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方法文章

Ki-67联合中性粒细胞与淋巴细胞比值及CD4阳性/CD8阳性比值预测非小细胞肺癌早期疗效

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DOI：

10.3791/70014

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2026年3月20日

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, Binhaiwan Central Hospital of Dongguan, 2Department of internal medicine, Binhaiwan Central Hospital of Dongguan

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案通过整合基线中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）、流式细胞术检测的CD4/CD8比值、肿瘤Ki-67免疫组化评分，以及两周期治疗后的RECIST 1.1评估，并在整个过程中设置以可重复性为重点的质量控制检查点，对接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗的非小细胞肺癌（NSCLC）患者早期疗效评估进行了标准化。

摘要

本研究评估了肿瘤Ki-67表达状态、外周血中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）以及CD4阳性/CD8阳性T细胞比值在预测接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗的非小细胞肺癌患者短期疗效中的联合预测价值。我们回顾性分析了2021年1月至2023年10月期间在中国滨海湾中心医院接受治疗并完成两个治疗周期的102例连续患者。采用实体瘤疗效评价标准（RECIST）1.1版评估疗效：13例患者达到完全缓解，26例为部分缓解，54例为疾病稳定，9例为疾病进展。在分析中，我们将“缓解”定义为完全缓解与部分缓解之和，“无缓解”定义为疾病稳定与疾病进展之和。单变量筛选识别出与疗效状态相关的候选预测因子，并将其纳入多变量逻辑回归模型，校正年龄、美国东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group）体能状态评分及吸烟史后，发现Ki-67状态、NLR和CD4阳性/CD8阳性T细胞比值均为短期疗效分类的独立预测因子。受试者工作特征曲线分析显示，与单一生物标志物相比，联合生物标志物模型具有更优的判别能力，提示该方法在当前临床背景下可用于早期疗效分层，具有实用性和微创优势。

引言

非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌病例的近85%，是中国最常见的组织学亚型，主要影响中老年人群1。其病因具有多因素性，包括烟草暴露、长期接触工业粉尘或污染物、遗传易感性以及长期暴露于环境致癌物2˒3。早期NSCLC常表现为非特异性的呼吸道症状，在基层医疗中容易被误认为常见气道疾病，导致识别延迟，大量患者在晚期才得以确诊4˒5。

近年来，免疫检查点阻断已成为晚期非小细胞肺癌（NSCLC）系统性治疗的核心组成部分。程序性死亡受体1（PD-1）和程序性死亡配体1（PD-L1）抑制剂在部分患者中已显示出持久的临床获益并改善了生存率6。然而，治疗反应的异质性仍然显著，长期治疗带来的经济负担和潜在毒性也不容忽视7˒8。临床上常用的一些预测指标，如肿瘤PD-L1免疫组织化学检测和肿瘤突变负荷（TMB），虽能提供有价值的信息，但二者均存在实际应用中的局限性，限制了其广泛统一使用。PD-L1检测结果可能受到瘤内异质性以及检测方法或平台差异的影响，而TMB通常需要测序资源、更长的周转时间以及更高的成本9。这些限制使得开发一种能够利用常规可获取样本、并在实验室条件不同的医疗中心均可通过标准化质量控制实施的工作流程，在临床上具有重要意义。

从实际角度来看，采用一种以方案为导向的方法，整合少数易于获取的生物标志物，可能有助于在治疗开始后进行早期随访规划。例如，在首次输注前进行标准化的基线采样，并设定一个明确的两个周期评估窗口，可帮助临床医生识别出需要更密切监测或更早重新评估的患者，同时确保在不同机构间重复测量所需步骤的透明性。这种对可行性与可重复性的重视，对于 JoVE 协议类文章尤为重要，因为此类文章的核心在于方法学步骤及其质量控制点。

Ki-67 是一种核增殖标志物，可反映肿瘤的生长动态，并已与免疫微环境特征相关联。已有研究报道，Ki-67 水平升高与 PD-L1 表达相关，可能与影响免疫检查点抑制剂（ICIs）敏感性的免疫逃逸表型有关10。与此同时，中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）是一种易于获取的全身性炎症状态指标，已在接受 PD-1/PD-L1 抑制剂治疗的患者中被广泛研究作为预后或预测因子11。较高的 NLR 通常被解释为反映了相对性中性粒细胞增多和/或淋巴细胞减少所构成的免疫抑制微环境，并在多个队列研究中与较差的治疗反应和较短的生存期相关12。外周血 CD4 阳性/CD8 阳性 T 细胞比值为进一步了解适应性免疫稳态提供了另一视角，且辅助性 T 细胞与细胞毒性 T 细胞亚群之间的功能平衡在 PD-1/PD-L1 阻断条件下对有效抗肿瘤免疫具有机制上的重要意义13。

尽管Ki-67、中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）以及CD4阳性/CD8阳性比值各自作为单一标志物已显示出潜在价值，但将其整合为一种可操作的、微创的非小细胞肺癌早期疗效评估流程，目前仍缺乏充分的特征描述。因此，本研究旨在探讨在PD-1/PD-L1抑制剂治疗两个周期后，将肿瘤Ki-67表达状态与外周血NLR及CD4阳性/CD8阳性比值联合应用，是否能够改善短期疗效的分类效果，从而为早期风险分层提供依据，并支持在常规临床实践中及时进行再评估。

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方案

1. 伦理与法规合规

  1. 获得东莞滨海湾中心医院伦理委员会的批准（批准文号：2021045）。
  2. 确保所有操作均符合《赫尔辛基宣言》的要求。
  3. 确认在治疗前已获得书面知情同意，并在研究文件中记录同意情况。

2. 患者识别与入组资格筛查

  1. 确定在研究机构于2021年1月至2023年10月期间开始接受程序性死亡蛋白1/程序性死亡配体1抑制剂治疗的连续非小细胞肺癌患者。
  2. 通过审查病理报告确认病理学诊断。
  3. 确认已完成两个治疗周期，并将一个周期定义为3周。
  4. 应用纳入标准。
    1. 确认治疗开始时年龄为35–80岁。
    2. 确认基线影像学检查中无肝转移。
    3. 确认无其他原发性恶性肿瘤。
    4. 确认病历中记录的预期生存时间>12个月。
    5. 确认基线完整病历资料和基线影像学数据可获取。
  5. 应用排除标准。
    1. 排除治疗开始前6个月内接受过心胸外科手术的患者。
    2. 排除病历记录显示依从性差而影响随访的患者。
    3. 排除患有严重精神障碍而影响方案依从性的患者。
    4. 排除基线评估时存在血液系统或凝血功能异常的患者。
    5. 排除基线时存在严重活动性感染的患者。
    6. 排除入组前30天内接受过免疫治疗或靶向治疗的患者。
    7. 排除因转院、经济困难或死亡而在两个治疗周期评估期间中断治疗的患者。
  6. 为每位符合条件的患者分配唯一的研究编号，并在分析前对所有记录进行去标识化处理。
  7. 由两名研究者独立核实入组资格，并通过共识解决分歧。
  8. 在筛选日志中记录裁决结果，内容包括研究编号、筛查项目、差异描述、裁决人员及日期。
    注：在筛选日志中记录可能影响炎症标志物的基线状况（如发热、临床怀疑感染或系统性糖皮质激素暴露），以支持排除决策和结果解读14。

3. 基线临床数据提取

  1. 从电子病历系统中提取基线变量。
  2. 记录性别、年龄、体重指数、教育水平、肿瘤位置、最大肿瘤直径、肿瘤-淋巴结-转移分期、治疗方式、吸烟史以及东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group）体力状态评分。
  3. 将所有基线变量导出至一个去标识化的电子表格中。
  4. 通过保存带时间戳的只读副本，锁定用于分析的数据集。
  5. 通过至少核对10%的条目与原始记录进行交叉验证，以确认数据准确性。
  6. 在更正日志中记录所有更正信息，包括字段名称、原始值、更正后值、审核人姓名缩写及日期。
  7. 根据治疗反应状态汇总基线特征，并编制基线特征表用于报告，即 表1。

4. 基线外周血采集及血液学衍生的中性粒细胞与淋巴细胞比值

  1. 在首次给药抑制剂前2小时内，使用含EDTA抗凝剂的试管（见材料表）采集上肢静脉的空腹静脉血。
  2. 采集后立即轻轻倒置每支试管8–10次。
  3. 采集后2小时内，使用全自动血液分析仪（型号见材料表）进行全血细胞计数检测。
  4. 在样本检测前，确认分析仪当日的内部质控状态，并在研究记录中登记质控通过/未通过状态、质控水平、操作人员及分析仪型号。
  5. 从分析仪输出结果中记录中性粒细胞绝对值和淋巴细胞绝对值。
  6. 使用公式NLR = 中性粒细胞绝对值 / 淋巴细胞绝对值，计算中性粒细胞与淋巴细胞比值。
  7. 在研究记录中标记凝血或溶血样本为无效样本。
  8. 在临床可行的情况下，在相同的治疗前时间窗内重复采血，并记录任何缺失或无效结果的原因。
  9. 记录血液采集时间和全血细胞计数检测时间，以证明分析前时间窗≤2小时。

5. CD4阳性/CD8阳性T细胞比例的流式细胞术检测

  1. 取50 µL EDTA抗凝全血，分装至12 × 75 mm流式管中（参见材料表）。
  2. 加入20 µL四色T细胞亚群检测试剂，该试剂使用四种荧光染料分别标记CD3、CD4、CD8和CD45（参见材料表）。
  3. 涡旋混匀1–2秒，在20–25 °C避光孵育15分钟。
  4. 加入450 µL由10×浓缩液配制的1×红细胞裂解液（参见材料表）。
  5. 轻轻颠倒混匀，在20–25 °C避光孵育10分钟。
  6. 加入2 mL磷酸盐缓冲液（参见材料表），颠倒混匀3–5次。
  7. 在室温下以350 × g离心5分钟。
  8. 弃去上清液，注意勿扰动沉淀。
  9. 将沉淀重悬于300–500 µL磷酸盐缓冲液中，用于上机检测。
  10. 根据仪器操作流程执行每日流式细胞仪性能检查，并在运行记录表中记录通过/失败状态。
  11. 使用未染色样本管设定光电倍增管电压。
  12. 为每种荧光染料运行单色对照（细胞或微球）。
  13. 利用单色对照在采集软件中计算补偿值。
  14. 同一批次所有样本保持相同的电压设置和补偿矩阵，并记录日期、操作人员、电压快照及补偿文件名称。
  15. 以低至中等流速采集每个样本，每样本至少收集10,000个淋巴细胞事件。
  16. 使用CD45与侧向散射光（SSC）进行淋巴细胞设门。
  17. 使用前向散射光面积（FSC-A）与前向散射光高度（FSC-H）设门排除双联体，选择单细胞。
  18. 设门CD3阳性T细胞。
  19. 在CD3阳性事件中定量CD4阳性和CD8阳性亚群。
  20. 使用公式计算CD4阳性/CD8阳性比值：CD4阳性/CD8阳性比值 = （CD3阳性中CD4阳性百分比）/（CD3阳性中CD8阳性百分比）。
  21. 通过双变量图验证CD4阳性和CD8阳性细胞群的分离情况。
  22. 若观察到与预期细胞群分离不符的重叠现象，应重新计算补偿并重做对照。
  23. 保存每批次代表性图谱（CD45/SSC、单细胞、CD3设门、CD4 vs CD8），并连同批次编号和日期归档。
    注：在内部运行记录表中记录试剂批号和运行日期，以支持批次追踪15。

6. 肿瘤Ki-67免疫组织化学染色及二分类状态判定

  1. 将福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织切片切成4 µm厚度，并将切片贴附于带电荷的载玻片上（参见材料表）。
  2. 用二甲苯脱蜡，并通过梯度乙醇逐步水化切片至水。
  3. 使用pH 6的柠檬酸修复缓冲液进行加热诱导的抗原修复（参见材料表）。
  4. 在开始计时前，将修复缓冲液预热至接近沸腾温度。
  5. 将载玻片在修复缓冲液中加热20分钟。
  6. 在室温下冷却载玻片20分钟。
  7. 用洗涤缓冲液冲洗载玻片，以去除残留的修复液。
  8. 在室温下用3%过氧化氢孵育切片10分钟。
  9. 用洗涤缓冲液清洗载玻片三次，每次1–2分钟。
  10. 在室温下用Ki-67一抗（克隆MIB-1；即用型制剂；参见材料表）孵育切片20分钟。
  11. 用洗涤缓冲液清洗载玻片三次，每次1–2分钟。
  12. 应用基于HRP的检测系统，并根据制造商说明使用DAB显色（参见材料表）。
  13. 当细胞核染色清晰可见且背景染色较低时，用水冲洗终止显色反应。
  14. 用苏木精对切片进行复染，冲洗，返蓝，通过梯度乙醇脱水，二甲苯透明，最后用永久性封片剂封片（参见材料表）。
  15. 在明场显微镜下以400×放大倍数观察切片。
  16. 选择五个无重叠的活性肿瘤区域，避免坏死、挤压伪影和边缘效应。
  17. 每视野至少计数100个肿瘤细胞核，并记录具有明确棕褐色核染色的细胞核数量。
  18. 每个病例在五个视野中共计数至少500个肿瘤细胞核。
  19. 使用公式计算病例水平的Ki-67标记指数：标记指数（%）=（阳性肿瘤细胞核总数 / 计数的肿瘤细胞核总数）× 100%。
  20. 根据所计数肿瘤细胞核中占主导的染色强度，将每个病例的染色强度评分定为0（无）、1（浅黄色）、2（棕黄色）或3（深棕色）。
  21. 根据病例水平的标记指数，将阳性细胞百分比评分定为0（0–5%）、1（6–25%）、2（26–50%）、3（51–75%）或4（>75%）。
  22. 使用IRS = 强度评分 × 百分比评分计算免疫反应评分（IRS）。
  23. 将Ki-67表达状态分为：IRS 0–4为Ki-67阴性，IRS 5–12为Ki-67阳性，并在表1–4及建模结果中始终使用该二分类状态。
  24. 由两名病理学家独立进行盲法评分。
  25. 对两名病理学家设盲，使其不知晓临床结局和血液生物标志物数值。
  26. 通过共同复核解决评分分歧，并记录最终共识分类及日期。
  27. 归档每个病例的代表性图像，注明研究编号和放大倍数。
  28. 每次染色运行中均应包括已知阳性对照组织和阴性对照（省略一抗）。
  29. 若对照失败或背景染色影响判读，则重复染色。
    注：归档包含五个视野计数、标记指数、强度评分、百分比评分、IRS及最终阴/阳性状态的评分工作表，以备审核16。

两个周期后的疗效评估

  1. 在常规临床工作流程中，于第1个周期前进行基线成像。
  2. 在完成两个治疗周期后重复成像，并将每个周期定义为3周。
  3. 采用实体瘤疗效评价标准（RECIST）1.1版评估治疗反应。14
  4. 由两名放射科医生进行独立的盲法评估。
  5. 对两名放射科医生设盲，使其不知晓生物标志物数值及模型协变量信息。
  6. 通过共识解决分歧，并记录仲裁细节（阅片者姓名缩写、日期、最终决定）。
  7. 根据RECIST 1.1标准，将疗效反应分类为完全缓解、部分缓解、疾病稳定或疾病进展。
  8. 将完全缓解与部分缓解归入反应组。
  9. 将疾病稳定与疾病进展归入无反应组。
  10. 存储基线及随访成像日期，并核实评估时间窗对应两个治疗周期。
  11. 归档带有研究编号、阅片者和日期的RECIST测量表单，以备审核。

8. 统计分析

  1. 使用统计软件进行统计分析（参见材料表）。
  2. 以均值 ± 标准差表示正态分布的连续变量，并采用独立样本 t 检验比较组间差异。
  3. 以频数和百分比表示分类变量，并根据情况采用卡方检验或 Fisher 精确检验进行组间比较。
  4. 根据预设的编码方案对自变量进行编码，并将编码表整理为表2。
  5. 通过单变量分析筛选预测因子，并选择符合预设标准的变量用于多变量建模。
  6. 构建多变量逻辑回归模型，以应答 = 0 和无应答 = 1 作为因变量。
  7. 在多变量模型中对年龄、东部肿瘤协作组体能状态（Eastern Cooperative Oncology Group performance status）及吸烟史进行校正。
  8. 将最终校正后的模型估计结果列为表3。
  9. 为单个预测因子及联合模型生成受试者工作特征曲线（ROC曲线）。
  10. 使用约登指数（Youden’s index）确定中性粒细胞-淋巴细胞比值（NLR）和CD4阳性/CD8阳性比值的ROC阈值，并在表4报告的二分类分析中一致应用所获得的阈值。
  11. 将单个预测因子和联合模型的区分能力与分类性能总结为表4。
  12. 进行敏感性分析，将中性粒细胞-淋巴细胞比值和CD4阳性/CD8阳性比值作为连续变量处理，采用相同的结局编码和校正变量集。
  13. 将敏感性分析结果列为补充表S1。
  14. 核对文稿正文中的数值与相应表格和图表之间的一致性，并归档最终输出文件及所使用的软件版本。

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结果

基线特征
102例非小细胞肺癌患者的基线临床特征总结于表1中。治疗有响应组（完全缓解+部分缓解）包括30名男性和9名女性，而无响应组（疾病稳定+疾病进展）包括50名男性和13名女性（p = 0.771）。在有响应组中，79.49%的患者年龄小于65岁，相比之下，无响应组中该比例为66.67%。两组间在体重指数、教育水平、肿瘤-淋巴结-转移分期、血小板计数或治疗前最大肿瘤直径方面均未观察到具有统计学意义的差异（所有p > 0.05）。相反，吸烟史、东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group）体能状态、Ki-67表达状态、外周血中性粒细胞与淋巴细胞比值以及CD4阳性/CD8阳性T细胞比值在两组间差异具有统计学意义（所有p < 0.05；表1）。

两个治疗周期后的短期治疗反应
在使用实体瘤疗效评价标准1.1版（Response Evaluation Criteria in Solid ...

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讨论

免疫检查点抑制剂已成为晚期非小细胞肺癌（NSCLC）系统性治疗的重要组成部分，但具有临床意义的治疗获益仍主要集中于部分患者15˒16。这种应答异质性，加之长期治疗的成本和潜在毒性，使得在治疗早期进行应答分层对于后续随访规划和及时重新评估具有重要的临床意义17。在本 JoVE 实验方案中，我们描述了一种实用的工作流程，该流程结合基于组织的增殖指标（Ki-67 免疫组织化学）与两项反映免疫-炎症状态的外周血指标（中性粒细胞与淋巴细胞比值及 CD4 阳性/CD8 阳性 T 细胞比值），以支持在完成两个治疗周期后进行短期应答分类。

在对年龄、东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group）体能状态和吸烟史进行校正的各项分析中，Ki-67 表达状态、中性粒细胞与淋巴细胞比值以及 CD4 阳性/CD8 阳性 T 细胞比值均与疗效分类呈现一致的相关性。这些关联的方向与既往证据一致，即增殖活性、全身性炎症以及外周 T ...

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披露

作者声明不存在可能影响本文报道工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

感谢东莞市滨海湾中心医院病理科和中心实验室在免疫组织化学和流式细胞术方面提供的技术支持。本研究由广东省医学科学技术研究基金项目（项目编号：B2022247）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
全自动血液分析仪Sysmex CorporationXN-1000全血细胞计数及中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）计算
明场显微镜OlympusBX53组织学评估
柠檬酸抗原修复缓冲液（pH 6.0）Abcamab93678热诱导抗原修复
DAB底物试剂盒Vector LaboratoriesSK-4100显色反应显影
EDTA抗凝采血管BD Biosciences367525外周血采集
流式细胞仪BD BiosciencesFACSCanto IIT细胞亚群分析
流式细胞术试管（12 figure-materials-1 75 mm）BD Falcon352058样本采集管
福尔马林固定石蜡包埋肿瘤组织块临床病理档案库N/A非小细胞肺癌肿瘤样本
四色T细胞亚群检测试剂（CD3/CD4/CD8/CD45）BD Biosciences340499用于淋巴细胞亚群检测
苏木精染液Sigma-AldrichH3136细胞核复染
HRP检测试剂盒Dako (Agilent)K5007二抗检测系统
Ki-67一抗（克隆号MIB-1）Abcamab16667免疫组织化学检测
切片机Leica MicrosystemsRM2235切割4 figure-materials-2 m FFPE切片
磷酸盐缓冲液（PBS）Thermo Fisher Scientific10010023细胞洗涤与重悬
正电荷载玻片Thermo Fisher ScientificJ1800AMNZ组织切片贴附
红细胞裂解液BD Biosciences349202流式细胞术前红细胞裂解
统计分析软件IBMSPSS v26.0数据分析

参考文献

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