聚丙烯酰胺ZrOH水凝胶用于空间分辨取土壤根部渗出的羧酸盐

Summary

本方案详细介绍了使用聚丙烯酰胺锆氢化水凝胶（ZrOH水凝胶）作为一种非破坏性原位方法，在不同作物发育阶段从完整土壤根系中取样根部喷出羧酸盐的方法。还概述了利用离子色谱-质谱（IC-MS）对这些羧酸盐进行后续局部定位和定量的方法。

Abstract

对未受扰动的土壤植物根部的根部分泌物进行采样和可靠定量仍具挑战性。我们进一步开发了一种无损方法，用于采样、二维制图和定量从根箱植物根部喷出的七种羧酸盐（乌头酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、乳酸盐、苹果酸、草酸盐、琥珀酸盐）。本文描述的方法使用聚丙烯酰胺锆氢氧化物水凝胶（ZrOH水凝胶），吸收所有测试的羧酸盐，洗脱效率范围为95.3%±3.12%至111%±1.99%。ZrOH水凝胶对羧酸盐具有较高的结合能力，最高可达1.82 μmol ^cm-2，具体取决于溶液pH和羧酸盐种类，其浓度高于根际通常可用的浓度。此外，ZrOH水凝胶上的结合羧酸盐保持稳定，可在4°C下储存数周后再分析。应用中植物种植于填充土壤的根箱中，便于取用且对根系干扰最小。为采样根释放羧酸盐，需仔细在目标区域施用ZrOH水凝胶24小时。取回ZrOH水凝胶后，进行切割以进行定位，并将凝胶片段洗脱以供后续羧酸盐分析（例如通过离子色谱-质谱法）。我们的发现表明，ZrOH水凝胶在捕捉和确定根际羧酸盐浓度方面具有有效性。该方法的新颖之处在于能够从完整土壤植物根部中取样根部分泌物，并且可以进行时间解析采样，这与传统方法（土壤-水培混合法）相比，传统方法往往具有破坏性且仅允许单次采样。最重要的是，它能够生成定量的高分辨率毫米级二维图像，便于可视化羧酸盐沿根轴的渗出及其在根圈内的空间分布。此外，该方法还有助于在生长周期中不同生长阶段采样根部分泌物。

Introduction

植物根部向根际圈释放各种化合物，塑造其物理、化学和^{生物特性 1}.当植物暴露于非生物和生物胁迫条件下时，根部渗出尤为明显。根部渗出物实际上可能直接或间接影响养分/金属的可用性与动员、微生物群落和活动、土壤聚集稳定性以及植物对病原体的防御能力 ^1,2,3。最重要的根部渗出物之一是羧酸盐，因为它们在养分溶解（包括磷（P）、铁（Fe）、铜（Cu）和锌（Zn））、重金属耐受性以及促进根际2,3,4,5有益微生物中的作用。

值得注意的是，渗出羧酸盐包括柠檬酸盐、乳酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐和富马酸盐^6,7,8。例如，柠檬酸盐通过动员与铁或铝（Al）（氢）氧化物结合的磷^7,9，在磷获取中发挥关键作用。然而，准确采样和定量土壤植物根系渗出物仍是实验性挑战，主要原因是难以物理接触未受扰动的土壤根系，以及获取根部渗出物样本^10,11。此外，渗出的化合物在微生物中迅速降解（几分钟到数小时内）¹²，并强吸附于土壤矿物质表面^1,10。根部渗出研究的另一个挑战是长期监测渗出物，因为大多数采集方法会扰动根系或需要采集土壤植物，这使得再次评估同一根系变得困难（^1,11）。因此，准确采样、定量和监测根部分泌物需要一种能够捕捉空间变化并便于在植物生长过程中反复采样的技术¹¹。

在本研究中，我们提出了一种最初由Tiziani等人为柠檬酸开发的非破坏性原位方法，¹²号，现已进一步完善并应用于采样、精确空间定位及定量六种额外羧酸盐（乌头酸盐、富马酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、草酸盐和琥珀酸盐），这些羧酸盐从土壤中栽培的植物根系中喷出。该方法利用基于氢氧化锆的聚丙烯酰胺水凝胶（ZrOH水凝胶）采样根部渗出物¹³。ZrOH水凝胶对阴离子（包括羧酸盐）具有强的结合能力，且可轻易被洗脱。ZrOH水凝胶（1）通过将水凝胶简单地放置在根系上，即可从土壤生长的植物根部取样，几乎不扰动;（2）有效保护结合羧酸盐免受微生物矿化影响至少6周;（3）羧酸盐在根际的空间分布被凝胶结合后得以保持;（4）允许毫米尺度的二维羧酸盐映射¹²。

现有的根部渗出物采样方法分为基于土壤的技术（如根洗或土壤-水培杂交、土壤-根部渗出物收集器（SOIL-REC）装置、微型吸盘、滤纸/琼脂片、渗出陷阱和RHIZOtest技术）或水培渗出物采样方法。根部清洗或土壤-水培混合方法涉及小心地将整株植物从土壤中移除，清洗根系，然后将其浸入采样溶液中收集根部分泌物¹⁵。由于其简单性，这是取样土壤植物渗出物最常用的方法。然而，从土壤中提取根部存在失去根毛和更细根的风险。此外，根部需彻底清洁，这可能损害根部，影响根部渗出物的质量和数量，并妨碍时间分辨采样^8,11。SOIL-REC方法涉及在专门设计的根箱系统中种植植物，根系生长在两层多孔尼龙网（≤ 30微米）之间，并使用根部渗^出物收集工具收集根部渗出^物。该方法保护根系，减少土壤污染，并实现反复采集根部渗出物。然而，其结构复杂（仅有少量复制），采样时大量渗出物稀释较多，且仍需优化，因为复制性较为难，且第⁸个复制之间存在巨大差异。

在可接触完整土壤根系的根段上，使用小块树脂、琼脂凝胶片或滤纸，或吸附出物于可接触的完整土壤根系的根段上（即使用根箱或根窗）^18,19。该方法实现时间分辨采样和局部渗出物成分的部分测量，尽管空间分辨率较低。但易受微生物矿化伪影影响且操作不便。同样，渗出液陷阱用于采样单个根段的根部渗出物，其中单个根部被水平侧室捕获，局部放置密封的有机玻璃环，内含采样溶液。该方法适用于水培和土壤根，并允许局部采样¹²。然而，采集量较低，时间解析采样几乎不可能，且分离单个根部容易受到机械应力影响根部代谢和渗出^8。使用微吸盘收集根际土壤溶液，实现对土壤根部的原位采样²⁰。然而，采集量较小，采样部分时间分辨，且渗出物易被吸附和微生物降解¹⁶。RHIZOtest技术是通过水培方式在小圆柱体内生长根系，底部覆盖30微米尼龙网，然后转移到土壤盘上，实现根部^与土壤8,21,22之间的溶质交换。通过将根垫浸入采样溶液中收集渗出物。该方法保持与根部和土壤的接触，但采用人工生长条件。该方法仅限于短期实验，且缺乏时间分辨采样。在这些方法中，仅可使用树脂、琼脂凝胶片、滤纸、渗出陷阱和微型吸盘来确定空间渗出模式。

水培渗出物采样方法包括水培和半水培技术。水培是一种常用且简单的根部渗出物采集方法，即在养分溶液中生长植物，然后用取样溶液（H₂O， CaSO₄， CaCl₂， micropur）替代，以获得渗出物样品^15,23。该方法简单，对根部施加的机械应力最小。该方法高度可重复且必要时保持无菌，提高根部渗出物的质量，并实现时间解析采样 ^5,16。尽管如此，它是一个高度人工的系统，可以改变植物的生理结构、形态（如根毛发育）和根部分泌过程 ^6,15。在半水培中，植物种植于玻璃珠、沙子或蛭石上，并与持续渗入的养分溶液中，渗出物被收集到渗滤溶液中 ^8,18。这种方法比水培略少人工，并且允许时间分辨采样。然而，该系统几乎完全饱和水分，因此需要能耐受部分厌氧条件的植物。

与其他方法相比，ZrOH水凝胶方法具有多项优势。ZrOH水凝胶允许在土壤培养中（接近自然条件下）采样根部渗出物，且对根系干扰极小;在植物生命周期内进行时间分辨采样;由于微生物降解减少和羧酸盐结合能力高，根部渗出物可持续超过24小时收集¹²。此外，采样/保存水凝胶无需生物杀灭剂（如微净、NaN₃），这对分析仪器有长期影响并干扰化学分析。这是因为羧酸盐与ZrOH水凝胶化学结合。此外，样品可在分析前储存数周至数月，因此可从一个实验装置中采集大量样本¹²，这可能归因于水凝胶中Zr的抗菌^{特性。此外}，ZrOH水凝胶能够实现根际圈中渗出化合物及其他阴离子的二维毫米分辨率映射，甚至可能采样整个根系^12,14,26。ZrOH水凝胶在冰箱中占用的存储空间（4°C）较少，而传统方法通常储存在冷冻室（-20°C）中所需的大体积。主要的限制是适应生产高质量的氮氧化氢凝胶，且几乎没有气泡，以及根茎箱仍然是人工生长环境。另一个限制是该方法仅针对七种羧酸盐（乌头酸盐、柠酸盐、富马酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐和草酸盐）¹²，磺胺酰胺（磺胺乙肼、磺胺甲基、磺氯吡啶达嗪和克林达基）²⁷，以及无机阴离子（硫化物和磷酸钒、砷砷、硒、钼、铍锑的氧酸离子）14,26,28,29。ZrOH水凝胶也曾与悬浮颗粒试剂——亚胺酸二乙酸结合使用，用于原位采样和定位根圈^28、29、30中阳离子（铝、铁、钙、镁、锰锰、镍和锌锌）。

本文提供了一种基于ZrOH水凝胶的方法，以实现土壤根系羧酸盐的时间和空间分辨原位采样。我们详细介绍了如何进行根箱实验，包括使用ZrOH水凝胶技术进行根部渗出物的采样和二维绘图。内容包括水凝胶制备、填补根茎盒、植物栽培、水凝胶施用、回收与切割、从水凝胶中洗脱及分析，随后进行二维图像生成。此外，还附有关键步骤的说明，如利用离子色谱-质谱（IC-MS）进行羧酸盐分析。

Protocol

1. 铵氢凝胶制备

注意：凝胶制备需保持清洁环境和材料以避免污染。在制备溶液、凝胶冲洗和水化时，仅使用实验室一级水（≤18 MΩ·cm）以保证质量。确保有毒废物容器（液体和固体）在开始水凝胶制备前已放入抽烟柜。在开始制备凝胶前，将烤箱预热至约42至45°C，持续1小时。材料和化学品的详细信息详见 材料表。

1. 玻璃组装准备
   1. 在排气罩中将153.8毫升65%HNO₃加入846.2毫升实验室一级水，准备10%（w/v）HNO₃酸浴。
   2. 将玻璃板（6.1 x 17厘米）、镊子、特氟龙U形垫片（0.25毫米或0.4毫米）和塑料夹子浸泡在酸浴中至少4小时。
   3. 将玻璃板、镊子、塑料夹和特氟龙垫片从酸浴中取出，然后用实验室一级水至少清洗三次。然后让它们在层流或清洁工作台中彻底自然风干。
      注意：玻璃板应与凝胶准备当天准备，避免用纸张干燥，以减少污染。
   4. 将“U”形垫片放在干玻璃板上，添加第二个垫片，并用夹子将它们固定在一起。将玻璃板偏移约~1毫米，以便移液更方便（见 图1A）。
   5. 在铸造凝胶溶液之前，将玻璃板组件放在干净的塑料箔纸上，置于胶片罩下方。
2. 聚丙烯酰胺凝胶制剂³¹
   1. 凝胶溶液：将15毫升薄膜扩散梯度（DGT）凝胶交联剂与47.5毫升实验室级I水混合，置于干净塑料瓶中，然后加入37.5毫升丙烯酰胺溶液（40%），制成100毫升凝胶溶液。加入每个溶液时，彻底搅拌混合物。凝胶溶液可在冰箱（4°C）保存至少三个月。
      注意：确保每溶液的移液/称量正确，且仅使用不含双丙烯酰胺的丙烯酰胺溶液，因为在2-（N-吗啡烯酸）-乙磺酸（MES）缓冲液中时会产生软凝胶。
   2. 将0.1克APS溶解在1克_氢2氧水中，制备10%（w/v）过硫酸铵（APS）溶液。每天新鲜制备溶液，并确保使用前完全溶解。
   3. 将4毫升凝胶溶液与28微升10%APS混合，然后在干净塑料瓶中加入10微升99% N，N，N'N'-四甲乙二胺（TEMED），准备凝胶鸡尾酒。加入每个溶液后混合。该溶液可准备最多3个凝胶，因为混合物会快速聚合。混合物的体积可根据所用平板和垫片的大小进行调整。
      注意：混合各种试剂时避免气泡和起泡。
   4. 从中间缓慢移液，将凝胶混合物移入玻璃板组件之间，如 图1B和C²⁶所示。如果存在气泡，应通过轻轻倾斜玻璃组件或用笔敲击玻璃板来清除。
      注意：要获得无气泡凝胶，避免使用划伤玻璃板，使用后放入酸浴中保存，只有在下次使用前清洗，而不是存放在聚乙烯袋中。使用1 mL或5 mL移液器，带小头铸造凝胶，然后从中心缓慢加入凝胶混合物，使凝胶均匀扩散，同时将平板倾斜45°。
   5. 将组装件放入预热的烤箱，并保持温度在42至46°C至少1小时，以确保凝胶完全凝固（无液体滴落）。
   6. 用干净、无锈的剃须刀片从角落轻轻撬动组件，并用实验室一级水装在洗涤瓶中清洗玻璃板上的凝胶（见图1D–F）。为了方便去除凝胶，先用水浸泡几分钟，然后将其冲洗到装有实验室一级水的1升烧杯中。
      注意：避免用镊子拉出胶体，以免胶体粘附在板上，这可能导致胶体变形。聚合后，任何明显的气泡通常位于胶体与玻璃板之间，而非胶片内部，取出板后气泡会变得清晰。
   7. 在水化后24小时内（最好每2小时更换一次）至少更换3–4次水，以冲洗残留的聚合化学物质。通过在水化过程中反复更换水，未反应试剂等杂质被扩散，pH值降低，防止胶体内电荷积累。
   8. 如果凝胶片未立即用于ZrOH沉淀，则可在实验室一级水中保存（约24小时），或在冰箱冷藏中保存0.01摩尔^L-1 NaCl或NaNO₃ （4°C）。这些凝胶可在NaCl中储存最长1个月后才沉淀。
      注意：我们建议胶体在聚合后立即沉淀，以减少清洗过程中可能引入的污染。
3. ZrOH凝胶¹⁴的沉淀
   1. 将3.22克二氯氧化锆（ZrOCl_{2.8H 2}O）溶解在40毫升实验室一级水中，置于250毫升塑料烧杯中。
   2. 放置最多4张凝胶片，填充最多100毫升。或者将1.66克ZrOCl_{2.8H 2}O溶解在20毫升实验室I级水中，放入2层凝胶，填充至50毫升。
   3. 将凝胶片浸泡至少2小时，以确保凝胶中钯均匀分布。
   4. 将每颗凝胶转移到100毫升0.05摩尔^L-1 2-（N-morpholino）-乙磺酸（MES）中，并在pH 6.7缓冲（pH值用1摩尔^L-1 NaOH调节）进行沉淀。在最初30-60秒内用長子轻轻搅拌凝胶，以获得均匀沉淀。
   5. 在板摇器上以≤100转/分钟轻轻摇晃40分钟，使Zr（OH）₄ 完全沉淀到凝胶中。
      注意：较慢的摇晃速度更为理想，以避免凝胶相互粘连。
   6. 将凝胶放入实验室用的一级水中，置于1−2升烧杯中24小时去除Cl^- 离子，并至少换水3次，间隔2小时³²。通过测量冲洗溶液的电导性或进行氯离子测试，可以检查Cl^- 离子的彻底去除情况。
   7. 将凝胶储存在0.03摩尔^L-1 NaNO₃或NaCl中，但土壤实验中更偏好NaCl，因为硝酸盐能迅速增强土壤微生物活性，同时也是主要植物养分（^13,32）。
   8. ZrOH水凝胶已经过长达60周的测试（在4°C冰箱中保存），并被证明能保持其特性和良好性能（±为目标值的10%）³²。
4. 凝胶切割
   1. 清理未划伤的有机玻璃板、镊子和锋利无锈剃刀片。如果没有有机玻璃板，可以使用任何厚且坚固的玻璃板。
   2. 用实验室一级水润湿有机玻璃板，帮助扩散ZrOH水凝胶片。
   3. 用镊子将ZrOH水凝胶片铺在有机玻璃板上，确保平整无气泡。识别板上有孔的区域;切割时应避免这些区域。
   4. 用锋利的剃刀片精确切割ZrOH水凝胶片至所需尺寸。切割后去除板上的水分有助于清晰看到切出的部分。
      注意：为了便于二维测绘时识别侧面，建议将ZrOH水凝胶切割成直角梯形，最长的边位于左上角。
   5. 将ZrOH水凝胶储存在实验室一级水中（用于短期储存及凝胶施用前），或长期储存时用0.03摩尔^L-1 NaNO₃/NaCl（>24小时）。

2. Rhizobox 实验设置

注意：植物种植在填充土壤的根箱中，设计各异。我们建议使用底部或背面开孔的根箱，以便浇水并确保水分均匀分布（见 补充图1）。材料和化学品的详细信息列于 材料表。

1. 树箱填充与蓄水能力测定²⁶
   1. 使用2毫米筛子进行空气干燥的土壤筛，并均匀化土壤。我们建议使用中质土壤，但也可以使用沙质或粘土，前提是采用特定的处理技术（如根箱型、填土、开孔和浇水）。
   2. 称重空的根箱所有组件，连同夹具和塑料箔，并记录重量（见 补充图2C）。在确定蓄水能力（WHC）所需的数量中，额外增加2–3根根箱。
   3. 估算填满根茎箱所需的干燥土壤质量。通常，根箱填充深度可达顶部以下2厘米。推荐的体积密度约为1.0–1.4克 ^cm-3。
   4. 根据根箱的类型和操作便利性，应小心地将干土填充。填土过程中及之后，可以用平板将土壤平整而不压实。也可以使用略微湿润的土壤填充根茎箱，保持土壤结构，尤其是细质或重粘土（详见Wagner等²⁶ 页）。
   5. 或者，如果根箱是从顶部注满的，则将塑料箔固定在根箱上，用前板覆盖，然后夹紧（见 补充图2A–D）。
   6. 为方便起见，填充过程中安装核孔膜，并确保其平贴表面。采样根部渗出物时需要核孔膜。
   7. 记录填土根箱的重量及钳子。通过用填土根箱减去空根箱的重量，计算每个根箱的干土质量（m公尺干_土），并记录重量。
   8. 保持水分的方法是先用去离子水浸湿根箱，然后让其排水~8小时。称重根箱，并通过从当前重量减去步骤2.1.7中记录的填土根箱重量，计算水质量（mw）。然后通过将_mw除以m干燥_土壤，计算水温（^g-1），得到一个比值。
      注意： 不要使用用于WHC测定的根箱进行实际测绘，因为水分饱和可能导致厌氧，从而产生氧化还原伪影。
   9. 大多数植物在生长过程中的最佳含水量应保持在50%–60% WHC（即WHC因子，f_WHC = 0.5−0.6），具体取决于土壤类型和植物种类。估算每个根茎箱应添加的水量（m_{w add}）：m_{w add} = WHC x f_{WHC x m 干燥土壤}。
   10. 种植前用_m-w添加水给根箱。如果是通过孔浇水，向表面加5-10毫升水。
   11. 记录浇水的根箱质量，这些树根箱用于植物生长期间的浇水。
2. 植物种植与管理^12,26
   1. 在发芽或播种前对种子进行灭菌。常见做法是先将种子浸入70%乙醇中3分钟，然后浸入1%氯化钠中15分钟以防止真菌生长。然后用去离子水冲洗种子（大约6至7次）。
   2. 在滤纸或发芽辊中用水或0.05 mmol L⁻¹ CaSO₄ 预发芽，直到发芽枝条出现。
   3. 将一株幼苗转移到每个根茎箱，放在前盘附近，覆盖一点土壤，然后加点水。
   4. 用铝箔包裹根茎箱，以防止根际的光化学还原，防止藻类及其他光合微生物生长，同时避免暴露在光线下对根部造成压力。另外，也有黑色前板，不允许光线穿透，可替代铝箔纸使用。
   5. 将根茎箱放在架子上，在生长室或温室中倾斜，温度、相对湿度和光照受控。建议倾斜25°至35°。
   6. 根据植物需求，每周至少以重力方式浇灌根箱2至3次。这通过称重根箱，并加水以补偿步骤1.2.11中记录的重量差异。然而，当植物生物量显著且用水需求增加时，应考虑生物量，并相应调整浇水量。
   7. 具体的作物管理措施（如施肥）根据实验环境、土壤特性、栽培植物种类以及植物生长期间的病害防治需求进行。
   8. 生长期和根部渗出采样在很大程度上取决于根箱大小、植物种类及研究目标。

3. 根渗出采样 ^12,26

注意：本文提供关于根部渗出物无损采样的详细信息。确保采样前已准备好所有所需材料，并在采样过程中包含实验空白样本。材料和化学品的详细信息列于 材料表中。

1. 在采样前一天或至少2小时，缓慢将根茎箱的含水量提升至90%−95% WHC（高度敏感的作物为80%）。这可以通过先计算步骤2.1.9中需添加的水量（_mw加）准确实现，使用90%−95% WHC，然后重新计算根箱的总重量、湿土和植物重量估算。利用天平，添加去离子水直到根茎达到重新计算的重量。
2. 从根箱中解开铝箔，识别并在前板上绘制感兴趣区域。此步骤仅在仅采集根段或幼植时必要。
3. 根据感兴趣的区域和根箱大小，将塑料箔和ZrOH水凝胶（参见步骤1.3）切割成指定尺寸。如果填充过程中未安装核孢子膜，则将其切割至所需尺寸，略大于ZrOH水凝胶。
4. 将根茎箱放在一个平坦的支架上，前面板可拆卸朝上，小心打开（见 图2A）。慢慢取出塑料箔，同时确保根部和土壤不受扰动。
5. 将尺子放置在感兴趣区域，捕捉高分辨率照片，这些照片将用于后续数据处理。尺子作为参考，直接从图像中确定尺寸，尤其是在需要采样多个根箱时。
6. 向目标根部区域添加少量水，直到表面出现薄水膜（见 图2B）。土壤中较高的含水量（理想为90%–95%的WHC，或对氧应激高度敏感的作物为80%）有助于采样时土壤与凝胶的良好接触。更高的含水量是保持分子持续流向水凝胶的必要条件。
7. 将预切好的核孔膜直接放置在感兴趣的土壤表面/根部区域，并确保其平整地贴合土壤-根部界面（见 图2C）。
8. 将ZrOH水凝胶直接且尽可能平整地放置在感兴趣区域的核孔膜上，并与放在ZrOH水凝胶左侧的尺子一起拍照（见 图2D）。尺子可以帮助确定ZrOH水凝胶的大小，并在采样过程中性质变化时确定采样面积，并在长时间储存（>1年）期间识别侧面。
9. 通过在ZrOH水凝胶上覆盖塑料箔（见 图2D），保护ZrOH水凝体免受前板影响。
10. 轻柔关闭根箱以减少ZrOH水凝胶的移动。关闭根箱时，也可以通过用乙烯基电工胶将凝胶夹层（核孔膜+ZrOH水凝胶+塑料箔）贴在根箱的干净前板上，如Wagner等人所述，²⁶页，以实现ZrOH水凝胶的最小移动。
11. 再次用铝箔包裹根茎箱，放回生长室/温室24小时。根部渗出物可以采集时间长短，前提是凝胶不干燥，且根据实验设置和研究目标而定。
12. 施用期结束后，轻轻打开根茎盒，小心拆除胶带和膜，取出水凝胶。将水凝胶放入无菌密封袋中，闭合前滴几滴水，然后存放于冰箱（4°C）直到分析结果。空白凝胶应以类似对照的方式保存。为进行二维测绘，将ZrOH水凝胶与塑料片一起取出并在顶部做标记。
13. 去除根部，确定根的形态参数、新鲜重量和干重，如果未进行时间分辨率实验，便于渗出数据归一化。
14. 如果进行了时间确定的研究，请关闭根箱并将其放回气候室或温室。

4. 羧酸盐的洗脱与测量¹²

注意：准备空白样品和标准时，必须使用新鲜的一级实验室水和高纯度分析标准。作为质量保证，应使用认证的质量控制标准。在分析前，通过0.2微米或0.45微米尼龙过滤器过滤样品，确保溶液（样品和标准）无颗粒，以防止管路堵塞。材料和化学品的详细信息列于 材料表。

1. 取出装填和空白的ZrOH水凝胶，用尺测量尺寸，然后用0.25毫米间隔器和0.64毫米厚度计算每个水凝胶的体积。二维测绘时，使用干净的剃刀片将ZrOH水凝胶切割成所需大小。请记住，下限约为2 x 2 mm，因为切割较小块和处理适当洗脱体积较为困难。
   注意：与其使用尺子，不如在用于切割的有机玻璃板一侧使用方格纸（毫米方格纸），这样更容易将ZrOH水凝胶切割成近乎完美的块。ZrOH水凝胶的厚度通过游标卡尺确认。
2. 将ZrOH水凝胶或ZrOH水凝胶片段放入塑料瓶中，按1毫升洗脱剂与0.196^厘米3 ZrOH水凝胶的比例加入0.5摩尔^L-1 NaOH冲洗，然后在板摇机上摇晃24小时，转速150转/分钟。
3. 如果洗脱体积很低，比如非常小的（例如2 x 2 mm）ZrOH水凝胶，则根据用于羧酸盐定量分析方法的最小体积，添加实验室一级水（按重量计），达到45-60微升（例如IC-MS的自动取样仪至少需要45微升样品，视仪器而定）。记录为达到45-60微升所需的确切添加水量，因为这对稀释因子和实际浓度计算至关重要。
4. 过滤样品（0.2微米或0.45微米尼龙滤芯）后转移到小瓶中。我们建议使用1.5毫升塑料IC小瓶，因为它们可以冷冻而不破裂。330微升小瓶也可用于较小容量，但必须注意避免气泡存在。
5. 通过首选分析方法（如IC-MS、HPLC）定量洗脱溶液中的羧酸盐。我们建议结合IC与MS检测进行分离。或者，也可以将高性能或超高性能液相色谱（HPLC或UHPLC）与多种探测器结合使用，包括先进的MS（如飞行时间探测器或Orbitrap）或分光光度探测器。
6. 测量结束后，样品与标准品一起可以存放在冷冻室。我们建议所有含羧酸盐的溶液在-20°C下储存，最长保存一年。对于储存时间超过1年，可以制备新的标准品并测量，作为质量检查。
7. 计算洗脱物总体积中每种羧酸盐的总量（即NaOH体积+水凝胶体积+添加水），并按根重或根面积归一化，再乘以洗脱效率因子：乌头酸盐0.94，柠檬酸盐1.00，富马酸盐0.90，乳酸1.02，苹果酸1.05，草酸0.91，肉桂酸盐1.00（见 补充表1）。确保在洗脱和测量过程中考虑了稀释因子。

5. 二维映射

注意：目前没有专门用于创建渗出数据二维图像的软件。映射可以用Microsoft Excel和Python完成。

1. 将步骤4.7中从每个凝胶片段获得的数据插入其对应的二维网格单元格（行×列）。网格基于采样过程中从根部拍摄的照片生成（见步骤4.1）。
2. 定义网格大小，并验证数据是否匹配。
3. 选择颜色刻度，并指定代表最低和最高值的颜色代码。
4. 指定图例的数值数据范围，以确保准确匹配所选刻度。
5. 创建热力图，并确保没有标签或网格线。热力图可以在 R 软件中轻松创建，使用 补充文件 1 中提供的示例 R 脚本。
6. 处理图像后，将其与采样时获得的根系照片相邻对接，以便解读羧酸盐的空间分布。
   注意：如今，绘图也可以通过人工智能工具完成。过程很简单：只需将Excel中的数值网格复制粘贴到聊天中，然后请求一个包含图例所需凝胶块尺寸和颜色刻度的热力图。请记住，第一次尝试的结果可能并不总是完美，但重复这个过程通常能获得准确的结果。这种方法比手动方法更快。

Results

ZrOH水凝胶方法最初用于从土壤植物根部采样柠檬酸盐，并成功解析了渗出^物11的空间分布。在采用该方法用于其他羧酸盐之前，我们对ZrOH水凝胶进行了表征，以确保其适合与其他羧酸盐一起使用（见 补充表1）。此外，我们还洗脱并分析了2019年进行的根箱实验中载荷储存的ZrOH水凝胶。ZrOH水凝胶可在5小时内（~0.2微摩尔，10毫升）吸收100%的载荷量，适用于乌头酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、草酸盐和琥珀酸盐，采用Tiziani等人¹² 人设定的相同洗脱参数（1 mL，0.5 mol ^L-1 NaOH）。ZrOH水凝胶可结合多达3.29 μmol ^cm-2 ±0.40 μmol ^cm-2 的羧酸盐（见 补充表1），远高于根际中通常存在的（通常在nmol范围内）的浓度。此外，羧酸盐载荷ZrOH水凝胶保持稳定，可在分析前储存数周，从而最大限度地减少采样期间及采样后的微生物降解。

图3结果展示了柠檬酸盐渗出物沿土壤生长的Lupinus albus L（羽扇豆）植物簇根沿空间分布的二维可视化，该植物在缺磷土壤中栽培。该图包含48项单独测量，测量内容为5 x 2毫米的凝胶块，ZrOH凝胶于2025年8月切片，此前于2019年8月采样。显然，ZrOH水凝胶有效吸收了渗出的柠檬酸盐，即使在小凝胶（0.10 cm²）上也能获得可量化的结果，无需对洗脱液进行预浓缩。柠檬酸根部最高的渗出率出现在簇根区（最高可达2.8 nmol ^cm-2 gel ^h-1），^{第一天转化}为67.2 nmol ^cm-2凝胶，而最低速率仅在与土壤接触的凝胶片段上观察到。簇根长度从0.2毫米到15.6毫米不等，总长250毫米。这些结果证实了水凝胶适合进行根释放羧酸盐采样24小时。ZrOH水凝胶还能结合其他羧酸盐，如乳酸盐、富马酸盐、苹果酸盐和草酸盐，除了柠檬酸盐外（见表1）。ZrOH水凝胶中大部分羧酸盐的检测结果显示羧酸盐降解极小。然而，实验仍在进行中，以收集更多关于来自不同植物物种的七种检测羧酸盐的信息。

图1： 聚丙烯酰胺凝胶制备的关键步骤。（A）玻璃板组件的对齐，偏移~1毫米。（B）凝胶铸造，（C）从板中心均匀涂抹凝胶溶液。（D）用剃刀片从角落撬动玻璃板。（E）浸泡凝胶以帮助将其从玻璃板上剥离。（F）将凝胶冲洗到烧杯中。 请点击此处查看本图的放大版本。

图2： 使用ZrOH水凝胶采集根箱生长植物根系一段根部渗出物。（A）拆除前板和塑料后打开根箱。（B）使用洗瓶中的去离子水适当润湿土壤-根界面。（C）核孔轨迹蚀膜附着于湿润的土壤-根界面。（D）在感兴趣区域涂有ZrOH水凝胶的根箱，覆盖塑料箔以保护前板。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：使用ZrOH水凝胶进行根部渗出采样及柠檬酸盐渗出的毫米级二维图像。 （A）采样过程中叠加在感兴趣根部区域的ZrOH水凝胶照片，以生成用于制图的网格。（B）毫米级二维图像，显示柠檬酸盐渗出速率分布（nmol cm^–2，凝胶H^–1），生长于缺磷土壤中的白色白羽扇豆（Lupinus albus， L. L. （羽扇豆）簇根。每个网格代表一块5 x 2毫米的凝胶片。请点击此处查看该图的放大版本。

工厂	治疗	附头	柠檬酸盐	富马酸盐	乳酸盐	苹果酸	草酸盐	简短
	mg P kg-1 土壤	NMOL CM-2 H-1
鲁邦	50		0.02	0.21	0.15	<洛克	0.06	<洛克
鲁邦	250		0.02	0.4	0.17	0.02	0.2	<洛克
鲁邦	250		0.05	0.31	0.09	0.01	0.19	<洛克
鲁邦	0		0.03	0.21	0.15	0.02	0.1	<洛克
赖斯（DJ123）	250		0.01	0.24	0.04	0.02	0.1	<洛克
赖斯（DJ123）	250		0.01	0.39	0.12	<洛克	0.1	<洛克
米（Nerica4）	50		0.01	0.24	0.35	<洛克	0.09	<洛克

表1：土壤生长的 Lupinus albus L.（羽扇豆）和 Oryza sativa L.（水稻）植株在0、50和250 mg P ^kg-1 土壤下的乌头酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、草酸盐和琥珀酸盐的渗出速率。LOQ是量化极限

补充表1：七种羧酸龧酸铻羟水凝胶的洗脱参数（1 mL，0.5 mol ^L-1）及溶解度（洗脱效率和修正系数）及容量。数据为平均标准差±均值（单羧酸盐的洗脱效率和容量为 n = 4，羧酸盐混合物为 n = 40）。请点击此处下载此文件。

补充图1：推荐的根箱示意图，便于浇水。根箱由一个根箱框架组成，底部和背面均有间距的水孔，便于浇水时水的均匀分布，并配有可拆卸的透明前板，用于监测实验期间根系生长。请点击此处下载此文件。

补充图2：根箱组装及土壤填充过程。 （A）用胶带封住根箱框架背面的孔洞。（B）在根箱框架的前端或开口侧贴上（核孔膜），然后贴上塑料薄膜（确保足够紧密且平整）。（C）放置前板并夹紧根箱。（D）填充根箱时将其倾斜向前，使细颗粒落在可拆卸表面上，获得如图所示的光滑表面。（E） 或者，从开口侧填充覆盖的根箱框架（A），用可拆卸板调平，然后用核孢子膜、塑料箔和前板覆盖。（F） 根茎箱的最终安装，浇水并种植。另一种填充方法见Wagner等（2020）。请点击此处下载此文件。

补充文件1： 文件包含用于生成热力图的R脚本详细信息。请点击此处下载该文件。

Discussion

本文描述的羧酸盐采样方法使用了ZrOH水凝胶，因此正确的凝胶制备和处理至关重要。处理ZrOH水凝胶时，建议保持其湿润，并滴入几滴实验室级水。在制备过程中，制备凝胶混合物后应及时铸造凝胶（步骤1.1.3），并确保玻璃板间无气泡形成。位于ZrOH水凝胶中心的气泡尤为关键，因为它们可能干扰采样。相比之下，边缘的气泡可以通过施用前修剪凝胶去除。此外，根释放的羧酸盐会与水凝胶中的沉淀ZrOH结合，因此在沉淀过程中Zr的均匀分布至关重要。胶体内不均匀的Zr分布可能导致羧酸盐的横向扩散，扭曲其空间分布并降低二维定位的^{可靠性。通过}将聚丙烯酰胺凝胶浸泡在ZrOCl₂·8H₂O溶液中超过2小时，并在较宽的烧杯中放置较少的凝胶（步骤1.2.3^）来实现Zr的均匀分布。此外，Zr分布可依Guan等人开发ZrOH水凝胶的建议，使用扫描电子显微镜（SEM，S-3400N II，日本日立）验证。然而，SEM作为大型样品的标准程序尚不可行。

另一个关键步骤是根箱填充、核孔膜的施用以及在凝胶施用前的浇水，用于羧酸盐采样。填充和处理沙质或重粘土土壤时必须特别注意，确保表面均匀光滑，这对于胶体接触的正确且保持排水良好至关重要。光滑的表面对于核孔膜的正确附着也至关重要。确保核孔膜正确附着于土壤表面且气泡最小，确保根部与ZrOH水凝胶之间的良好接触至关重要。在施用ZrOH凝胶之前，还必须充分饱和土壤，以确保ZrOH水凝胶牢固附着、平整并保持湿润，以保持采样时的完整性。在切割凝胶进行二维羧酸盐测绘时，实现毫米级精确切割具有挑战性;因此，我们建议分辨率不低于2 x 2毫米。此外，由于凝胶干燥后会收缩，取样后保持湿润以保持完整性至关重要（步骤3.12）。本方法源自Tiziani等人¹² ，他们建议使用NaN₃ 作为微生物抑制剂以防止羧酸盐降解。在本方案中，我们不使用任何微生物抑制剂，这些抑制剂通常用于采样根部渗出物（NaN₃ 或micropur，一种基于AgCl₃的材料）²³，因其干扰分析方法及对IC-MS系统潜在影响。

迄今为止，该方法仅验证了七种羧酸盐（乌头酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、草酸盐、琥珀酸盐），而根部外出组则由多种化合物（如酚类、氨基酸、碳水化合物和羧酸盐）复杂混合组成。这些其他重要化合物目前未被方法纳入，ZrOH水凝胶也尚未被采样。土壤中其他氧阳离子（如磷酸盐、硝酸盐）的存在可能影响羧酸盐的吸收、容量和洗脱，以及IC或HPLC上的羧酸盐定量。此外，从较大型植物（如树木或灌木）中采样非常大的整根系非常具有挑战性，因为产生非常大的ZrOH水凝胶（>30厘米）很难。然而，这是所有当前渗出物采^样技术中存在的问题8。另一个限制是根箱的使用。尽管根箱中的植物生长比水^培系统更为真实，但仍属人工结构，根系发育空间有限³³。此外，采样发生在二维表面，理论上可能导致羧酸盐在非胶体接触的其他方向流失。然而，这一限制可通过扩散、提高羧酸盐水凝胶对羧酸盐的结合能力以及施用时根圈土壤的高含水量来缓解。然而，这些方面仍需进一步验证。

ZrOH水凝胶法相比常用方法（如土壤-水培混合和水培方法）具有多项优势。该新方法允许对未受扰动的土壤根系进行原 位 取样羧酸盐、时间分辨采样（Santner、Mühlbacher等，未发表数据）以及毫米级二维测绘。此外，ZrOH水凝胶可在根部使用至少24小时¹²小时。此外，同一根段的重复采样也应能进行更长时间的分辨。该方法比类似方法（如滤纸应用）更成熟且具备更^{完善的特性}。由于羧酸盐的凝胶容量较高，ZrOH水凝胶可进行长时间采样，例如苹果酸盐最低为0.44微溶^{尔 cm²} ±最高为0.04 μmol ^cm⁻2 ，最高为1.66 μmol cm^² ±0.10 μmol ^cm⁻² ，羧酸盐混合时总共为3.29 μmol ^cm² ±0.40 μmol cm⁻^² （见 补充表1）。在土壤-水培杂交法中省略根部清洗步骤（通常每株需20–30分钟）可显著减少根系损伤及相关偏差，从而获得更真实、更具代表性的数据。

值得注意的是，载荷ZrOH水凝胶无需特殊储存条件，只需冷藏，且迄今应用中未发现洗脱后需预浓缩。ZrOH水凝胶还能结合其他阴离子，这些阴离子在相同条件下被洗脱，可用IC^14,34进行分析。这使得羧酸盐的渗出与根际层营养物质的空间分布联系^起来。

总之，这种根释放羧酸盐采样的新方法是根圈研究的基础步骤。由于羧酸盐在植物养分（如P、Fe）^35、36的动员和获取以及有益微生物的招募中起着关键作用，该方法可用于筛选品种的根性状和植物育种。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
乙醇	西格玛-奥尔德里奇		70%
草酸	西格玛-奥尔德里奇	194131-250G	98%
反乌谷酸	西格玛-奥尔德里奇	122750-25G	98%
氧化锆二氯氧化八水合物（ZrOCl2 & times; 8H2O，98%）	热力科学	A12342.22	98%
柠檬酸	西格玛-奥尔德里奇	C83155-500G	99%
硝酸钠	VWR化学	拍品编号：19H224150	100%
硝酸（HNO3）	西格玛-奥尔德里奇	CAS编号：7697-37-2	>65%用于分析，EMSURE®Reag。菲律宾欧洲、ISO认证
富马酸	西格玛-奥尔德里奇	240745-100G	>99%
氢氧化钠	西格玛-奥尔德里奇	S8045-500G	≥98%
过硫酸铵（APS_（NH4）2S2O8）	热力科学	201531000	≥98.0%，超纯度，用于电泳
琥珀酸	西格玛-奥尔德里奇	S3674-100G	≥99%
2-（N-morpholino）-乙磺磺酸（MES）缓冲剂	西格玛-奥尔德里奇	M8250-250G	≥99.5%
氯化钠	西格玛-奥尔德里奇	71376-1公斤	≥99.5%
交联剂	DGT Research Ltd（英国兰开斯特）	不	2%，琼脂糖衍生物
板式或水平振动器			Any
离子色谱法或IC-MS	赛莫菲舍尔科学	不	任何高性能或超高性能液相色谱（HPLC或UHPLC）都可以与各种探测器结合使用，包括先进的MS（如飞行时间探测器或Orbitrap）或分光光度探测器
pH计			任何实验室pH电极都可以使用。
烤箱	活页夹	不	任何能保持特定温度的小烤箱都可以使用，最好是较小的。
尼龙filters_13毫米0.45毫米及微小尺寸;M	GVS 滤波器技术	拍品编号：7135431	也可以使用较大的尼龙滤网，但更倾向于较小的，因为洗脱液体积较小。
硫酸钙二水合物	西格玛-奥尔德里奇	C3771-1KG / CAS-编号：10101-41-4	也可以使用CaSO4。
丙烯酰胺溶液，40%	G-生物科学	786-508	不要使用与......双丙烯酰胺。有毒化合物，应在有毒环境中小心处理。
根箱	https://www.rhizosphere.com/	不	我们的根盒是根据 Rhizosphere.com 设计定制的
聚丙烯小瓶套装，1.5毫升	热力科学	79812	塑料IC小瓶更受欢迎，因为它们可以冷冻而不破裂。330 和微型;也可以使用L，但必须注意避免气泡
顺式乌合酸	热力科学	A16010.06	技术 85%
N，N，N'，N'-四甲基二胺（TEMED） 四甲基二胺	西格玛-奥尔德里奇	拍品编号：BCBN1173V	有毒化合物，需谨慎处理
250毫升PP小瓶	萨斯泰特	拍品编号：2406082
铝箔	本地超市	不
Beakers_1 L/ 2 L
夹具	本地仓库	不
玻璃板（6.1 x 17 x 0.4厘米）	本地仓库	不
L-（-）-苹果酸	西格玛-奥尔德里奇	M6413-25G
乳酸标准用于IC	西格玛-奥尔德里奇	07096-100ML
层流台台
L-乳酸无水	热力科学	L13242.14
核孔径蚀Membrane_0.2 &微蚀;m	西提瓦	拍品编号：A29983896
塑料锡纸/塑料袋	本地仓库	不
塑料镊子	塞马德尼	602
有机玻璃板	本地仓库	不
PP 30毫升小瓶	阿普塔卡温泉	拍品编号：250552
PTFE spacer_0.25/0.4毫米，nbsp;	https://www.krishplasticindustries.com/teflon-sheet.html
剃须刀片	本地仓库	不
统治者	本地书店	不
次氯酸钠（NaClO）	卡洛·埃尔巴试剂	计算机系统编号：7681-52-9
Syringes_1毫升	亨克·萨斯·沃尔夫（亨克-喷气机）	拍品编号：22A17C8
乙烯基电工胶带	本地仓库	不