一种供体心脏淋巴消融的小鼠模型 通过 移植研究中的电灼术

摘要

我们建立了一种新的小鼠心脏移植供体心脏淋巴管消融模型。该模型表明，破坏供体淋巴管可减轻急性排斥反应，减少心肌损伤，并延长移植物存活时间，为心脏淋巴管在移植免疫中的功能提供了新的认识。

摘要

尽管近年来心脏淋巴管受到越来越多的关注，但供体心脏淋巴系统与心脏移植后急性排斥反应之间的关系仍有待阐明。

心脏电生理活动被评估 通过 正常小鼠心脏淋巴管消融前后的心电图（ECG）检测。通过伊文思蓝注射显示供体心脏的主要淋巴管，随后进行消融 通过 电灼术。通过淋巴管消融处理的心脏建立了一种以供体心脏淋巴功能障碍为特征的心脏移植模型。对心脏移植物功能进行了评估。 通过 超声心动图、蛋白质印迹和酶联免疫吸附试验。通过苏木精-伊红（HE）染色及移植物存活时间监测，评估供体淋巴管消融对急性排斥反应的影响。

心电图结果表明，在淋巴管消融前后，心脏电生理学未发生显著变化，证实主要心脏血管保持完好无损。将伊文思蓝注射至心尖以标记淋巴管。随后使用电灼法消融主要淋巴管。完成消融操作后，对小鼠进行肝素化处理，并取出心脏。横断主动脉和肺动脉，结扎上/下腔静脉及肺静脉。随后将制备完成（已消融）的供体心脏进行移植。cTnI 水平和射血分数显示，淋巴管消融并未加重心脏损伤。苏木精-伊红染色（HE 染色）结果显示，供体心脏淋巴管的消融减轻了急性排斥反应，减少了心肌损伤，并延长了移植物的存活时间。

我们成功建立了供体心脏淋巴功能障碍的小鼠心脏移植模型，并证明清除供体心脏淋巴系统可减轻急性排斥反应，缓解心肌损伤，并延长移植物存活时间。这些发现为理解心脏淋巴系统在心脏移植中的作用提供了新的见解和基础。

引言

心脏同种异体移植物排斥反应仍是心脏移植术后最常见且最严重的并发症之一，主要分为急性细胞排斥反应和抗体介导的排斥反应。尽管现代免疫抑制疗法已显著提高了移植物的存活率，排斥反应仍然是决定移植预后的主要因素。根据文献报道，约有12%的患者在移植后第一年内至少经历一次中度或重度急性排斥反应发作¹。

心脏淋巴系统因其在移植排斥反应中的潜在作用而受到越来越多的关注。除了在液体平衡和免疫监视方面的明确功能外，淋巴系统在调节免疫反应中也发挥着重要作用。淋巴管是免疫细胞进入和离开组织的主要通道^2,3。在心脏中，淋巴网络为免疫细胞（包括淋巴细胞）的运输和再循环提供了基本的结构基础。通过这一途径，淋巴细胞从血液迁移到间质空间，执行免疫监视功能；随后，它们被引流至淋巴结，并最终返回体循环^2,4。此外，研究表明，T细胞及其亚群在急性排斥反应中起核心作用，而这些细胞的活化与迁移可能受到淋巴系统的影响⁵。

尽管已知心脏中存在淋巴管，并且其形成的网络与血管类似，但多年来其重要性并未受到同等关注。研究表明，功能性淋巴管的缺失会导致明显的心肌肥厚和水肿，表明淋巴系统在维持心脏组织稳态中具有关键作用⁶。此外，受损或缺失的淋巴引流可能降低炎性细胞清除效率，从而加剧局部炎症反应，并影响心脏重塑过程⁷。

在心脏疾病中，存在多种针对淋巴管的干预措施。在小鼠模型中，可通过构建Vegfc+/-小鼠来诱导心脏淋巴管缺陷⁸临床实践中，介入性纵隔淋巴管栓塞术⁹ 微创心包开窗术¹⁰ 可用于治疗乳糜性心包积液。对于具有Fontan循环生理特征的患者，可通过手术实现淋巴减压¹¹, 通过 经皮胸导管减压¹²或通过建立淋巴管静脉吻合术¹³. 阻塞技术包括胸导管栓塞¹⁴选择性淋巴管栓塞术¹⁵以及胸导管结扎¹⁶然而，直接以心脏淋巴管本身为靶点的干预措施仍然有限。

鉴于心脏淋巴管的重要作用，我们通过消融供体心脏中的主要淋巴管，建立了一种新型的小鼠心脏移植模型 通过 电灼术。该模型被用于研究供体移植物淋巴功能障碍对移植后急性排斥反应的影响。

方案

雄性C57BL/6J和BALB/c小鼠（雄性，6-8周龄，体重25-28 g）在无特定病原体条件下饲养。所有实验操作均依照阜外医院动物伦理委员会批准的方案进行（批准号：0108-7-800-ZX(X)-019）。

小鼠心脏淋巴管的可视化与消融
为模拟心脏淋巴功能障碍，消融了主要的心脏淋巴管 通过 电灼术

所有小鼠均被麻醉 通过 按每10克体重0.2 mL的剂量腹腔注射1.25%三溴乙醇，并在手术过程中进行机械通气。使用三溴乙醇麻醉后，BALB/c小鼠通过22号导管进行气管内插管，并连接心电图（ECG）导联图1A, 补充图 S1）。在呼吸机参数设置中，呼吸比设定为1:1或1:2，潮气量为0.3 mL，呼吸频率为100次/分钟。将导管连接至呼吸机后，密切监测小鼠状态；若小鼠呼吸频率与呼吸机同步，则视为插管成功，若呼吸频率不同步或出现腹部膨胀，则提示插管失败，需重新插管。随后于左侧第3-4肋间行胸廓切开术，切口长度约1 cm，使用牵开器暴露整个心脏（图1B随后，将5 µL伊文思蓝染料注射至心尖部心肌内，以显示淋巴管，注射后等待1分钟，使染料充分显影。图1C，E；补充图S2A-B），注意伊文思蓝应缓慢注射。可视化后，通过与既往报道的解剖学数据进行比对，确认主要心脏淋巴管的位置^17,18，使用电灼笔以10 W连续模式进行消融，凝固时间约为3-7秒（图1D，F）。消融前后监测心电图（ECG），以确保无血管损伤图1G，H最后，在进行主要淋巴管消融后，对小鼠进行肝素化处理，以备后续供体心脏的获取。手术过程的示意图如下所示 图2.

腹部异位心脏移植
小鼠腹腔异位心脏移植操作参照先前所述方法进行¹⁹。简要步骤总结如下：

供体操作步骤
在BALB/c小鼠中沿腹白线进行剖腹手术，将1 mL浓度为50 U/mL、温度为4 °C的肝素化生理盐水注入下腔静脉，同时剪断腹主动脉以实现全身肝素化。随后暴露心脏，使用8-0缝线结扎左、右上腔静脉，并在缝线远端将其切断（图3A、B）。接着，将主动脉从周围脂肪组织中分离，并在靠近主动脉弓处切断（图3C），并以类似方法分离和切断肺动脉（图3D）。胸段下腔静脉使用8-0缝线结扎，并在远端切断（图3E），随后使用7-0编织丝线结扎并切断肺静脉（图3F）。最后，将切除的供体心脏保存于4 °C的生理盐水中，以备后续移植使用；所有心脏均保存相同时间，约为30分钟，以确保实验条件的一致性。

受体手术操作
将C57BL/6J受体小鼠麻醉，准备进行腹部心脏移植。沿腹白线做腹正中切口，暴露受体小鼠的腹主动脉和下腔静脉（图4A）。使用10-0尼龙缝线结扎下腔静脉的背侧分支血管后，用血管夹阻断腹主动脉和下腔静脉中的血流（图4B）。随后，在受体小鼠的腹主动脉和下腔静脉上分别开窗，并用肝素化生理盐水冲洗血管内的血液。使用11-0尼龙缝线，采用端-侧吻合方式，将供体心脏的肺动脉与受体的下腔静脉连接，同时将供体心脏的主动脉与受体的腹主动脉连接（图4C-E）。最后，松开血管夹，恢复受体小鼠的血流（图4F）。

实验设计
实验组：使用伊文思蓝染料对 BALB/c 小鼠的心脏淋巴管进行显影，并利用电灼笔对其进行消融。将淋巴管消融后的 BALB/c 小鼠心脏移植至 C57BL/6J 小鼠体内。

对照组：使用伊文思蓝染料对 BALB/c 小鼠的心脏淋巴管进行可视化观察，但未进行消融处理。将 BALB/c 小鼠的心脏移植到 C57BL/6J 小鼠体内。

本研究中，所有实验组和时间点的样本量均保持一致，在心脏移植后24小时进行检测的每组使用5只小鼠，移植后7天检测的每组使用5只小鼠，观察心脏移植物存活时间的每组也使用5只小鼠。

收获的供体心脏在4 °C的冷生理盐水中保存30分钟，然后进行心脏移植。实验组和对照组的供体心脏均在生理盐水中保存相同的时间。

每日评估心脏移植物的搏动持续时间 通过 两组均进行触诊检查（每组 n=5）。

组织学评估与实质排斥反应（PR）评分
心肌组织样本经10%福尔马林固定48小时，随后通过梯度乙醇系列（70%、80%、95%、100%）脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，并用切片机切成4 µm切片，切片采用苏木精和伊红（H&E）染色。移植物排斥反应采用心脏移植的实质排斥反应（PR）评分进行评估，移植物损伤程度由不知分组情况的人员进行盲法评估²⁰。

超声心动图检查
采用超声系统（40 MHz 550探头换能器）评估心脏功能。将小鼠仰卧置于可360度旋转的动物平台上，脱除腹部毛发后，在1.0%异氟烷麻醉下评估心脏功能。测量心脏移植物的射血分数（EF）。 通过 M型超声心动图

心肌损伤标志物的检测
通过测定血清中心肌细胞特异性酶的表达水平来评估心肌组织损伤程度。按照试剂盒制造商的说明分析心肌肌钙蛋白I（cTnI）的水平。

蛋白质印迹法
移植心脏后24小时，采集对照组和实验组心脏移植物主淋巴管区域的心肌组织。按照此前所述方案²¹，分析了淋巴管相关标志物的表达。用心脏组织在含有蛋白酶抑制剂（苯甲基磺酰氟）的RIPA裂解缓冲液中充分裂解。在加热变性前，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度，并调整至相同浓度。随后对各组总蛋白进行分离 通过 SDS-PAGE 电泳后将蛋白转移至 PVDF 膜。用 5% 脱脂奶粉在室温下封闭 1–2 小时，随后加入相应的一抗，4 °C 孵育过夜。次日，室温下加入二抗（抗兔抗体，1:1000）孵育 30 分钟。将膜条与 ECL 溶液（1–2 mL）孵育后曝光以获取图像。

所使用的抗体如下：LYVE1 多克隆抗体（1:500）、Podoplanin 抗体（1:500）和抗 VEGF 受体 3（1:50）。

统计学分析
所有结果均以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。在比较两组数据时，根据数据分布和特征，采用学生t检验或Wilcoxon秩和检验进行统计学分析。统计学显著性定义为 p < 0.05。

结果

心脏移植物功能的评估
根据所述方案，在对照组和实验组中均建立了心脏移植的小鼠模型。在移植后24小时评估移植物的功能状态。实验组血清心肌肌钙蛋白I（cTnI）的表达水平高于对照组，但差异无统计学意义（图5A）。同时，超声心动图显示两组间移植物的射血分数无显著差异（图5B，补充图S3）。这些结果表明，淋巴清除并未引起额外的心肌损伤。

此外，对淋巴管标志物表达的分析显示，与对照组相比，实验组中LYVE-1、Podoplanin和VEGFR3的蛋白水平显著降低（图5C-H），证实了心脏淋巴管消融的有效性。

心脏淋巴消融减轻移植后移植物损伤
苏木精和伊红（H&E）染色的组织学分析&E) 移植后7天对心脏...

讨论

心脏淋巴系统是维持心脏组织液稳态和支持免疫功能的重要组成部分。通过促进间质液重吸收、脂质运输以及免疫细胞迁移，该系统在生理和病理条件下均能保障心脏的正常功能。近年来，越来越多的证据表明，心脏淋巴系统在多种心血管疾病（如心肌梗死、心力衰竭和心脏移植）中发挥着关键作用，这些疾病常伴有水肿和炎症反应²²。

在病理条件下，特别是心肌梗死（缺血性心脏病）后，心脏淋巴管功能会变得异常²³。这会损害间质液的引流，导致慢性心肌水肿，进而加重心肌纤维化和心脏功能障碍⁴。此外，受损的淋巴清除功能会阻碍免疫细胞（如巨噬细胞）及时迁移出心脏，导致炎症持续并加剧，从而妨碍心脏修复²。

在心脏移植的背景下，排斥反应仍然是一个主要的临床挑战。淋巴系统在此过程中对免疫细胞的迁移和活化具有显著影响。例如，淋巴管内皮细胞可通过分泌趋化因子招募免疫细胞，从而调节疾病的病理过程...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
电凝笔	Weitai	V70
显微镊子	Jinzhong	WA3030
显微镊子	Jinzhong	WA2040
显微持针器	Jinzhong	YZE010
显微持针器	Jinzhong	YZE020
显微剪刀	Jinzhong	YBC010
显微剪刀	Jinzhong	YBC020
持针器	Jinzhong	J32010
剪刀	Jinzhong	Y00010
小动物呼吸机	Zhuodi	DW-300