用于评估小鼠供体特异性免疫耐受的免套管缝合式颈部异位心脏移植模型

摘要

本方案介绍了一种无需使用套管、基于缝合的鼠类颈部异位心脏移植技术，旨在通过生理条件下最小化异物材料干扰，可靠地植入第二个异位心脏移植物，以评估供体特异性免疫耐受。

摘要

小鼠异位心脏移植是研究同种异体移植物排斥反应和免疫耐受的成熟模型。在耐受性研究中，通常需要植入第二个异位心脏移植物以评估供体特异性，而颈部区域提供了理想的解剖位置。尽管基于套管的技术简化了血管吻合，但这些方法引入了可能促进吻合周围炎症、改变血流动力学并干扰免疫学分析的人工材料。此外，由于基因修饰、免疫抑制治疗、受体高龄或慢性实验条件导致的血管狭窄，可能使套管在小口径血管中的放置在技术上具有挑战性。本文介绍一种无需套管、基于缝合的颈部异位心脏移植技术。该方法避免使用管腔内聚合物，保持生理血流，并减少与血流动力学改变相关的并发症。本方案包括供体和受体血管的精细准备、颈总动脉和外颈静脉的端对端显微吻合、术中通畅性评估以及术后监测策略。通过最大限度减少人工材料的使用并适应小口径血管，这种无套管技术为二次心脏移植建立了生理且可重复的实验平台。该方法可支持在小鼠心脏移植模型中开展严格的供体特异性耐受机制研究。

引言

心脏移植是终末期心力衰竭患者的一种挽救生命的干预措施¹接受心脏异体移植的受者需要终身接受免疫抑制治疗以防止排斥反应²尽管采用了免疫抑制治疗，移植物的长期存活仍受到急性和慢性排斥反应的损害，尤其是抗体介导的排斥反应（AMR）和心脏移植物血管病变（CAV）。³此外，这些治疗方案伴随显著的副作用，包括肾毒性、代谢综合征、感染及恶性肿瘤，这些均会降低移植物和患者的存活率^2,4这些挑战凸显了实现免疫耐受的紧迫性，即受体的免疫系统在无需长期使用免疫抑制剂的情况下接受供体移植物的状态。⁵实现耐受性将消除药物相关毒性，降低感染和恶性肿瘤风险，防止慢性同种免疫损伤，并允许停用糖皮质激素，从而改善代谢控制并维持移植物功能。尽管多种耐受策略在动物模型中已显示出前景，包括混合嵌合体、共刺激阻断、调节性细胞输注以及基因靶向方法，但其临床转化仍然有限^6,7,8,9一个重要的障碍是需要可靠的 体....

方案

小鼠购自杰克逊实验室。本研究纳入了6至10周龄、首次腹部心脏移植时体重为20至30克的雄性和雌性小鼠。供体和受体小鼠均饲养于马萨诸塞州总医院啮齿类动物设施的无特定病原体（SPF）环境中。所有操作均依照美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物护理和使用的指南，以人道方式实施。所有动物实验均经马萨诸塞州总医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准并在其监督下进行（方案编号：2020N000125）。材料表列出了本方案中使用的所有试剂、仪器和设备。在启动实验前必须获得IACUC的批准。所有小鼠的饲养和管理均须遵循机构指南及相关法规标准。

1. 动物与仪器的准备

1. 手术前，将所有器械在压力下暴露于250 °F（121 °C）的饱和蒸汽中20分钟以进行灭菌。所需显微外科器械如图2所示。保护显微外科器械的尖端，避免损坏。一旦发现器械破损或变形，应立即更换，以维持最佳手术成功率。
2. 受体术前护理
   1. 本方案使用先前已植入腹部异位心脏移植物的小鼠作为受体^10,11,12。确认受体小鼠健康，原手术切口已完全愈合且无感染迹....

结果

无袖带颈部异位心脏移植手术的示意图见图1。图1A展示了血管吻合的显微图像，其中供体升主动脉与受体颈总动脉行端对端吻合，供体肺动脉干与受体颈外静脉行端对端吻合。图1B展示了移植物内的血流模式：血液从受体颈总动脉流入供体升主动脉，经冠状动脉灌注心肌后，通过冠状窦回流至右心房和右心室，随后被射入肺动脉干，最终引流至受体颈外静脉。该循环模式模拟了生理性的冠状动脉灌注过程。

该手术所需的显微外科器械和手术装置如图2所示。基本工具包括手术显微镜、显微外科镊子、持针器、精细剪刀、血管夹、便携式电凝器以及10-0或11-0尼龙缝线。

供体获取与移植物制备过程如图3所示。供体小鼠使用异氟烷麻醉后，钝性分离升主动脉（AA）与肺动脉干（PT）之间的结缔组.......

讨论

小鼠心脏移植模型在推动我们对移植免疫学的理解方面发挥了关键作用。自最初的异位腹腔移植模型建立以来，这些系统已被用于表征排斥反应的细胞和分子机制、测试新型免疫抑制方案，并评估供体与受体品系中的基因修饰^8,17,31。利用近交系和转基因小鼠的能力，为在受控环境中解析免疫通路提供了独特的机会。来自小鼠模型的研究发现已为大型动物的临床前研究以及早期临床试验提供了重要依据³²。在此框架下，小鼠二次心脏移植模型使我们能够直接评估供体特异性耐受性和同种异体免疫记忆反应。本文所述的颈部二次移植模型支持对免疫耐受进行严格检验，免疫耐受被定义为在无需持续免疫抑制的情况下接受同种异体移植物⁸。耐受性是该领域的核心目标，因为目前的治疗方案虽然对T细胞介导的排斥反应有效，但无法预防抗体介导的排斥反应，且伴随显著的毒性作用³³。通过使用与.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 ml 胰岛素注射器	Covidien	8881600350	皮下注射
0.9% 氯化钠注射液	BD	1727170103	静脉注射
10-0 尼龙缝线	AROSurgical Instruments	T04A10N07-13	用于小鼠显微外科手术
11-0 尼龙缝线	ETHICON	9016G	用于小鼠显微外科手术
1 ml 注射器	BD	309659	静脉注射
30G × 1/2 针头	BD	305106	静脉注射
3 ml 注射器	BD	309657	静脉注射
6-0 尼龙缝线	ETHICON	J212H	用于小鼠显微外科手术
60 mm 细胞培养皿	FALCON	353002	用于移植物保存
彩色铝制器械盒	Fine Science Tools	20330-04	用于小鼠显微外科手术器械的消毒
棉签	Fisherbrand	14-960-3M	止血
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11251-20	用于小鼠显微外科手术
Ethiqa XR Buprofenor (CIII) VI	RX GENERICS	86084010030	镇痛
精细剪刀	Fine Science Tools	15400-12	用于小鼠显微外科手术
纱布敷料	MEDLINE	NON25334	保护移植物和肠组织
带底座加热灯	Braintree Scientific	HL-1B	术后护理
肝素钠	Northstar Rxllc.	72603-412-01	静脉注射
异氟烷	Baxter Anesthetic & Crit Care	1001936060	用于麻醉
异丙醇消毒棉片	BD	326895	手术前皮肤消毒
显微镜	Carl Zeiss	303294-9903	用于小鼠显微外科手术
小型动物毛发修剪器	Braintree Scientific	CLP-88	用于小鼠脱毛
Optixcare Eye Lube Plus	AVENTIX	OPX-4252	手术期间眼部润滑保护剂
Pivetal Alloxate (Meloxicam)	PIVETAL	21294589	镇痛
便携式电凝仪套装	McKesson Argent	42295143	用于小鼠显微外科手术
Ringer’s 乳酸盐缓冲液	Thermo Scientific	AAJ67572AP	用于移植物保存
小型动物加热垫	K&H	HM10	用于小鼠手术
Transpore 白色手术胶带	3M	7100115870	固定小鼠术中肢体、头部和尾部
血管夹	Fine Science Tools	00398-02	用于小鼠显微外科手术