大鼠慢性颅内多电极脑电图记录的术后恢复与稳定性

摘要

本方案概述了大鼠慢性多电极脑电图（EEG）植入术后评估的标准化框架，包括对信号质量、行为恢复和神经炎症标志物的序贯监测，以确定启动稳定长期记录的合适时机。

摘要

颅内多电极植入技术能够同时采集多个脑区的神经信号，但手术后可能引入干扰因素，影响数据质量和实验时间安排。本方案描述了一种在斯普拉格-道利大鼠中进行慢性多部位颅内脑电图电极植入及系统化术后评估的标准化操作流程。采用旨在最小化组织损伤的手术策略，通过立体定位将钨丝电极植入三个预设的颅内位点（前扣带皮层、海马CA1区和内嗅皮层）。

植入后，该方案规定在五个方面进行纵向评估：电极定位准确性、局部场电位完整性、疼痛相关行为、摄食行为以及神经炎症标志物。在预定的术后时间点（基线以及术后第1、4、7、10和13天）进行电生理学和行为学评估，以持续监测术后早期效应（n = 3）。在研究结束时通过组织学分析表征局部组织反应（每个时间点n = 3）。

提供了操作标准和评估时间间隔，以指导有关实验准备情况和启动长期记录的决策。本方案为植入后的监测提供了系统化的方法，并为后续神经生理学实验的合适时机提供依据。

引言

颅内脑电图（EEG）通过直接从脑组织记录信号，能够实现对神经活动的高分辨率测量^1,2，在空间特异性和信号保真度方面优于头皮 EEG 技术³。多区域颅内记录可揭示网络水平的相互作用，广泛用于研究认知和疾病背后的神经动力学机制，且在啮齿类动物模型中常被用于机制性和纵向研究^4,5。

钨丝电极因其机械稳定性和生物相容性，常被用于慢性记录^6,7,8。然而，植入过程需要侵入性手术，可能暂时干扰神经生理、组织完整性以及动物行为^9,10,11。在植入后的早期阶段，急性手术应激、局部炎症、胶质细胞反应以及摄食或伤害性行为的改变等挑战，可能影响信号质量及实验结果的解读^12,13,14。然而，这一恢复期目前仍主要依赖经验判断，文献报道的恢复时间窗从5到7天不等^15,16。相反，过长的延迟可能引入与组织重塑或电极位移相关的额外混杂因素¹⁷。

尽管慢性颅内脑电图（EEG）已被广泛使用，但目前尚无标准化的框架用于整合电生理学、行为学、炎症和组织学评估，以指导实验时机的选择。因此，本方案通过概述一种系统性方法，填补了这一空白，即在麻醉状态下的6周龄Sprague–Dawley（SD）大鼠慢性颅内多电极植入模型中评估术后状态。该方案采用植入前扣带回皮层（Cg1）、海马CA1区和内嗅皮层（EC）的钨丝电极，对电极稳定性、脑电（EEG）信号特征、行为学指标以及炎症标志物进行为期两周的纵向评估。尽管出于操作便利性，各项评估均在全身麻醉下进行，但该方法并不影响建立电极植入与稳定性的评估框架这一主要目标。本方案旨在指导术后监测，并为启动后续神经生理学研究提供一致且可靠的时间点判定依据。

方案

所有动物实验均按照机构指南进行，并经首都医科大学 Institutional Animal Care and Use Committee 批准（批准编号：AEEI-2024-391）。

1. 动物准备

1. 获取6周龄雄性SD大鼠（体重220–230 g）。将动物饲养于特定病原体阴性环境（24 ± 2 °C，50 ± 10%湿度，12小时光照/黑暗循环）中，并提供食物和水 随意手术前对大鼠进行7天的适应性饲养。
2. 电极植入后，在相同环境条件下单独饲养大鼠，以防止对头戴式装置造成损伤。
   注意：研究流程图及相应测量指标如下所示 图1A试剂和设备列于下文 材料表.

2. 多电极植入手术

1. 使用异氟烷（诱导浓度 3–4%，维持浓度 2%）与 2 L/min 的氧气混合气体对大鼠进行麻醉。
2. 将大鼠固定于立体定位仪中，并使用温控加热垫维持体温在 37 °C。涂抹红霉素眼膏以防止角膜干燥。
3. 剃除头皮毛发，并用 0.5% 碘伏溶液消毒。
4. 沿中线做头皮切口（1 × 2 cm），暴露颅骨，使用无菌棉签轻轻去除骨膜。
5. 颅骨准备与钻孔
   1. 确定前囟（bregma）和后囟（lambda）位置，并在前后和内外两个方向上将颅骨调平。
   2. 使用低速牙科钻在目标坐标处钻孔（孔径 ≤2 mm），钻孔过程中间断用生理盐水冲洗降温。
6. 电极准备与植入
   1. 使用聚酰亚胺绝缘的钨丝电极（电极杆直径：300 µm），电极尖端裸露长度为 4–8 mm（平切端）。在 1 kHz 频率下测量电极阻抗（|Z|），可接受范围为 7–10 kΩ，相位角范围为 1°–2°。
   2. 将电极缓慢植入以下脑区：Cg1（前扣带皮层）：AP +1.2 mm，ML −0.2 mm，DV −2.4 mm；CA1（海马）：AP −3.3 mm，ML −1.8 mm，DV −3.0 mm；EC（内嗅皮层）：AP −6.7 mm，ML −4.0 mm，DV −8.0 mm。
   3. 在对侧 CA1 区域上方植入一颗不锈钢颅骨螺钉，作为接地电极。
7. 电极固定与缝合
   1. 在植入过程中，依据立体定位坐标确认电极植入深度和靶点准确性；术后通过组织学方法识别电极轨迹以验证电极定位。
   2. 使用牙科树脂固定电极和螺钉（每层固化 30–60 秒）。
   3. 将电极引线连接至头端连接器，并缝合周围皮肤。
8. 在维持麻醉状态下，记录 30 分钟基线脑电图（EEG）活动（图 1A）。

3. 术后护理与操作

1. 将大鼠置于加热垫上恢复，直至完全恢复自主活动能力。
2. 在温湿度受控的环境中饲养的家鼠，垫料柔软 随意摄取 自由获取食物和水以减轻应激。
3. 每日检查切口部位、电极稳定性和前置放大器的完整性。
4. 单独饲养动物，每日进行伤口护理（0.5%碘伏溶液），并监测其福利状况，不使用药物以避免混杂效应，与既往研究一致^6,18.

4. 纵向脑电图记录

1. 在植入后的第1、4、7、10和13天进行脑电图记录。
2. 使用异氟烷麻醉大鼠（诱导浓度3–4%，维持浓度1.5%）。
3. 固定记录电缆以尽量减少运动伪迹和电磁噪声。
4. 每天上午9:00开始记录脑电图，持续30分钟，以控制昼夜节律变异的影响。
5. 采用以下采集参数：采样率：1,000 Hz；硬件带通滤波器：0.5–40 Hz；增益：8–10。后续额外的滤波和伪迹剔除在离线状态下进行。
6. 合格的脑电图信号应显示稳定的基线、极低的噪声或漂移，并具有符合生理学规律的振幅和频率成分；不符合上述标准的记录应予以排除。

5. 脑电图信号分析

1. 使用参考软件分析脑电图（EEG）信号。
2. 目视检查信号，并去除含有运动或电伪迹的片段。
3. 使用快速傅里叶变换（pwelch函数）计算功率谱密度（PSD）。
4. 通过计算预定义频段内功率谱密度曲线下的面积（AUCpsd）来量化振荡活动。
5. 计算信噪比（SNR），即目标信号频段（0.5–40 Hz）功率与背景噪声频段（40–80 Hz）功率的比值。
   注意：稳定的信号在连续记录日之间表现出一致的PSD谱型。

6. 疼痛评估

1. 在手术前1天（基线）及所有记录日，使用大鼠面部表情量表（Rat Grimace Scale）^19,20 评估疼痛。
2. 使用观察箱（25 cm × 15 cm × 15 cm），将相机置于左上角，呈45°角。
3. 采集面部图像，随机化图像顺序，并对眼眶紧缩、鼻/颊部扁平、胡须变化和耳部位置进行评分（0–2分制）。
4. 将各项评分相加，得出每只动物在每个时间点的总疼痛评分。

7. 摄食行为与体重

1. 每日称量大鼠体重并测量食物摄入量。通过在24小时后从预称重的食物中减去剩余饲料来计算食物摄入量。
2. 使用视频记录系统连续记录大鼠行为24小时。由对实验条件不知情的实验人员离线分析摄食行为。
3. 持续监测摄食情况。将一次摄食事件定义为持续时间≥1次、持续5秒至15分钟的活动²¹。
4. 计算体重校正后的摄入量（摄入量g × 100/体重g）；每餐平均摄入量（g/摄食事件次数）；以及摄入速率（g/总摄食持续时间min）。

8. 神经炎症评估

1. 使用过量异氟烷实施安乐死后，进行断头处理。
2. 在基线以及术后第 1、4、7、10 和 13 天（每个时间点 n = 3）收集植入侧半脑的脑组织。
3. Western blotting
   1. 从脑组织中提取总蛋白，并使用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白浓度。将所有样品调整至终浓度为 2 µg/µL，并在 100 °C 下变性 5 分钟。
   2. 采用 10% SDS-PAGE 电泳，每孔上样 20 µg 蛋白，在 120 V 条件下电泳 90 分钟。
   3. 将蛋白在 300 mA 条件下转印至 PVDF 膜，持续 1 小时。
   4. 封闭膜后，加入针对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的一抗（1:1,000），4 °C 过夜孵育。
   5. 加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1:20,000，室温孵育 2 小时）。
   6. 使用 ECL 显色，并采用化学发光成像系统在自动曝光模式下成像。
   7. 使用 ImageJ 软件进行条带密度分析。

9. 安全与废物处理

1. 使用活性废气清除系统操作异氟烷。
2. 将锐器和生物组织丢弃至指定的生物危害容器中。
3. 根据机构安全规定处置化学试剂。

结果

所有21只SD大鼠均耐受颅内电极植入手术，并完成了研究方案。纵向指标（脑电图、体重、摄食行为和疼痛评分）在相同动物中于不同时间点（n = 3）进行采集，而神经炎症评估则为各时间点的终末性检测指标（每天n = 3只大鼠：基线、第1、4、7、10、13天）。数据正态性采用Shapiro-Wilk检验进行评估。符合正态分布的数据以均值±标准误（SEM）表示，组间比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析，并进行Bonferroni校正。非参数数据采用Kruskal-Wallis检验，并结合Dunn's事后检验进行分析。双侧p < 0.05被认为具有统计学显著性。脑电图信号恢复定义为连续时间点间AUCpsd达到平台期，而摄食行为、体重和RGS评分的恢复则以恢复至基线水平为判断标准。

电极定位
第13天的组织学验证证实，电极尖端准确地位于Cg1、海马CA1区和内嗅皮层（EC）内。电极轨迹与立体定位坐标一致，如图2所示。

讨论

在啮齿类动物中，用于脑电图监测的慢性颅内电极植入技术仍是研究神经动态的高时间分辨率核心方法。建立适当的术后监测和恢复期对于确保信号的可靠性以及动物福利至关重要。本研究为评估SD大鼠多电极植入后的电生理稳定性、行为学结果及炎症反应提供了系统性框架，为长期记录方案的实施提供了实用指导。

脑电图、行为学及生理学恢复
本方案采用电生理、行为学与生理监测相结合的框架，证明在多电极植入后，颅内脑电图（EEG）信号会经历一个可预测的稳定过程。术后第1天，各脑区（Cg1、CA1和EC）的EEG谱功率均出现初始下降，但在3–4天内即趋于稳定。这种早期抑制现象与既往研究结果一致，归因于手术造成的组织损伤、胶质细胞激活以及电极周围局部炎症反应所引发的术后脑电活动紊乱^22,23。重要的是，功能性EEG恢复早于神经炎症标志物的完全消退，提示突触可塑性²⁴和微环路适应

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
活性异氟烷清除系统	RDW	R510-31-6
实验动物	Charles River
BCA检测试剂盒	Solarbio	PC0020
ChemiDoc成像系统	Bio-Rad	17001401
牙科树脂	Vertex	XG473P03
ECL检测试剂	Solarbio	PE0010
红霉素眼膏	Renhe	1.00E+11
山羊抗兔二抗	Proteintech	SA00001-2
GraphPad Prism 9.0	GraphPad Software		统计分析软件
前置放大器	BIOPAC Systems Inc	EEG100C
加热垫	YuYan technology	S-100
ImageJ	美国国立卫生研究院		图像分析软件
IL-6多克隆抗体	Proteintech	21865-1-AP
碘伏	Cleanboom	430-DFXDY100
异氟烷	RWD	R510–31
配备NeuroExplorer（v 5.012）的神经记录装置	Plexon	OPX-A1600-128-16C	电生理数据分析软件
PVDF膜	Cytiva	RPN303F
SDS-PAGE系统	Bio-Rad	1658004
立体定位仪	中实科技	ZS-PDC
TNF-α多克隆抗体	Proteintech	17590-1-AP
转膜装置	Bio-Rad	1703937
钨丝	A-M Systems	785500
视频记录系统	Basler	acA1920
β-actin单克隆抗体	Proteintech	2D4H5