利用两样本孟德尔随机化框架评估首次性行为年龄与HIV感染风险之间的关联

摘要

本研究应用孟德尔随机化方法，利用遗传工具变量评估初次性行为年龄与HIV感染风险之间的潜在关联，以减少混杂因素影响并加强因果推断。

摘要

本研究采用两样本孟德尔随机化框架，探讨初次性行为年龄（AFS）与人类免疫缺陷病毒（HIV）感染风险之间的潜在关联。分析了来自欧洲人群的全基因组关联研究（GWAS）汇总数据，包括214,547名个体的AFS数据，以及FinnGen R5数据集中357例HIV病例和218,435名对照。在进行连锁不平衡剔除和工具变量强度评估后，筛选出与AFS显著相关的独立单核苷酸多态性作为工具变量。采用逆方差加权法（IVW）、MR-Egger回归、加权中位数法、加权众数法和简单众数法评估因果效应。通过Cochran’s Q检验、MR-Egger截距分析、MR-PRESSO评估和留一法敏感性分析，评估异质性、多效性和结果稳健性。IVW分析表明，遗传预测的较晚初次性行为与较低的HIV感染风险相关（OR = 0.192，95% CI = 0.062–0.592，P = 0.004），而较早的性行为起始则对应更高的HIV易感性。多种孟德尔随机化方法得出的方向一致的结果支持了该关联的稳定性。然而，由于HIV结局分析依赖于单一数据集且HIV病例数量有限，结果应谨慎解读。这些发现支持较早性行为起始与HIV易感性之间存在潜在关联，并展示了孟德尔随机化在研究与传染病结局相关的行为危险因素中的应用价值。

引言

人类的生殖行为，包括首次性行为年龄（AFS）、性伴侣数量以及首次生育年龄，与社会、行为和健康结局密切相关^1,2。先前的研究表明，青少年首次性行为年龄有提前的趋势³。例如，在英国，首次异性性行为的中位年龄约为17岁，且报告在16岁之前发生初次性行为的青少年比例正在上升²。观察性研究还发现，较早发生初次性行为与更高概率的高风险性行为、物质使用、不良心理健康结局以及性传播感染相关⁴。

人类免疫缺陷病毒（HIV）是获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的致病因子，至今仍是全球公共卫生面临的一项重大挑战⁵。最新的全球数据显示，目前全球约有3900万人感染HIV⁶。在中国，近年来新诊断HIV感染的发病率持续上升⁷。多项观察性研究提示，初次性行为年龄较早与HIV感染及其他性传播感染的风险增加相关，尤其是在男男性行为者（MSM）中更为显著^8,9。据报道，HIV阳性男男性行为者的首次同性性行为年龄也较双性恋男性更年轻¹⁰。然而，初次性行为年龄（AFS）应主要被视为反映性暴露模式和风险行为的行為与社会指标，而非HIV感染的直接生物学决定因素。

尽管观察性研究提供了重要的流行病学证据，但这些关联可能受到残余混杂因素、社会经济因素、行为异质性以及反向因果关系的影响。孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）分析利用遗传变异作为工具变量，通过减少混杂和反向因果偏差来加强因果推断¹¹。对于评估与传染病结局相关的暴露行为而言，MR 方法尤其有价值，因为涉及性行为的随机对照试验通常不可行或不符合伦理要求。以往关于初次性行为年龄（AFS）与 HIV 风险之间关系的研究主要为观察性研究，相对较少有研究应用遗传流行病学方法来确定所观察到的关联是否反映了独立于更广泛的行为或社会经济影响之外的因果关系。

方案

本分析所纳入的所有原始全基因组关联研究（GWAS）均获得了参与者的书面知情同意，并得到了各自机构伦理委员会的批准。由于本研究使用的是公开的、去标识化的GWAS汇总统计资料，因此无需额外的机构审查委员会批准。本方案中使用的研究工具列于材料表中。

1. 数据

暴露和结局数据集的单核苷酸多态性（SNP）汇总统计信息均来自公开可获取的全基因组关联研究（GWAS）数据库。关于首次性行为年龄（AFS）的GWAS汇总统计数据来自2021年一项GWAS荟萃分析，该分析纳入了来自英国生物银行（UKB）的214,547名欧洲血统个体¹²。AFS被视为一个连续型暴露变量。所用数据为通过匿名访谈收集的参与者自报性行为信息，并排除了年龄小于12岁的个体。有关性行为史及首次性行为年龄的回答提取方法详见原始GWAS研究中的描述¹²。

人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的全基因组关联研究（GWAS）汇总统计数据来自FinnGen联盟R5版本，该数据包含357例HIV病例和218,435名对照个体¹³。AFS被指定为暴露变量，HIV感染被定义为结局变量。为尽量减少人群分层偏倚，仅纳入了欧洲血统个体的相关数据集。GWAS数据提取、SNP筛选、数据协调、孟德尔随机化分析、敏感性检验及结果解释的整体分析流程见图1。

2. 研究设计

基于减数分裂过程中染色体随机分配的双样本孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）框架被应用于本研究¹⁴。与初潮年龄（AFS）相关的遗传变异被用作工具变量，以估计AFS与HIV感染风险之间的关联。MR分析基于三个核心假设进行：所选单核苷酸多态性（SNPs）与AFS显著相关，符合相关性假设；这些SNPs与HIV感染风险的潜在混杂因素无关，符合独立性假设；并且这些SNPs仅通过AFS影响HIV感染，不存在其他因果通路，符合排他性限制假设（图2）¹⁴。

采用全基因组显著性阈值和F统计量评估工具变量的强度。通过严格的连锁不平衡剪枝阈值筛选与AFS相关的全基因组显著性SNP，并排除F统计量<10的SNP，以减少弱工具变量偏倚并增强相关性假设。通过敏感性分析评估潜在的多效性及混杂效应。进一步通过数据协调程序、混杂因素筛选、MR-Egger截距检验、Cochran’s Q异质性分析、MR-PRESSO异常值评估以及留一法敏感性分析，对独立性假设和排除限制假设进行评估，以降低水平多效性和残余混杂的可能性。此外还进行了额外的敏感性分析，以识别多效性效应并验证孟德尔随机化（MR）假设¹⁵。通过MR分析评估遗传预测的较早AFS是否与HIV感染风险相关。

3. 工具变量的选择

在选择SNP之前实施了严格的质控程序。使用TwoSampleMR软件包中的extract_instruments()函数，提取在全基因组显著性阈值（P < 5 × 10⁻⁸）下与AFS显著相关的SNP，连锁不平衡阈值设为r² < 0.001，聚类距离设为> 10,000 kb¹⁶。对所有选定的SNP计算F统计量，并排除F值< 10的弱工具变量¹⁷。

F 统计量的计算方法如下：

                                                       

                   其中：                    

在这些方程中，N 表示所选数据集的样本量，k 表示用于孟德尔随机化（MR）分析的单核苷酸多态性（SNP）数量，β 表示 SNP 对 AFS 的效应估计值，SD 表示 β 的标准差，MAF 表示次要等位基因频率。满足所有预设标准的 SNP 被保留作为 MR 分析的最终工具变量。

4. 去除混杂性及回文性SNP

在进行数据整合之前，对所有选定的单核苷酸多态性（SNPs）均进行了审阅，以评估其是否可能与混杂性状相关。与HIV相关表型或潜在混杂性状相关且r² > 0.80的SNPs被排除^23,24。使用harmonise_data()函数对暴露和结局数据集进行整合，并剔除具有中间等位基因频率的回文SNPs，以避免链取向歧义²³。

回文SNP被定义为包含A/T或G/C等位基因且等位基因频率介于0.01至0.30之间的变异²⁴。

5. 因果效应估计

采用 mr() 函数进行孟德尔随机化（MR）分析，通过逆方差加权法（IVW）、MR-Egger 回归、加权中位数法、加权众数法和简单众数法来估计 AFS 与 HIV 感染之间的关系²⁵。通过评估多种 MR 方法结果的一致性，以判断因果效应估计的稳健性及潜在的多效性偏倚。本研究将 IVW 作为主要分析方法，因其通过荟萃分析整合了各个 SNP 特异性的 Wald 比值²⁴。

因果效应估计值以比值比（OR）、贝塔系数（β）和95%置信区间（CI）表示。随后进行了异质性和敏感性分析。使用 mr_heterogeneity() 函数计算 Cochran’s Q 统计量，并使用 mr_leaveoneout() 函数进行留一法分析，以确定单个 SNP 对因果估计值的影响^26,27。

使用 mr_pleiotropy_test() 函数进行 MR-Egger 截距检验，并采用 MR-PRESSO 全局检验评估水平多效性并识别异常值 SNP。在通过 MR-PRESSO 程序去除异常值后，生成校正后的估计结果²⁸。

6. 统计学分析

所有统计分析均使用 R 软件（版本 4.1.0；R Foundation for Statistical Computing，奥地利维也纳）进行，采用 TwoSampleMR、LDlinkR、devtools 和 MR-PRESSO 软件包完成 SNP 提取、连锁不平衡剪枝、数据一致性处理、孟德尔随机化分析及敏感性检验。FinnGen（RRID 不可用）、MR-PRESSO（RRID 不可用）和 LDlinkR（RRID 不可用）被用于支持分析流程。所有统计检验均为双侧检验，统计学显著性定义为 P < 0.05。

采用基于网络的 mRnd 计算器，根据样本量和工具变量效应估计值来估算统计功效²⁹。最终的分析结果包括比值比（OR）估计值、95% 置信区间、异质性统计量、多效性评估以及敏感性分析，这些结果被综合解读以评估基因预测的 AFS 与 HIV 感染风险之间关联的稳健性和一致性。所有分析均使用 R 软件中的 TwoSampleMR、LDlinkR、devtools 和 MR-PRESSO 软件包中的已有函数完成。本研究未开发任何自定义分析脚本。

结果

孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）分析提示，基于遗传预测的首次性行为年龄（AFS）与 HIV 感染风险之间可能存在关联。通过 MR-PRESSO 方法进行敏感性分析和异常值评估后，观察到的关联方向保持一致。逆方差加权（inverse variance weighting, IVW）分析显示，遗传预测的较晚 AFS 与较低的 HIV 感染风险相关（OR = 0.192，95% CI = 0.062–0.592，P = 0.004）。该估计表明，遗传预测的 AFS 增加与 HIV 感染可能性显著降低相关，而较早的首次性行为则对应更高的 HIV 易感性。

所有工具变量的 F 统计量均>10，估计统计功效>80%，符合孟德尔随机化分析中工具变量强相关性的假设，降低了弱工具变量偏倚的可能性。在逆方差加权法（IVW）、MR-Egger 回归、加权中位数、加权众数及简单众数分析中均观察到方向一致的关联性，表明多种孟德尔随机化方法之间具有分析结果的一致性。

散点图可视化显示，五种MR方法的回归斜率相似，表明SNP特异性的因果估计值相对稳定，且各分析方法之间不存在主要的方向性不一致（图3）。

敏感性分析采用 Cochran’s Q 检验未发现具有统计学意义的异质性，提示不同 SNP 之间的因果效应估计值变异较小，支持所选工具变量在 MR 分析中的一致性。分析共纳入 10 个工具变量 SNP。MR-Egger 截距检验和 MR-PRESSO 全局检验均未发现具有统计学意义的方向性多效性或主要离群 SNP，降低了观察到的关联主要由水平多效性效应驱动的可能性。MR-Egger 截距值接近于零（P > 0.05），支持排除限制假设，表明所选 SNP 不太可能通过与 AFS 无关的其他生物学通路影响 HIV 感染风险。逐一剔除 SNP 的敏感性分析进一步表明，没有任何单个 SNP 对整体逆方差加权（IVW）估计值产生显著影响。综上，这些敏感性分析支持观察到的 MR 估计结果的稳定性，并增强了对主要孟德尔随机化假设有效性的信心（表 1）。

单次排除一个SNP的敏感性分析进一步表明，依次排除各个SNP并未显著改变整体的IVW估计值，说明没有单个工具变量对AFS与HIV感染风险之间的关联产生不成比例的影响（图4）。

探索性反向孟德尔随机化分析最初仅识别出少量候选的与HIV相关的SNP（少于10个）；然而，在经过连锁不平衡剔除、数据协调和工具变量强度筛选步骤后，未保留任何全基因组显著性的SNP。因此，无法进行统计学上可靠的反向MR分析，最终分析解释中仅保留了评估基因预测的AFS与HIV感染风险之间关联的正向MR分析。

本研究分析的数据集来自公开可获取的全基因组关联研究（GWAS）汇总数据库。首次性行为年龄的GWAS汇总统计结果来源于Mills等人（2021）¹²报道的基于英国生物银行（UK Biobank）的GWAS荟萃分析，共纳入214,547名欧洲血统个体。HIV感染的GWAS汇总统计结果来自FinnGen联盟R5版本¹³，包括357例HIV病例和218,435名对照。FinnGen的汇总统计数据及终点资源可通过FinnGen研究门户公开获取（https://www.finngen.fi/en/access_results）。本研究获取了公开可用的汇总水平GWAS数据集，用于暴露和结局分析，并从中提取经过筛选的工具变量子集，用于孟德尔随机化分析。本研究未产生任何新生成的原始数据集或个体水平的参与者数据。

图1：孟德尔随机化分析流程的工作流程图。 该工作流程展示了全基因组关联研究（GWAS）数据获取、SNP提取、连锁不平衡剔除、弱工具变量排除、暴露与结局数据集的协调、孟德尔随机化分析、敏感性分析以及因果效应估计的解释。请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：孟德尔随机化分析的核心假设。 实线箭头表示通过暴露变量介导的、由基因预测的首次性行为年龄与HIV感染风险之间的假设因果通路。虚线箭头表示工具变量与潜在混杂因素相互独立，且仅通过暴露变量影响结局的假设。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：评估初次性行为年龄（AFS）与HIV感染风险之间关联的孟德尔随机化分析散点图。 该图展示了在逆方差加权（IVW）、MR-Egger回归、加权中位数、加权众数和简单众数分析中，暴露与结局估计值之间的SNP特异性关联。不同分析方法间相似的回归斜率支持了所观察到的关联具有方向一致性和相对稳定性。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：评估首次性行为年龄（AFS）与 HIV 感染风险之间关联的留一法敏感性分析。 依次排除单个 SNP 后，IVW 估计值在各次迭代中相对稳定，表明没有单个工具变量对整体孟德尔随机化估计产生不成比例的影响。请点击此处查看该图的放大版本。

暴露因素	结局	SNP 数量	MR-Egger 截距	P 值（多效性）	Cochran’s Q	P 值（异质性）	MR-PRESSO 全局检验	P 值（MR-PRESSO）	留一法汇总
首次性行为年龄	HIV 感染	10	0.028	0.628	67.511	0.235	未检测到显著异常值	> 0.05	无单个 SNP 对整体 IVW 估计值产生显著影响

表1：评估首次性行为年龄（AFS）与HIV感染风险的孟德尔随机化估计结果稳健性的敏感性分析汇总。 该表格总结了所分析的工具变量SNP数量、Cochran’s Q异质性检验统计量、MR-Egger截距检验、MR-PRESSO全局检验结果以及逐一剔除分析，用于评估多效性、异质性、离群值影响以及基因预测的首次性行为年龄与HIV感染风险之间关联的孟德尔随机化估计结果的稳定性。

讨论

本研究利用公开可用的全基因组关联研究（GWAS） 汇总统计数据分析，采用两样本孟德尔随机化（MR）框架，评估遗传预测的首次性行为年龄（AFS）与HIV感染风险之间的潜在关联。研究结果表明，遗传预测的较早AFS与更高的HIV易感性相关，提示AFS与HIV感染风险之间可能存在反向关系。在逆方差加权法（IVW）、加权中位数法（WM）和MR-Egger回归分析中均得到一致结果，支持所观察到的关联具有稳健性，并且总体上与既往流行病学观察结果一致。既往研究报道，较早开始性行为的男男性行为者（MSM）可能更倾向于从事增加HIV暴露风险的行为，包括多个性伴侣、无保护性行为以及物质使用^2,3,4。较早的性行为起始年龄还与其他更广泛的与性风险行为相关的模式相关³⁰。这些观察提示，较早的AFS可能主要作为与HIV暴露风险增加相关的行为或社会代理指标，而非HIV感染易感性的直接生物学决定因素。行为特征，包括冒险倾向、物质使用、性网络模式以及社会经济因素，可能共同促成所观察到的关联。尽管既往观察性研究提示AFS与HIV感染之间存在关联，但残余混杂、反向因果关系和选择偏倚可能影响对这些发现的解释。

既往流行病学研究 consistently 报道了初次性行为年龄较早与高风险性行为之间的关联，包括拥有多名性伴侣、安全套使用不规律以及与物质使用相关的性活动。这些行为模式可能间接增加 HIV 暴露风险，并支持初次性行为年龄较早与 HIV 易感性之间所观察到的关联具有流行病学上的合理性。

近期的孟德尔随机化（MR）研究还探讨了与 HIV 易感性相关的生物学决定因素，包括肠道微生物群组成³¹。已有研究报道，利用双样本 MR 框架发现多种肠道微生物分类群与 HIV 感染风险之间存在潜在的因果关联。与可能通过免疫调节、炎症通路以及宿主-微生物群相互作用影响 HIV 易感性的微生物组相关暴露不同，本研究中所考察的暴露主要反映了一种与 HIV 暴露风险相关的行为和社会决定因素。这些发现提示，HIV 易感性可能涉及生物学和行为学双重因果通路。肠道微生物群相关机制可能通过影响宿主免疫脆弱性发挥作用，而较早的首次性行为（AFS）则可能通过增加高风险性行为及相关社会因素的暴露，间接提高 HIV 易感性。观察到的关联背后可能的机制包括：暴露于高风险性环境的几率增加、获得性健康教育的机会减少、与物质使用相关的性行为起始年龄提前，以及与 HIV 暴露风险相关的更广泛的社会或行为脆弱性模式。本研究的分析并未确立 AFS 与 HIV 感染之间的直接生物学机制，而是支持其通过行为和社会暴露通路介导的潜在关联。

因此，本研究通过提供来自行为流行病学视角的证据，补充了以往以微生物组为重点的孟德尔随机化分析。本研究通过采用孟德尔随机化框架评估与艾滋病风险相关的行为暴露，拓展了日益增长的遗传流行病学文献体系。

非显著的Cochran’s Q统计量提示各SNP特异性因果估计值之间异质性有限，表明所选工具变量在不同分析方法中具有一致性。此外，MR-Egger截距分析和MR-PRESSO检验均未发现明显的定向多效性或具有显著影响的异常SNP，降低了观察到的关联主要由与暴露无关的其他生物学通路驱动的可能性。这些敏感性分析共同增强了对主要MR假设有效性以及观察到的因果估计结果稳健性的信心。

使用仅限欧洲人群的全基因组关联研究（GWAS）汇总数据集降低了人群分层偏倚的可能性。与传统的观察性流行病学方法相比，孟德尔随机化（MR）通过减少残余混杂和反向因果偏倚的影响，为评估潜在的因果关系提供了补充性分析框架。由于涉及行为性暴露的随机对照试验通常不可行或不符合伦理要求，使得MR分析在研究与传染病结局相关的行为决定因素方面尤为有用。

然而，MR 方法本身存在的一些方法学局限性也应予以考虑。MR 分析依赖于工具变量假设的有效性，仍可能受到残余的水平多效性、弱工具变量偏倚或不同 GWAS 数据集间异质性的影响。此外，使用汇总水平的 GWAS 数据限制了根据人口学、行为特征或性别特异性特征进行亚组分析的能力。尽管本研究采用了单变量双样本 MR 框架，但仍需考虑与行为和社会经济特征相关的潜在残余混杂因素。纳入教育程度、冒险行为、物质使用和社会经济地位等变量的多变量 MR 方法，可能有助于进一步阐明 AFS 是否独立地影响 HIV 易感性，或主要反映的是更广泛的行为风险特征。未来使用统计效能充足的 GWAS 数据集开展的研究，可能有助于阐明这些复杂的因果通路。

此外，本研究的分析依赖于 FinnGen R5 版本中的单个 HIV 全基因组关联研究（GWAS）数据集，其中包含的 HIV 病例数量相对有限（n = 357）。因此，所观察到的关联关系在精确性、稳健性和普适性方面可能存在一定局限。尽管所选的工具变量显示出超过 80% 的估计统计效能，但 HIV 病例数相对较少仍可能导致置信区间较宽，以及因果效应估计的稳定性降低。未来有必要利用更大规模的独立 HIV GWAS 数据集、多祖先背景人群以及外部验证队列开展进一步的重复性研究，以评估本研究结果的稳定性和可重复性。在独立队列中进行重复验证是遗传流行病学研究的重要组成部分，有助于增强对孟德尔随机化（MR）分析所得因果推断估计的信心。

本研究展示了利用公开的全基因组关联研究（GWAS）汇总统计数据，采用孟德尔随机化（MR）方法探究可能与HIV感染易感性相关的行为因素的适用性。该分析框架可为未来研究行为和社会决定因素与HIV易感性及其他传染病结局之间的关联提供支持。因此，当前的研究结果应置于行为流行病学的背景下进行解读，而非作为AFS与HIV感染之间存在直接生物学因果关系的证据。从公共卫生的角度来看，这些发现强调了全面性健康教育、行为风险认知项目以及针对青少年和年轻成年人的预防干预措施的重要性，这些人群可能因较早开始性行为及相关行为因素而面临更高的HIV暴露风险。

未来的研究可通过纳入更大的全基因组关联研究（GWAS）数据集、多祖先人群、双向孟德尔随机化（MR）分析、多变量MR框架，以及整合其他生物学暴露因素（如与微生物组相关的因素），进一步评估行为与传染病之间复杂的关联关系。

本研究未能完成评估 HIV 感染与 AFS 之间关系的完全双向 MR 分析。尽管根据先前发表的双向 MR 方法尝试了探索性反向 MR 分析³²，最初识别出约 10 个与 HIV 相关的候选 SNP；然而，在经过连锁不平衡剔除、数据协调以及工具变量强度筛选步骤后，未保留任何全基因组显著性的 SNP。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
devtools 软件包	R 统计计算基金会，奥地利维也纳	R 软件包	用于软件包安装、数据处理及孟德尔随机化工作流程的准备。
FinnGen 全基因组关联研究数据集	FinnGen 联盟	不适用	作为结局的全基因组关联研究资源，用于获取 HIV 感染的汇总统计信息。
全基因组关联研究汇总数据	英国生物样本库联盟、FinnGen 联盟	公开的全基因组关联研究数据集	可公开获取的全基因组关联研究汇总统计数据，用于 SNP 提取和孟德尔随机化分析。
LDlinkR 软件包	美国国家癌症研究所（NCI）、美国国立卫生研究院（NIH）	R 软件包	用于连锁不平衡评估和 SNP 验证。
mRnd 计算器	基于网页的工具	https://shiny.cnsgenomics.com/mRnd/	用于孟德尔随机化分析中的统计功效计算。
MR-PRESSO 软件包	GitHub 代码仓库	不适用	用于孟德尔随机化分析中的多效性评估和异常值校正。
R 软件	R 统计计算基金会，奥地利维也纳	版本 4.1.0；RRID:SCR_001905	用于统计分析及执行孟德尔随机化工作流程。
SNP 数据	英国生物样本库联盟、FinnGen 联盟	公开的 SNP 数据集	作为孟德尔随机化分析工具变量使用的 SNP。
TwoSampleMR 软件包	MR-Base 平台	RRID:SCR_018317	用于双样本孟德尔随机化分析、数据协调及敏感性检验。
英国生物样本库全基因组关联研究数据集	英国生物样本库联盟	不适用	作为暴露因素的全基因组关联研究资源，用于获取首次性行为年龄（AFS）的汇总统计信息。