采用激光散斑技术评估电针刺激对APP/PS1小鼠脑血流的影响

摘要

本文介绍了一种以激光散斑对比成像技术定量评估脑血流量，并结合莫里斯水迷宫实验，用于评价电针刺激对APP/PS1（阿尔茨海默病模型）小鼠作用的实验方案，该方法对阿尔茨海默病的脑血管研究具有重要价值。

摘要

阿尔茨海默病（AD）的特征是进行性认知功能下降和脑血管功能障碍，包括脑血流量（CBF）降低以及神经血管单元受损。电针（EA）在改善神经功能方面显示出潜力，其机制可能与调节CBF有关。激光散斑成像是一种用于实时评估CBF的宽场方法，可精确评价脑血流灌注的变化。在本实验中，我们观察了电针对AD模型小鼠（APP/PS1转基因小鼠）脑血流量和认知能力的影响。采用激光散斑成像技术观察小鼠大脑中动脉及其分支血管的血流灌注情况，并通过莫里斯水迷宫实验评估小鼠的空间认知功能。结果显示，电针可改善APP/PS1小鼠的认知功能，在莫里斯水迷宫测试中逃避潜伏期显著缩短（P<0.05）。此外，激光散斑衬比成像（LSCI）证实，与野生型对照组相比，AD模型小鼠存在显著的脑低灌注现象（P < 0.05）；更重要的是，电针治疗可诱导CBF出现具有统计学意义的升高（P < 0.05），逆转AD小鼠的脑低灌注状态。激光散斑成像是一种用于可视化评估电针诱导的脑血管改善效果的技术。这些发现支持将电针作为针对脑血管功能障碍的AD潜在辅助治疗方法。

引言

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，其特征是逐渐出现的认知功能障碍和记忆力下降。该病具有细胞外β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块沉积、细胞内神经原纤维缠结（NFTs）以及神经元丢失等病理特征¹。尽管这些经典特征一直是治疗研究的主要焦点，但越来越多的证据表明，脑血流量（CBF）减少在AD的发病机制和疾病进展中起着关键作用²。CBF的降低发生在AD发病的早期阶段，并与认知功能障碍的严重程度相关³。因此，改善脑血管损伤的治疗策略是缓解AD症状并改善疾病进程的有效途径。

电针（EA）是一种将传统针灸与电刺激相结合的现代技术，在改善阿尔茨海默病（AD）认知功能方面显示出潜力。研究表明，EA可能通过多种机制发挥其有益作用，例如减少Aβ沉积、减轻神经炎症以及促进突触可塑性⁴。值得注意的是，目前越来越多的研究推测，EA的神经保护作用可能与其调节脑血流量（CBF）的能力密切相关⁵。然而，目前仍缺乏直接、实时的证据来证明EA对AD模型脑血流动力学的影响。此类证据的缺失阻碍了人们对EA如何改善脑功能的全面理解。

光学成像技术的进步为研究脑血流动力学提供了强有力的工具。作为一种快速、宽场的光学技术，激光散斑成像（LSCI）能够以高时空分辨率可视化体积积分的组织血流图谱⁶，从而实现对电针刺激引起的灌注动态进行实时监测。尽管为获得最佳光学通路需要暴露颅骨，但LSCI无需侵入性组织穿刺。LSCI于20世纪90年代被提出，在过去几十年中已广泛应用于神经科学研究⁷。与其他成像技术一样，LSCI也存在固有的局限性：其光穿透深度有限，适用于表层皮层血管，而难以观测深部脑区（如海马、基底节）；此外，它仅能量化相对血流量（灌注单位），而非绝对的脑血流量（CBF）值，且其准确性会受到血管形态和组织光学散射特性的细微影响^8,9。然而，这些局限性并未削弱LSCI的应用价值，而是明确了其在表层皮层血流实时评估中的专长。在本研究中，针对电针诱导的皮层灌注变化，LSCI提供了可靠且具有实际意义的数据。具体而言，我们建立了一套标准化的LSCI操作流程，通过靶向感兴趣区域（ROI）的划定和参数优化，定量分析APP/PS1小鼠的脑血流量，并结合莫里斯水迷宫实验，将脑血管功能改善与认知功能结果相关联。

方案

本方案已获北京中医药大学动物伦理委员会批准（BUCM20250708-005），并严格遵守中国关于实验动物护理与使用的全部指南。

1. 准备

1. 本实验使用了十二只6月龄雄性APP/PS1小鼠和六只6月龄雄性C57bl/6小鼠。
2. 所有小鼠均饲养于北京中医药大学动物实验中心，每笼三只，可自由获取无菌饮水和标准颗粒饲料。
3. 饲养环境保持12小时光照/12小时黑暗循环，室温控制在23 ± 2 °C。

2. 动物分组与干预

1. 将12只6月龄雄性APP/PS1小鼠（体重27.88 g ± 0.48 g）随机分为两个实验组（每组n = 6）：阿尔茨海默病（AD）模型组和电针（EA）治疗组。
2. 选取6只6月龄雄性C57BL/6小鼠（体重29.90 g ± 0.81 g）作为野生型（WT）组。
3. 对于WT对照组和AD模型组，将小鼠轻轻固定于通风良好的小鼠固定器中，不给予任何实验干预。
4. 对于电针治疗组，将小鼠以与WT对照组和AD模型组相同的通风固定器进行轻柔固定，以限制过度活动的同时确保呼吸通畅。在此标准化固定条件下，将一次性无菌针灸针（0.25 mm × 13 mm）插入头部百会（GV20）和印堂（GV29）穴位（图1A），针尖朝向鼻部，进针深度保持一致，为2–3 mm。将电针仪的正负极分别连接至这两个穴位，持续刺激15分钟（图1B）。刺激参数设置为疏密波，强度为0.1 mA，频率为2 Hz。
5. 每48小时对各组进行一次干预，每次持续15分钟，总干预周期为30天。
   注：穴位选择、定位及针刺操作应遵循中国针灸学会于2020年5月15日发布的标准T/CAAM 0002-2020《实验动物常用针灸穴位名称与定位 第3部分：小鼠》¹⁰。

3. MWM 测试

注意：在为期30天的干预阶段结束后的24小时，对三个实验组的所有小鼠进行莫里斯水迷宫（Morris Water Maze, MWM）测试，包括隐藏平台（空间导航）试验和探测试验^11,12。在正式测试前实施为期1天的适应期，以尽量减少小鼠的应激反应，使其适应实验房间、MWM装置以及操作流程。

1. 准备工作
   1. 将MWM装置及其相关的信号采集/处理系统放置在隔音的实验室内。保持测试环境的室温约为25 °C，并标准化光照条件：在迷宫四个象限的上方安装四根60 W的LED灯管，高度应足够，以避免被天花板摄像机拍摄到。用不透明的帘子包围整个测试区域，以屏蔽外部环境干扰，并防止无意的空间线索影响小鼠的导航行为。
   2. 在MWM装置中央放置一个圆形白色水箱（直径90 cm × 高50 cm）。将天花板上安装的视频摄像机连接至自动追踪系统和记录仪，以便在整个测试过程中持续采集数据。
   3. 将水箱划分为四个相等的区域，分别标记为北（N）、南（S）、东（E）和西（W），并进一步细分为四个全等的象限：东北（NE）、西北（NW）、西南（SW）和东南（SE）。
   4. 在每个象限的外壁上粘贴形状明显不同的视觉标记（正方形、三角形和圆形），位置应处于小鼠视线范围内，作为空间参考点。
   5. 向水箱中注入30 cm深的水，并使用电加热器将水温维持在24 ± 1 °C；加入白色食用色素使水呈不透明状态。
2. 隐藏平台试验
   1. 在整个试验期间，将一个 submerged platform 固定在SE象限内。
   2. 将每只小鼠随机从三个不同的象限（NE、NW、SW）之一放入水中，初始方向均朝向水箱壁，以保持一致性。
   3. 允许每只小鼠最多60 s的时间独立寻找隐藏平台。
   4. 记录每次试验的逃逸潜伏期（从释放到登上平台所需的时间），以评估空间学习能力。
      ​注意：每只小鼠在连续五天内每天完成三次试验。若小鼠在60 s内未能找到平台，则将其轻轻引导至平台，并让其在平台上停留10 s，以强化空间记忆，随后结束该次试验。
3. 探针试验
   1. 移除平台。
   2. 将每只小鼠面向水箱壁放入水中一次，允许其自由游泳60 s。
   3. 记录关键结果指标：平均游泳速度以及穿越原平台位置的次数。
4. 测试后护理
   1. 每次MWM实验结束后，使用软毛巾将小鼠彻底擦干，并使用电加热器轻轻加热以防止低体温。

4. 激光散斑对比成像

1. 从每组中随机选取三只小鼠，使用激光散斑血流成像系统（LSCI）实时、全视野监测其脑血流（CBF）。
2. 动物准备：所有动物操作均在麻醉条件下进行。通过腹腔注射1.25%三溴乙醇（0.02 mL/g）对小鼠进行麻醉，以确保其持续自主呼吸，并将其置于水平手术台上。将麻醉后的小鼠放置在恒温加热垫上，温度维持在37 °C，以稳定核心体温。剃除头皮毛发，并小心剥离下方肌肉/脑膜组织以暴露颅骨；在整个操作过程中，使用0.9%无菌生理盐水保持暴露的颅骨表面湿润，防止干燥。
3. 成像设置：将系统的扫描头垂直置于暴露的颅窗上方，固定距离为20 cm。启用自动对焦和自动增益功能，以优化图像清晰度和对比度，所有实验中增益值自动维持在140–160范围内。设定其他标准化成像参数如下：曝光时间 = 20 ms，时间常数 = 1.0 s，工作模式 = 时间模式（Temporal），滤波帧数 = 250帧，采样间隔 = 5000 ms，图像分辨率 = 1032 × 772。
4. 数据采集：以25 Hz的采样率连续采集散斑图像，并与预设的时间参数和滤波参数同步进行数据收集。
5. 感兴趣区域分析：使用分析软件在前额叶皮层区域定义感兴趣区域（ROIs），特别针对该皮层区域内的大脑前动脉和中动脉供血区。在这些血管区域划定ROIs，并从每个ROI提取平均血流值（以灌注单位表示），用于后续统计比较。

5. 统计分析

1. 使用 SPSS 27.0 进行统计分析。
2. 采用学生 t 检验分析隐藏平台、探针试验结果和脑血流量（CBF）的组间差异。将统计学显著性定义为 P < 0.05，高度统计学显著性设定为 P < 0.01。

结果

电针对阿尔茨海默病模型小鼠空间学习和记忆能力的影响

Morris水迷宫实验的结果如图2所示。图2A展示了为期五天的隐藏平台试验中逃避潜伏期的变化情况。AD组的逃避潜伏期呈现波动趋势，而WT组和EA组则稳定下降。从第4天到第5天，AD组的逃避潜伏期显著长于WT组（P < 0.01）。EA组在第4天至第5天的逃避潜伏期显著短于AD组（P < 0.05）。

图2B显示了探针试验的结果。AD组的游泳速度低于WT组（P < 0.05）。平台穿越次数未见显著差异。

电针对 AD 模型小鼠脑血流的影响

使用激光散斑对比成像测量脑血流量（CBF）的结果如

讨论

本研究显示，在百会（GV20）和印堂（GV29）穴位进行长期电针干预可显著改善APP/PS1转基因小鼠的空间学习缺陷，表现为莫里斯水迷宫隐藏平台实验中逃避潜伏期缩短。该结果与既往研究一致，已有报道表明电针可通过减少Aβ沉积和减轻神经炎症等机制，改善多种阿尔茨海默病（AD）模型的认知功能¹³。值得注意的是，本研究的穴位选择基于中医理论，该理论为针刺疗法应用于认知障碍的治疗提供了传统依据¹⁴。

本研究的一个核心发现是，通过激光散斑衬比成像（LSCI）定量分析证实，与野生型对照小鼠相比，APP/PS1 转基因小鼠的脑血流量（CBF）显著降低。该结果与大量临床及临床前文献一致，这些文献均指出脑低灌注是阿尔茨海默病（AD）发病过程中的一个标志性特征。CBF 的减少在疾病早期和进展期均有报道，并与认知功能下降密切相关^2,3。重要的是，我们的结果进一步表明，在 GV20 和 GV29 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
针灸针	(北京中研太和医药有限公司，中国	0.25 mm × 13 mm	针灸针
激光散斑血流成像系统	Gene&I Scientific. Ltd.	MoorFLPI-2
小鼠固定器	恒泰实验室设备中心	HT-A2
三溴乙醇	南京艾贝生物科技有限公司	M2910	麻醉剂