本方案通过整合基线中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）、流式细胞术检测的CD4/CD8比值、肿瘤Ki-67免疫组化评分，以及两周期治疗后的RECIST 1.1评估，并在整个过程中设置以可重复性为重点的质量控制检查点，对接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗的非小细胞肺癌（NSCLC）患者早期疗效评估进行了标准化。
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方法文章
Ki-67联合中性粒细胞与淋巴细胞比值及CD4阳性/CD8阳性比值预测非小细胞肺癌早期疗效
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
本研究评估了肿瘤Ki-67表达状态、外周血中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）以及CD4阳性/CD8阳性T细胞比值在预测接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗的非小细胞肺癌患者短期疗效中的联合预测价值。我们回顾性分析了2021年1月至2023年10月期间在中国滨海湾中心医院接受治疗并完成两个治疗周期的102例连续患者。采用实体瘤疗效评价标准（RECIST）1.1版评估疗效：13例患者达到完全缓解，26例为部分缓解，54例为疾病稳定，9例为疾病进展。在分析中，我们将“缓解”定义为完全缓解与部分缓解之和，“无缓解”定义为疾病稳定与疾病进展之和。单变量筛选识别出与疗效状态相关的候选预测因子，并将其纳入多变量逻辑回归模型，校正年龄、美国东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group）体能状态评分及吸烟史后，发现Ki-67状态、NLR和CD4阳性/CD8阳性T细胞比值均为短期疗效分类的独立预测因子。受试者工作特征曲线分析显示，与单一生物标志物相比，联合生物标志物模型具有更优的判别能力，提示该方法在当前临床背景下可用于早期疗效分层，具有实用性和微创优势。
引言
非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌病例的近85%，是中国最常见的组织学亚型，主要影响中老年人群1。其病因具有多因素性，包括烟草暴露、长期接触工业粉尘或污染物、遗传易感性以及长期暴露于环境致癌物2˒3。早期NSCLC常表现为非特异性的呼吸道症状，在基层医疗中容易被误认为常见气道疾病，导致识别延迟，大量患者在晚期才得以确诊4˒5。
近年来，免疫检查点阻断已成为晚期非小细胞肺癌（NSCLC）系统性治疗的核心组成部分。程序性死亡受体1（PD-1）和程序性死亡配体1（PD-L1）抑制剂在部分患者中已显示出持久的临床获益并改善了生存率6。然而，治疗反应的异质性仍然显著，长期治疗带来的经济负担和潜在毒性也不容忽视7˒8。临床上常用的一些预测指标，如肿瘤PD-L1免疫组织化学检测和肿瘤突变负荷（TMB），虽能提供有价值的信息，但二者均存在实际应用中的局限性，限制了其广泛统一使用。PD-L1检测结果可能受到瘤内异质性以及检测方法或平台差异的影响，而TMB通常需要测序资源、更长的周转时间以及更高的成本
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方案
1. 伦理与法规合规
- 获得东莞滨海湾中心医院伦理委员会的批准（批准文号：2021045）。
- 确保所有操作均符合《赫尔辛基宣言》的要求。
- 确认在治疗前已获得书面知情同意，并在研究文件中记录同意情况。
2. 患者识别与入组资格筛查
- 确定在研究机构于2021年1月至2023年10月期间开始接受程序性死亡蛋白1/程序性死亡配体1抑制剂治疗的连续非小细胞肺癌患者。
- 通过审查病理报告确认病理学诊断。
- 确认已完成两个治疗周期，并将一个周期定义为3周。
- 应用纳入标准。
- 确认治疗开始时年龄为35–80岁。
- 确认基线影像学检查中无肝转移。
- 确认无其他原发性恶性肿瘤。
- 确认病历中记录的预期生存时间>12个月。
- 确认基线完整病历资料和基线影像学数据可获取。
- 应用排除标准。
- 排除治疗开始前6个月内接受过心胸外科手术的患者。
- 排除病历记录显示依从性差而影响随访的患者。
- 排除患有严重精神障碍而影响方案依从性的患者。
- 排除基线评....
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结果
基线特征
102例非小细胞肺癌患者的基线临床特征总结于表1中。治疗有响应组（完全缓解+部分缓解）包括30名男性和9名女性，而无响应组（疾病稳定+疾病进展）包括50名男性和13名女性（p = 0.771）。在有响应组中，79.49%的患者年龄小于65岁，相比之下，无响应组中该比例为66.67%。两组间在体重指数、教育水平、肿瘤-淋巴结-转移分期、血小板计数或治疗前最大肿瘤直径方面均未观察到具有统计学意义的差异（所有p > 0.05）。相反，吸烟史、东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group）体能状态、Ki-67表达状态、外周血中性粒细胞与淋巴细胞比值以及CD4阳性/CD8阳性T细胞比值在两组间差异具有统计学意义（所有p < 0.05；表1）。
两个治疗周期后的短期治疗反应
在使用实体瘤疗效评价标准1.1版（Response Evaluation Criteria in Solid .......
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讨论
免疫检查点抑制剂已成为晚期非小细胞肺癌（NSCLC）系统性治疗的重要组成部分，但具有临床意义的治疗获益仍主要集中于部分患者15˒16。这种应答异质性，加之长期治疗的成本和潜在毒性，使得在治疗早期进行应答分层对于后续随访规划和及时重新评估具有重要的临床意义17。在本 JoVE 实验方案中，我们描述了一种实用的工作流程，该流程结合基于组织的增殖指标（Ki-67 免疫组织化学）与两项反映免疫-炎症状态的外周血指标（中性粒细胞与淋巴细胞比值及 CD4 阳性/CD8 阳性 T 细胞比值），以支持在完成两个治疗周期后进行短期应答分类。
在对年龄、东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group）体能状态和吸烟史进行校正的各项分析中，Ki-67 表达状态、中性粒细胞与淋巴细胞比值以及 CD4 阳性/CD8 阳性 T 细胞比值均与疗效分类呈现一致的相关性。这些关联的方向与既往证据一致，即增殖活性、全身性炎症以及外周 T .......
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披露
作者声明不存在可能影响本文报道工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
感谢东莞市滨海湾中心医院病理科和中心实验室在免疫组织化学和流式细胞术方面提供的技术支持。本研究由广东省医学科学技术研究基金项目（项目编号：B2022247）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 全自动血液分析仪 | Sysmex Corporation | XN-1000 | 全血细胞计数及中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）计算 |
| 明场显微镜 | Olympus | BX53 | 组织学评估 |
| 柠檬酸抗原修复缓冲液（pH 6.0） | Abcam | ab93678 | 热诱导抗原修复 |
| DAB底物试剂盒 | Vector Laboratories | SK-4100 | 显色反应显影 |
| EDTA抗凝采血管 | BD Biosciences | 367525 | 外周血采集 |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | FACSCanto II | T细胞亚群分析 |
流式细胞术试管（12  75 mm） | BD Falcon | 352058 | 样本采集管 |
| 福尔马林固定石蜡包埋肿瘤组织块 | 临床病理档案库 | N/A | 非小细胞肺癌肿瘤样本 |
| 四色T细胞亚群检测试剂（CD3/CD4/CD8/CD45） | BD Biosciences | 340499 | 用于淋巴细胞亚群检测 |
| 苏木精染液 | Sigma-Aldrich | H3136 | 细胞核复染 |
| HRP检测试剂盒 | Dako (Agilent) | K5007 | 二抗检测系统 |
| Ki-67一抗（克隆号MIB-1） | Abcam | ab16667 | 免疫组织化学检测 |
| 切片机 | Leica Microsystems | RM2235 | 切割4  m FFPE切片 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | 细胞洗涤与重悬 |
| 正电荷载玻片 | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | 组织切片贴附 |
| 红细胞裂解液 | BD Biosciences | 349202 | 流式细胞术前红细胞裂解 |
| 统计分析软件 | IBM | SPSS v26.0 | 数据分析 |
参考文献
- Chen, Z., et al. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases. Nat. Rev. Cancer. 14 (8), 535-546 (2014).
- Kotecha, J., et al. Evaluating the delay prior to primary care presentation in patients with lung cancer: a coho....
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