可能作为潜在的治疗靶点。然而，目前对lncRNA的功能研究仍主要停留在理论层面，且仅限于少数验证性实验。集落形成实验能够特异性地反映单个细胞最终的增殖命运，被公认为评估长期增殖潜能的金标准。本文建立了一种基于lncRNA敲低细胞的集落形成实验的可靠实验方案，用于评价lncRNA对骨肉瘤细胞增殖能力的影响。该实验方案提供了一种稳定、经济且高效的检测方法，可用于评估lncRNA对骨肉瘤细胞增殖的调控作用。该方法不仅适用于骨肉瘤细胞的研究，也可作为研究其他肿瘤中lncRNA调控细胞增殖能力的可行工具。本研究包含lncRNA敲低及集落形成实验的详细检测流程，并以小核仁RNA宿主基因6（SNHG6）在骨肉瘤细胞（143B）中的敲低为例进行了演示。实验结果证实，SNHG6的表达被有效抑制，同时集落的数量和大小均显著减少。这些发现表明，SNHG6对维持骨肉瘤细胞（143B）的长期增殖潜能具有重要作用。
引言
长链非编码RNA（lncRNA）是指长度超过200个核苷酸且无蛋白质编码潜能的转录本，近年来已被确认为调控多种生物学过程的重要分子1,2。它们在包括骨肉瘤、前列腺癌和肺癌在内的多种癌症的发生和发展中发挥关键作用3,4,5。在骨肉瘤中，越来越多的证据表明，lncRNA表达异常对细胞增殖具有显著影响。例如，沉默lncRNA POU3F3可显著抑制骨肉瘤细胞（MG63和U2OS）的增殖，并促进其凋亡6。类似地，敲低lncRNA HOXA-AS3可减少U2OS和SW1353细胞的克隆形成并抑制其生长7。鉴于不受控制的细胞增殖是癌症生物学的标志性特征，也是决定治疗策略的主要因素，阐明lncRNA调控的肿瘤细胞增殖机制，尤其是在骨肉瘤中的作用，仍具有重要的科学意义和必要性。
尽管已有多种方法可用于评估细胞增殖，但每种方法均存在固有的局限性。比色法或代谢法检测（如CCK-8和MTT）操作简便、快速，通量高，但主要提供短期读数，易受细胞代谢波动干扰，且所用试剂可能产生光学或光化学干扰风险
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所用试剂和设备列于材料表中。
1. 质粒转染
- 将143B细胞以每10 cm培养皿5 × 105个细胞的密度接种（共两皿），在37 °C、5% CO2的培养箱中，使用完全培养基（DMEM + 10% FBS）进行培养。
- 24小时后准备转染试剂，包括质粒（shNC和shSNHG6）、PEI以及Opti-MEM。
注意：使用前需涡旋混匀，并确保所有试剂均已平衡至室温。 - 取出四个1.5 mL微量离心管，用记号笔标记质粒管（shNC和shSNHG6）以及PEI管（两管）。
- 向每根离心管中加入500 µL Opti-MEM。
- 向质粒管（shNC或shSNHG6）中加入10 µg质粒，向每根PEI管中加入30 µL PEI（1 µg/µL）。
- 轻轻上下混匀，室温孵育5分钟。
- 将质粒管与PEI管中的液体合并，轻轻混匀后，室温孵育20分钟。
- 从培养箱中取出143B细胞，轻柔吸除培养基，每皿加入7 mL无血清培养基。标记培养皿以标明将要加入的质粒类型（143B shNC或143B shSNHG6）。
- 将预先制备的转染混合物逐滴加入对应的培养皿中。
注意：应缓慢滴加，使用移液器以....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
为评估lncRNA SNHG6对骨肉瘤细胞增殖能力的影响，我们成功构建了质粒介导的基因敲低系统，并进行了克隆形成实验。实验流程包括对143B细胞进行质粒转染及克隆形成实验（图1）。
转染72小时后，通过荧光显微镜检测确认了143B细胞的转染效率（图2）。结果显示，对照组（shNC）与SNHG6敲低组（shSNHG6）中143B细胞的荧光强度一致，表明对照组和敲低组的质粒均已成功转染至143B细胞中。
RT-qPCR 分析证实，在转染 shSNHG6 质粒的 143B 细胞中，SNHG6 成功实现了敲低。与 shNC 组相比，shSNHG6 组中 SNHG6 的表达水平显著降低（p < 0.001），表明敲低效率较高（图 3）。该结果验证了转染系统的有效性，为后续研究 SNHG6 在骨肉瘤细胞增殖中作用的功能实验提供了可靠的分子.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
除了利用癌症相关长链非编码RNA（lncRNA）作为生物标志物的诊断价值外，以治疗为目的靶向这些lncRNA正成为癌症管理中的一种新兴策略。明确lncRNA在骨肉瘤发病机制中的作用，对于推动骨肉瘤的诊断、治疗和预后评估至关重要。
为确保本实验的成功，必须遵循以下关键步骤。首先，建立单细胞悬液是进行可靠克隆实验的绝对前提，因为细胞聚集体的存在可能导致假性克隆形成，从而影响结果的准确性12。为获得可靠的单细胞悬液，应使用胰蛋白酶-EDTA进行细胞解离，随后通过轻柔吹打去除细胞团块。重复轻柔吹打操作可确保在接种前完成充分的单细胞解离12,13。其次，接种密度的优化也至关重要。密度过高可能导致克隆过早融合，难以区分单个克隆；而密度过低则可能因旁分泌因子分泌不足而抑制克隆形成。因此，在正式实验前，必须通过预实验确定最佳接种密度13。第三，在早期培养阶段（前5–7天），应尽量减少培养.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了国家自然科学基金（82174408、82374477、82474535 和 82205145）的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 离心管 | Merck | AXYMCT150C | |
| 10% 中性缓冲福尔马林 | VICTREX | 5205000 | |
| 100 - 1000 μL 带刻度蓝色延长吸头 | 上海生物科技有限公司 | BS10401ML | |
| 100 mm 细胞培养皿 | 无锡耐思生命科技有限公司 | 704001 | |
| 143B | ATCC | ATCC CRL-8303TM | |
| 15 mL 离心管 | 上海生物科技有限公司 | BL2002150 | |
| 6 孔细胞培养板 | 无锡耐思生命科技有限公司 | 703001 | |
| CO2 培养箱 | 赛默飞世尔科技（中国）有限公司 | 300583057 | |
| 结晶紫 | 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司 | C0428 | |
| DMEM 培养基 | WISENT 公司 | 319-005-CL | |
| Eppendorf Research plus | Eppendorf | 3123000233 | |
| FBS - 优质 | WISENT 公司 | 086-150 | |
| 记号笔 | 斑马贸易（深圳）有限公司 | YYST5 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| 巴斯德吸管 | Labgic | BS-XG-O3L | |
| PBS 缓冲液（干粉） | Labgic | BL601A | |
| PEI | Polysciences | 24765 | |
| 移液器吸头 | Merck | AXYT200Y | |
| TrypLE Express 酶 | Gibco | 12604021 | |
| 胰蛋白酶/EDTA | Gibco | R001100 |
参考文献
- Chen, N., et al. IAV inhibits the host antiviral defense mediated by LncRNA-LRIR to enhance viral replication. Int J Biol Macromol. 322 (Pt 1), 146665(2025).
- Zhu, J., Mo, Y. Y., Peng, W. X. RNA binding protein-mediated competing endogenous RNA ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
