不同提取方法对Terfezia claveryi体外生物活性特征的影响

Summary

Terfezia claveryi提取物的体外生物活性取决于生物物理提取方法和溶剂极性。浸渍辅助萃取（MAE）中的水提取物表现出最强的抗氧化活性，而Soxhlet萃取（SE）提取物则在SH-SY5Y细胞中诱导了更高的细胞毒性。这些结果显示，Terfezia claveryi提取物在体外生物活性上存在明显方法依赖性差异。

Abstract

Terfezia claveryi 是一种可食用的沙漠松露，传统上在干旱地区食用。近年来，由于其潜在的抗氧化、抗菌和治疗特性，它吸引了越来越多的科学关注，暗示其在食品和健康相关领域的潜在应用。然而，尽管其生物潜力的证据日益增多，不同提取策略对生物活性化合物回收及Terfezia claveryi体外生物活性特征的影响，文献中尚未明确。本研究评估了采用不同提取方法和不同极性溶剂获得的Terfezia claveryi提取物的体外生物活性。确定了萃取产率，并利用既定测试系统评估提取物的抗氧化、抗菌、抗菌膜和细胞毒性活性。抗氧化能力通过2,2-二苯基-1-苦邋輼（DPPH）、2,2′-蜾氮-bis（3-乙基苯哆哆-6-磺酸）（ABTS）和铁还原抗氧化能力（FRAP）测试进行测量，同时研究了SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中的细胞毒性效应。萃取率因方法和溶剂极性而异，其中通过超声辅助萃取法（UAE）制备的水提取物中获得的最高产率为18.40%。研究发现抗氧化活性因提取方法而异，采用浸渍辅助提取法（MAE）获得的水提取物表现出富含酚类化合物的特征，同时具有最强的自由基清除能力。对该提取物的LC-MS/MS分析显示存在九种酚类化合物;奎宁酸和绿原酸被确定为主要成分。相比之下，Soxhlet提取物在SH-SY5Y细胞中诱导的细胞毒性效果更强。抗菌和抗菌膜反应在提取方法间差异较小，表明这些活动对提取策略的依赖较弱。总体而言，这些发现表明生物物理提取方法和溶剂选择是决定Terfezia claveryi提取物体外生物活性特征的关键因素，其抗氧化和细胞毒性活性显著。

Introduction

利用各种蘑菇来改善健康、预防和治疗疾病的历史可以追溯到古代^1,2,3。大型真菌通常分为两类：上地型（蘑菇）和地下型（松^露）4。被称为沙漠松露的特菲齐亚松露（T. claveryi）是一种世界知名且可食用的松露物种，属于特菲齐亚^属5号。T. claveryi通常分布于干旱和半干旱地区，Helianthemum属植物分布广泛，^编号为6,7,8,9,10,11。近年来，癌症和神经退行性疾病等全球慢性疾病的负担显著增加，凸显了对新型、安全且有效的治疗药物的紧迫需求。根据全球健康报告，癌症仍是全球主要死因之一，而神经退行性疾病随着人口老龄化持续增加。鉴于这一日益严重的公共卫生问题，研究真菌和药用植物中天然产物作为生物活性化合物潜在来源的探究已成为重要的研究优先事^项。

与此同时，抗菌药物耐药性的快速出现对全球健康构成另一重大威胁。耐药性显著降低了传统抗生素的有效性，迫切需要替代抗菌策略¹³。来自天然来源的二次代谢物，尤其是酚类和多酚类化合物，因其多样的抗菌机制和低抗药性产生倾向而日益受到关注¹⁴。氧化应激是许多慢性疾病的基础机制因素，包括癌症、神经退行性疾病和代谢综合征。活性氧（ROS）的过度产生最终会破坏细胞稳态，导致DNA损伤、脂质过氧化和蛋白质氧化。在此背景下，能够清除自由基并调节氧化还原平衡的天然抗氧化剂被认为是减轻氧化损伤和疾病进展的有前景成分¹⁵。

松露富含不饱和脂肪酸、蛋白质、矿物质、维生素、氨基酸、酚类和多酚，这些成分与抗菌、抗氧化和抗癌特性相关，16,17,18,19,20,21,22,23,24。它们的抗氧化能力与其清除自由基的效果相关 25,26,27。在松露物种中，T. claveryi因其可食用结构、区域经济价值以及据报道的酚类化合物丰富而尤为引人注目²³。尽管关于其传统食用和生物活性的证据出现，但关于提取策略如何影响其化学成分和生物效应的综合研究仍然有限。

松露中生物活性化合物的回收受到提取参数的强烈影响，包括所应用的提取技术和溶剂极性。生物物理提取方法如超声辅助提取（UAE）、浸渍辅助提取（MAE）和索克斯莱特提取（SE）在极性化合物的能量输入、提取效率和选择性方面表现出显著差异²⁸。然而，大多数研究依赖单一提取方法或有限溶剂系统，比较这些方法对体外生物活性特征影响的研究较为有限。因此，本研究系统地比较了多种使用不同极性溶剂的生物物理提取方法，以评估T. claveryi提取物的体外生物活性。有人假设提取方法和溶剂极性会导致生物活性因方法而异。因此，本研究的目标是：（i）比较不同方法和溶剂之间的萃取产率，（ii）评估方法相关的抗氧化剂和细胞毒性活性变化，（iii）考察抗菌和抗生素膜反应，考虑其对提取策略的敏感性。

Protocol

注意：图1中示意了T. claveryi提取物的制备和分析的整体实验流程。研究中使用的所有材料均见材料表。

1. 真菌材料鉴定与制备

1. 材料收集与处理
   注：新鲜的 T. claveryi 松露于2023年5月采集，地点为土耳其中安纳托利亚省的草原和沙质未耕种（非农业）土地。采样在三个不同地点进行：德德利村（北纬38°54′15.8“，东经34°06′40.3”;海拔约1050米）、布尤卡亚帕村（北纬38°53′45.1“，东经34°19′37.5”;海拔~1020米）和阿克贾吉尔村（北纬39°01′39.9“，东经34°12′39.8”;海拔约1100米）。采集点属半干旱大陆性气候，冬季寒冷，夏季炎热干燥，年平均降水量约为380–420毫米。所有样本均在自然结果季节采集，地点为近期无农业活动的地区，以最大限度减少人为污染。
   1. 选择干净且未损坏的松露，剥皮后用蒸馏水洗三次。
   2. 将样品切成小块，遮阳干燥直到达到恒定重量（约20天）。
   3. 用机械研磨机将干燥材料粉碎，然后通过328微米（50网）筛网。
   4. 将处理后的样品放入密封袋中，置于室温下凉爽、干燥且黑暗的环境中，等待进一步分析。
2. T. claveryi 的分子鉴定
   1. 从干燥的 T. claveryi 样本中分离基因组DNA以进行分子鉴定。
   2. 用光谱光度法评估DNA的数量和纯度。
   3. 通过使用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATGGC-3′）扩增内部转录间隔区（ITS）来进行物种鉴定聚合酶链式反应（PCR）。
   4. 通过电泳在1x超氧钛缓冲液中制备并紫外线照射下的1.5%琼脂糖凝胶上解析PCR扩增产物。
   5. 按照制造商说明纯化单带PCR产品²⁹。将纯化扩增剂置于桑格测序。
   6. 使用contig assembly程序（CAP）算法将正向和反向序列读取转换为共识序列。
   7. 通过将共识ITS序列与公共数据库中的参考序列进行比较，确认了物种身份。
      注：实验室收藏中保留了一份T . claveryi 的凭证样本以备未来参考。物种鉴定通过基于ITS的分子分析得到确认（补充文件1）。

2. 真菌材料的制备与提取

1. T . Claveryi 提取物的制备
   1. 重量约30克干燥 的T. claveryi 粉末。
   2. 加入150毫升溶剂（甲醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯或蒸馏水），以保持所有提取方法中的固液比恒定。
   3. 所有提取程序均使用分析级溶剂。
   4. 在减压下使用定性滤纸过滤每种提取物。
   5. 利用旋转蒸发器在30–45°C的低压下浓缩滤液。
   6. 对浓缩提取物进行冻干（冻干）直到完全去除溶剂。
   7. 将干燥原油提取物储存在−20°C，等待进一步分析。
      注意：对所有样品采用相同的提取后处理步骤，以确保方法学的一致性和可比性。
2. 生物物理提取方法
   1. 浸泡辅助提取（MAE）
      1. 将粉末状 的T. claveryi 样本放入密封提取容器中。
      2. 加入选定的溶剂，同时保持溶剂与固体的比例保持不变。
      3. 在室温下、黑暗条件下孵育72小时。
      4. 保持容器关闭以防止溶剂蒸发。
      5. 浸泡期间不要施加外部搅拌。
      6. 让混合物在提取期结束时沉淀。
      7. 在进一步加工前过滤提取物。
   2. 索克斯莱特提取（SE）
      注意：确保冷凝器水流通良好，避免在反流时干热。
      1. 将粉末样品放入纤维素提取顶针中。
      2. 将顶针放入连接圆底烧瓶的索克斯莱特提取室内。
      3. 将选定的溶剂加入烧瓶，同时保持溶剂与固体的比例不变。
      4. 利用恒温加热罩加热溶剂至回流。
      5. 保持连续拔牙24小时。
      6. 保持萃取温度在每种溶剂的沸点（正己烷：68.7°C;乙酸乙酯：77.1°C;甲醇：64.7°C;丙酮：56°C;蒸馏水：100°C）下保持萃取温度。
   3. 超声辅助拔牙（阿联酋）
      注意：持续监测温度以防止超声波时过热。
      1. 将粉末状的 T. claveryi 样本放入提取容器中。
      2. 加入选定的溶剂，同时保持溶剂与固体的比例保持不变。
      3. 以固定频率35 kHz和输出功率520瓦对混合物进行超声处理，持续25分钟。
      4. 保持提取温度约为30°C。
      5. 每5分钟加冰，以保持超声波时温度在25–28°C之间。
3. 提取效率
   1. 在提取前称重干燥的真菌物质（W_p）。
   2. 在完全去除溶剂后称重干燥原油提取物（W_ext）。
   3. 使用公式（1）计算提取效率。
      (1)
   4. 将每颗干燥的原油提取物重新溶解在相应溶剂中，制备标准化浓度10 mg/mL的存液。
   5. 在每次 体外 生物活性实验前，应新鲜制备库存溶液。
      注意：标准化所有提取物浓度，以确保后续生物活性检测的剂量一致。

3. 抗氧化活性的测定

1. 使用DPPH、ABTS和FRAP等检测法进行抗氧化活性分析。
2. 从新鲜制备的存制液中，准备五种不同浓度从0.25到1.0 mg/mL不等的提取物。
3. 所有测量应三份进行，以确保可重复性。
4. 使用微板读取器以光谱光度法记录吸收值。
   注意：所有检测均遵循既定文献协议，并作轻微修改。
5. DPPH激进扫地活动
   注：T . claveryi 提取物的DPPH自由基清除活性是根据文献中描述的方法评估的，略有修改³⁰。保护DPPH溶液和反应混合物免受光照照射。
   1. 制备70%甲醇中的DPPH溶液。
   2. 在517纳米处将DPPH溶液的吸收率调整为1.00±0.02。
   3. 将50微升不同浓度的提取物移液器移入微板孔。
   4. 每孔加入250微升DPPH溶液。
   5. 将反应混合物在室温下黑暗中孵育30分钟。
   6. 使用微板分光光度计测量517纳米的吸收。
   7. 用甲醇作为阴性对照，抗坏血酸作为阳性对照。
   8. 构建剂量-反应曲线并计算IC₅₀值，以量化激进的清除活动。
6. ABTS阳离子自由基清除活动
   注意：按照文献中描述的方法进行ABTS自由基扫气分析，略有修改³¹。使用前至少16小时准备ABTS自由基溶液，并保护其免受光照保护。
   1. 通过在室温下暗中培养反应混合物16小时，生成ABTS自由基溶液。
   2. 分析前将1毫升ABTS溶液与80毫升乙醇稀释。
   3. 在734纳米处将稀释ABTS溶液的吸收度调整为0.80±0.02。
   4. 将50微升不同浓度的提取物移液器移入微板孔。
   5. 向每个孔加入250微升ABTS溶液。
   6. 将混合物在室温下孵育10分钟。
   7. 使用微板分光光度计测量734纳米的吸收度。
   8. 构建剂量-反应曲线并计算IC₅₀值。
7. 铁还原抗氧化能力（FRAP）测定
   注意：按照文献中提出的方法进行FRAP测定，^略有修改。使用前应新鲜准备FRAP试剂，并保护反应混合物免受光照影响。
   1. 按照参考方案制备FRAP试剂。
   2. 将不同浓度的20微升提取物移液器移入微板孔。
   3. 加入280微升新鲜制备的FRAP试剂。
   4. 将反应混合物在室温下、黑暗中孵育45分钟。
   5. 使用微板分光光度计测量593纳米的吸收。
   6. 以Trolox为标准生成校准曲线。
   7. 抗氧化能力以每克提取物的 Trolox 当量（TE）表示。

4. 总酚类含量（TPC）分析

注意：采用文献中描述的Folin–Ciocalteu方法测定 T. claveryi 提取物的总酚类含量（TPC），并略作修改³³。在培养过程中保护反应混合物免受光照伤害。使用前应新鲜准备碳酸钠溶液。

1. 从新鲜制备的原料溶液中，以1 mg/mL的浓度制备提取物溶液。
2. 将25微升提取物移入微板孔，加入75微升蒸馏水，然后加入25微升Folin–Ciocalteu试剂。
3. 将混合物在室温下孵育6分钟。
4. 每口井加入100微升7%（w/v）碳酸钠溶液。
5. 将反应混合物在室温下、黑暗中孵育90分钟。
6. 使用微板分光光度计测量665纳米的吸收度。
7. 以戊酸为标准，准备校准曲线，计算总酚类含量，结果以每毫升提取物的mg gallic acid当量（GAE）表示。

5. 利用LC-MS/MS进行植物化学分析

注意：按照已发表的色谱方法进行LC-MS/MS分析，仅有轻微修改³⁴。将所有样品和流动相通过0.22微米膜过滤器过滤，并在分析前对流动相进行脱气。

1. 选择总酚类含量最高的提取物进行植物化学定量分析。
2. 使用反相C18柱进行色谱分离，保持在30°C。
3. 制备由（A）0.1%甲酸在去离子水中和（B）0.1%甲酸在乙腈中组成的流动相，将流速设定为0.4 mL/min，将注入体积调整为5 μL，并将总运行时间设定为17分钟。
4. 在电喷雾电离（ESI）条件下进行质谱检测，使用氮气作为干燥、鞘状和雾化气体。
5. 将干燥气体温度设为350°C，流量为12升/分钟，将鞘状气体温度设为250°C，流量为5升/分钟，并将雾化器压力调整为55 psi。
6. 为每种酚类标准准备外部校准曲线，并用相应的校准曲线定量分析物。

6. 抗菌活性测试

注意：根据既定的微生物学方案，使用琼脂井扩散法评估抗菌活性。所有微生物操作应在生物安全柜中进行无菌环境。使用前后都要消毒所有材料。

1. 选择以下类型菌株进行抗菌检测：铜 绿假单胞 菌 ATCC 27853， 大肠 杆菌 ATCC 25922， 金黄色葡萄球菌 ATCC 25923， 粪肠球菌 ATCC 29212， 蜡样芽孢杆 菌 ATCC 14579， 表皮葡萄球菌 ATCC 12228， 单核细胞增生李斯特菌 ATCC 19115， 鲍曼不动 杆菌 ATCC 17978， 痢疾志贺 氏菌 ATCC 13313， 肺炎克雷伯氏 菌 ATCC 13883，以及 气化肠杆菌 ATCC 13048。
2. 将每个菌株接种到色蛋白大豆汤（TSB）中，并在最佳生长温度下培养，直到光学密度达到OD₆₀₀ = 0.7。
3. 使用无菌拭子均匀将细菌培养物均匀涂抹在蛋白酮大豆琼脂（TSA）平板上。
4. 使用无菌软木钻孔机无菌冲孔进入琼脂。
5. 将每种提取物（100 μg/mL）加入相应孔中。
6. 在37°C下孵育18小时。
7. 测量每个井周围抑制区的直径，以评估抗菌活性。
8. 将所有实验以三倍形式进行，并将结果表示为均值。

7. 生物膜抑制

注意：使用晶紫染色法评估参考细菌菌株的抗生物膜活性。所有操作均在无菌条件下进行，避免在清洗过程中扰动附着的生物膜。

1. 选择大 肠杆 菌ATCC 25922和 铜绿假单胞 菌ATCC 27853作为参考株，并在TSB中以37°C培养，直至达到对数生长阶段。
2. 将细菌悬浮液调整为光学密度OD₆₀₀ = 0.132。
3. 将100微升萃取液（0.625–10 mg/mL）移液器移入无菌的96孔聚苯乙烯微量滴度板中，每孔加入100微升细菌悬浮液，轻轻混合。
4. 在37°C下孵育24小时。对照组使用仅含TSB的井，或不含提取物的细菌悬浮井。
5. 小心取出不粘附的细胞，用蒸馏水清洗井两遍，并让板子自然风干。
6. 向每个孔中加入200微升0.4%（w/v）晶紫溶液，培养30分钟。
7. 去除多余的污渍，用蒸馏水冲洗井口两次，让盘子完全干燥。
8. 加入乙醇溶解结合染料，并用微板读器测量595纳米的吸收率。
9. 使用公式（2）计算抗生素膜活性。
   (2)

8. 细胞培养与细胞毒性活性分析（MTT测定）

注意：根据标准细胞存活协议，使用MTT检测评估细胞毒性效应。所有操作均应在无菌条件下进行，在生物安全柜内进行，并在使用前将培养基和试剂预热至37°C。

1. 从认证细胞库获取人类神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y，并在25厘米² 培养瓶中培养Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），该培养基辅以10%胎儿牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素和1%L-谷氨酰胺。
2. 在含5%二氧化碳的加湿环境中保持培养物在37°C_{，培养细胞} 至约80%的汇合度。
3. 通过胰蛋白酶化分离细胞，将其种子植入每孔2个×10个⁴ 细胞密度的96孔板中，培养24小时以便附着。
4. 用 T. claveryi 提取物在150、300、600、1200和2000 μg/mL的浓度下处理细胞，培养24小时。
5. 取出培养基，向每个孔加入100微升含10微升MTT溶液的新鲜培养基，并在37°C下培养4小时。
6. 吸取培养基，向每个孔加入100微升二甲基亚硫酸酯（DMSO）溶解福马赞晶体，并使用微板分光光度计测量570纳米的吸光度。
7. 所有实验都做三份。

图1：实验工作流程的示意图概述。请点击此处查看该图的更大版本。

9. 统计分析

1. 使用适当的统计软件进行统计分析，并根据需要使用学生 t检验或双向方差分析（ANOVA）比较对照组和处理组。
2. 将所有数据表示为均值±均值标准误（SEM）。
3. 定义p < 0.05处的统计显著性。
4. 用星号表示统计显著性，表示如下：****表示p < 0.0001，*** 表示p < 0.001，**表示p < 0.01，* 表示p < 0.05，并用“ns”表示无显著性。

Results

T. claveryi 的分子鉴定
使用通用引物ITS1和ITS4对ITS区域进行PCR扩增，用于分子鉴定T . claveryi。 所得序列通过BLAST算法分析并与NCBI数据库中的参考序列进行比较，从而实现了最终的物种鉴定（补充文件1）。

提取效率
萃取效率因提取方法和溶剂极性而异（见表1）。对于MAE方法，提取效率按以下顺序下降：水>甲醇>乙酸乙醇>丙酮>正己烷（2.15–15.01%）。SE和UAE方法表现出类似的溶剂依赖性趋势，提取效率按以下顺序下降：水>甲醇>乙酸乙酯>正己烷>丙酮（SE：2.58–9.53%;阿联酋：3.01–18.40%）。采用阿联酋法制备的水溶液提取物获得最高提取效率（18.40%），而MAE法制备的正己烷提取物则为最低（2.15%）。本比较主要强调了同一溶剂系统内不同提取方法及不同溶剂极性间的萃取...

Discussion

本研究建立了一个比较且标准化的提取-生物活性 平台，证明提取策略是决定化学成分和生物功能的关键因素。该方案的主要方法优势在于对提取参数的严格控制，特别是固定的固液比、标准化溶剂体积、相同的萃取后处理以及生物测定前的均匀库存溶液制备。这些步骤代表了工作流程中的关键控制点。溶剂体积的变异、溶剂去除不完全或重组浓度不一致，都可能显著偏向抗氧化剂或细胞毒性比较。因此，保持相同的下游制备条件确保观察到的生物差异反映的是质性成分变化，而非浓度伪影。此外，阿联酋和水性东南水域的温度调节至关重要。超声抽取过程中的空化会产生局部的高能微环境，这些微环境可能促进质量传递，但如果控制不当，也可能使敏感代谢物不稳定。本研究中间歇冷却作为维护酚类稳定的实用排查步骤。

提取产率结果显示明显的极性依赖趋势，水产率最高，正己烷产率最低。这一模式与已建立的溶剂极性指数及先前报告一致，这些报告表明高极性溶剂35,36,37,38,39优先提取亲

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96孔聚苯乙烯微量滴定板	内斯特科学	701001	细胞培养/检测板
ABTS（2,2'-偶氮基-双铯（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸））	西格玛-奥尔德里奇	A3219	阳离子自由基清除测定
丙酮（分析级）	西格玛-奥尔德里奇	179124	萃取溶剂
乙腈（LC-MS级）	西格玛-奥尔德里奇	34851	有机流动相
鲍曼不动杆菌	空军交通管制委员会	美国弗吉尼亚州马纳萨斯	ATCC 17978
配备1290 Infinity UPLC系统的三联四联LC-MS/MS	安捷伦科技	6460	定量分析
分析柱（C18,4.6 & 乘以100 mm，3.5 & mu;m)	安捷伦科技（佐巴克斯）	959990-902	反相柱
抗氧化标准（抗坏血酸/Trolox）	西格玛-奥尔德里奇	A7506 / 238813	阳性对照
应用生物系统3730xl DNA分析仪	应用生物系统	3730xl DNA分析仪	DNA测序系统
应用生物系统与贸易;BigDye™终结者 v3.1 循环测序套件	应用生物系统	4337455	桑格测序套件
蜡样芽孢杆菌	空军交通管制委员会	美国弗吉尼亚州马纳萨斯	ATCC 14579
生物信息学分析、BioEdit软件、所用算法：CAP组建组装	宜必思生物科学	匿名	序列组装软件
纤维素提取顶针	渔夫品牌与贸易;	11724043	用于索克斯莱特提取
二甲基亚狐（DMSO）	默克	102952	溶剂
DNA分离套件（Plant&;真菌DNA分离套件（波兰）	EurX 基因矩阵	E3595	DNA分离
DPPH（2,2-二苯-1-苦肼）	西格玛-奥尔德里奇	D9132	激进扫气测定
杜尔贝科改良鹰型中型	摩羯座，nbsp;	德梅姆哈
肠道杆菌气化基因	空军交通管制委员会	美国弗吉尼亚州马纳萨斯	ATCC 13048
粪肠球菌	空军交通管制委员会	美国弗吉尼亚州马纳萨斯	ATCC 29212
大肠杆菌	空军交通管制委员会	美国弗吉尼亚州马纳萨斯	ATCC 25922
乙醇	默克	100983	溶剂
乙酸乙酯	默克	109623	萃取溶剂
胎牛血清（FBS）	摩羯科学	FBS-16A
BigDyeTerminator v3.1 循环测序套件	热扑鱼	4337455	测序套件
Folin-Ciocalteu 试剂	西格玛-奥尔德里奇	47641	总酚类含量
甲酸	西格玛-奥尔德里奇	33015	移动相加法
亚硫酸	卡洛·埃尔巴	406335	校准曲线
基因矩阵 Plant&真菌DNA分离套件	欧币及nbsp;	E3595	DNA分离套件
GraphPad 棱镜（v9）	数据可视化与统计分析	无	统计分析
加热罩	电热和nbsp;	EME30500	用于维持溶剂反流
高预备与贸易;PCR净化系统	马格比奥	AC-60005
冰	实验室级	—	阿联酋的温度控制
肺炎克雷伯氏菌	空军交通管制委员会	美国弗吉尼亚州马纳萨斯	ATCC 13883
L-谷氨酰胺	摩羯科学	德国
单核细胞增生李斯特菌	空军交通管制委员会	美国弗吉尼亚州马纳萨斯	ATCC 19115
冻干剂	Scientz	无	提取物的冻干
磁珠与横线;基于PCR的清理系统	马格比奥	AC-60005	PCR
甲醇	默克	106009	萃取溶剂
正己烷	默克	103701	萃取溶剂
青霉素/链霉素	摩羯科学	德国
铜绿假单胞菌	空军交通管制委员会	美国弗吉尼亚州马纳萨斯	ATCC 27853
滤纸（编号541）	西提瓦	1541-125 V	在提取物过滤过程中
旋转蒸发器	布奇R100	11100V101	溶剂去除
痢疾志贺氏菌	空军交通管制委员会	美国弗吉尼亚州马纳萨斯	ATCC 13313
碳酸钠	默克	106392	总酚类分析
SPECTROstar 纳米微板读取器及nbsp;	BMG Labtech		吸收度测量
金黄色葡萄球菌	空军交通管制委员会	美国弗吉尼亚州马纳萨斯	ATCC 25923
表皮葡萄球菌	空军交通管制委员会	美国弗吉尼亚州马纳萨斯	ATCC 12228
统计分析软件（SPSS，v23）	数据分析	匿名
热力科学纳米滴2000	赛莫飞世尔科学	ND-2000
色氨酸大豆琼脂（TSA）	默克	德国	—
色蛋白大豆汤（TSB）	默克	德国	—
超声均质器	Scientz	SCIENTZ-650L	超声辅助拔牙